趙麗娜 籍學(xué)偉 王玉華

【摘 要】 目的：建立蒙成藥小兒清肺八味丸的質(zhì)量控制方法。方法：采用薄層色譜法對(duì)小兒清肺八味丸中紅花、麥冬、拳參、人工牛黃、胡黃連進(jìn)行定性鑒別;采用高效液相色譜法測(cè)定胡黃連中胡黃連苷Ⅰ和胡黃連苷Ⅱ的含量。結(jié)果：薄層鑒別方法專屬性強(qiáng)，特征斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無干擾;胡黃連苷Ⅰ在3.8～76μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系（r=0.9999），平均回收率為99.71%，RSD為1.03%;胡黃連苷Ⅱ在8.4～168μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系（r=0.9999），平均回收率為103.30%，RSD為1.95%。結(jié)論：所建立的定性、定量分析方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高，可用于小兒清肺八味丸的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 小兒清肺八味丸;薄層色譜法;高效液相色譜法

【中圖分類號(hào)】R917 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2020）3-0027-06

Abstract：Objective To establish the quality control method of Xiaoer Qingfei Bawei Pills.Methods Carthami flos、Ophiopogonis radix、Bistortae rhizoma、Bovis calculus artifactus and Picrorhizae rhizoma in Xiaoer Qingfei Bawei Pills were identified by TLC.The contents of Picroside Ⅰ and Picroside Ⅱ in Picrorhizae rhizoma were determined by HPLC.Results The identification method was exclusive.The TLC spots were fairly clear，and the blank test showed no interference.The picroside Ⅰ showed a good linearity in the range of 3.8～76μg/mL（r=0.9999）.The average recovery was 99.71%，and RSD was 1.03%.The Picroside Ⅱ showed a good linearity in the range of 8.4～168μg/mL（r=0.9999）.The average recovery was 103.30%，and RSD was 1.95%.Conclusion The established qualitative and quantitative methods are simple、accurate and sensitive， which can be used in the quality control of Xiaoer Qingfei Bawei Pills.

Keywords：Xiaoer Qingfei Bawei Pills;TLC;HPLC

蒙成藥小兒清肺八味丸（蒙名：胡勒森竹崗-8）收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》蒙藥分冊(cè)第63頁[1]，是蒙醫(yī)常用兒科用藥，由天竺黃、北沙參、紅花、胡黃連、牛黃、拳參、檀香、麥冬八味藥材制成，具有清肺熱、止咳定喘的功效，用于小兒肺熱、發(fā)燒、咳嗽、氣促、瘟疫熱盛等癥。小兒清肺八味丸現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只收載了【性狀】及【檢查】項(xiàng)，無【鑒別】和【含量測(cè)定】項(xiàng)，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)水平低且不完善。為提高現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，該實(shí)驗(yàn)采用TLC法和HPLC法分別對(duì)小兒清肺八味丸薄層色譜鑒別方法和含量測(cè)定方法進(jìn)行研究，并建立紅花、麥冬[2]、拳參、人工牛黃、胡黃連[3]等五味藥材的薄層鑒別方法及高效液相色譜測(cè)定胡黃連化學(xué)成分的含量測(cè)定方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 戴安U-3000型高效液相色譜儀（美國(guó)戴安公司）;TLC Visualizer薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（杭州漢澤科技有限公司）;KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;Mettler AE-100型電子天平（萬分之一，梅特勒-托利多儀器有限公司）;Sartorius ME 5型電子天平（百萬分之一，賽多利斯貿(mào)易有限公司）;DHG-9145A型鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑 小兒清肺八味丸（烏蘭浩特中蒙制藥有限公司（A公司），批號(hào)：160814、160815、160816，規(guī)格：2g /10粒;180403，規(guī)格：1g /25粒;內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司（B公司），批號(hào)：1608041、1608042、1608043、1712001，規(guī)格：1g /25粒;內(nèi)蒙古庫倫蒙藥有限公司（C公司），批號(hào)：1609071、1609072、1609073、180316，規(guī)格：1g /25粒）。

紅花對(duì)照藥材，批號(hào)：120907-201412;麥冬對(duì)照藥材，批號(hào)：121013-201310;沒食子酸對(duì)照品，批號(hào)：110831-201605;豬去氧膽酸對(duì)照品，批號(hào)：100087-201411;膽酸對(duì)照品，批號(hào)：100078-201415;胡黃連苷Ⅰ對(duì)照品，批號(hào)：111727-201702，含量：95.6%;胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌?，批?hào)：111596-201805，含量：93.2%。上述對(duì)照藥材及對(duì)照品均來自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院。

硅膠G、H、GF254、HSG薄層板（煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所、青島海洋化工廠）;德國(guó)Merck薄層層析硅膠粉H型（德國(guó)默克公司）;甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 紅花 取本品粉末2g，加80%丙酮10mL，密塞，振搖15min，濾過，濾液作為供試品溶液。取紅花對(duì)照藥材約0.5g，同法制成對(duì)照藥材溶液。另取除紅花藥材外其他七味藥材粉末，按處方比例混合均勻，稱取約1.7g，同法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015版通則0502）[4]試驗(yàn)，吸取供試品溶液、紅花對(duì)照藥材溶液以及陰性對(duì)照溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇（7∶[KG-*3/5]2∶[KG-*3/5]3∶[KG-*3/5]0.4）為展開劑[5-6]，展開，展距為12cm，取出薄層板，晾干。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定沒有干擾。薄層層析圖譜如圖1所示。

2.1.2 麥冬 取本品粉末2.5g，加水30mL，再加鹽酸2mL，加熱回流1h，冷卻，濾過，濾液分別用30mL三氯甲烷振搖提取2次，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄?mL使溶解，作為供試品溶液。取麥冬對(duì)照藥材0.5g，同法制成對(duì)照藥材溶液。另取除麥冬藥材外其他七味藥材粉末，按處方比例混合均勻，稱取約2g，同法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015版通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液與陰性對(duì)照溶液各8μL，麥冬對(duì)照藥材溶液5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮（4∶[KG-*3/5]1）為展開劑[7]，展開，展距為12cm，取出薄層板，晾干，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，均勻噴于薄層板，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，在自然光下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定沒有干擾。薄層層析圖譜如圖2所示。

2.1.3 拳參 取本品粉末5g，加甲醇20mL，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。取沒食子酸對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度為1mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取除拳參藥材外其他七味藥材粉末，按處方比例混合均勻，稱取約5g，同法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015版通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液與陰性對(duì)照溶液各8μL、沒食子酸對(duì)照品溶液5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠HSG薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（5∶[KG-*3/5]4∶[KG-*3/5]1）為展開劑[8]，上行展開約12cm，取出薄層板，揮干溶劑后置氨蒸氣中熏至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的清晰斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定沒有干擾。薄層層析圖譜如圖3所示。

2.1.4 人工牛黃 取本品粉末1.5g，加甲醇10mL，超聲處理20min，搖勻，濾過，取濾液作為供試品溶液。取豬去氧膽酸對(duì)照品，加甲醇制成濃度為1mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取除人工牛黃藥材外其他七味藥材粉末，按處方比例混合均勻，稱取約1.5g，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015版通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液與陰性對(duì)照溶液各8μL，豬去氧膽酸對(duì)照品溶液2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-醋酸-甲醇（20∶25∶2∶3）上層溶液為展開劑[9-10]，展開，展距為12cm，取出薄層板，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，待乙醇揮干后，置于烘箱中105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定沒有干擾。薄層層析圖譜如圖4。

2.1.5 胡黃連 取小兒清肺八味丸約10g，加甲醇10mL，超聲處理20min，濾過，濾液作為供試品溶液。取胡黃連苷Ⅰ對(duì)照品、胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌愤m量，分別加甲醇制成濃度為1mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取除胡黃連藥材外其他七味藥材粉末，按處方比例混合均勻，稱取約10g，按上述供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015版通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液、胡黃連苷Ⅰ對(duì)照品、胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌?、陰性?duì)照溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以水飽和乙酸乙酯為展開劑[11]，展開，展距為12cm，取出，晾干，再以氯仿-甲醇-乙酸乙酯-甲酸（7∶[KG-*3/5]3∶[KG-*3/5]5∶[KG-*3/5]0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，置254nm紫外光燈下檢視。結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定沒有干擾。薄層層析圖譜如圖5所示。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（250mm×4.6mm， 5μm）;流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸水溶液（31∶[KG-*3/5]69）;流速∶[KG-*3/5]1.0mL/min;柱溫：30℃;進(jìn)樣量：10μL;檢測(cè)波長(zhǎng)：275nm。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取胡黃連苷I對(duì)照品、胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌愤m量，精密稱定，加30%乙醇，制成濃度分別為38μg/mL、84μg/mL的胡黃連苷I和胡黃連苷Ⅱ混合對(duì)照品溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱定小兒清肺八味丸粉末2g ，于具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇25mL ，密塞，稱定重量，超聲處理（功率500W，頻率40kHz）40min，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，取續(xù)濾液，過微孔濾膜（0.45μm），即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例，制備不含胡黃連的陰性樣品，再照“2.2.3”項(xiàng)下操作制備陰性對(duì)照溶液，即得。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣并記錄色譜圖。供試品呈現(xiàn)與對(duì)照品保留時(shí)間相同的色譜峰，陰性對(duì)照無干擾。色譜圖如圖6所示。

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密稱取胡黃連苷I對(duì)照品和胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌愤m量，置50mL量瓶中，加入30%乙醇制成胡黃連苷I和胡黃連苷Ⅱ濃度分別為76μg/mL和168μg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取上述儲(chǔ)備液0.5、1.5、2.5、5、7.5、10mL，置10mL量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得胡黃連苷I 、胡黃連苷Ⅱ回歸方程分別為Y=262.65X+0.030（r=0.9999）、Y=121.76X+0.025（r=0.9999）。結(jié)果表明，胡黃連苷I（3.8～76μg/mL）和胡黃連苷Ⅱ（8.4～168μg/mL）均在對(duì)應(yīng)濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號(hào)1609071），分別于室溫下0、6、10、18、24h測(cè)定含量以考察溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)得胡黃連苷I峰面積RSD=0.88%，測(cè)得胡黃連苷Ⅱ峰面積RSD=0.19%。表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號(hào)1609071），連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)得6次進(jìn)樣的峰面積積分值。結(jié)果顯示，胡黃連苷I峰面積RSD=0.60%（n=6），胡黃連苷Ⅱ峰面積RSD=0.50%（n=6）。表明儀器精密度好。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品（批號(hào)1609071）6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1” 的色譜條件進(jìn)樣并記錄色譜圖。分別計(jì)算胡黃連苷I和胡黃連苷Ⅱ含量。結(jié)果顯示，胡黃連苷I平均含量為0.38mg/g，RSD為1.06%（n=6）;胡黃連苷Ⅱ的平均含量為0.82mg/g，RSD為0.70%（n=6）。表明方法重復(fù)性好。

2.2.10 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量供試品（批號(hào)1609071）9份，每份約1g，分別加入一定量的胡黃連苷I和胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌焚A備液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1” 的色譜條件進(jìn)樣并記錄色譜圖。計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.2.11 供試品測(cè)定 取12批供試品各約2g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1 色譜條件”進(jìn)樣并記錄色譜圖。計(jì)算胡黃連苷I和胡黃連苷Ⅱ的含量。結(jié)果見表2。

2.2.12 含量限度的制定 采用HPLC法對(duì)12批供試品及3批胡黃連藥材進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果胡黃連苷Ⅰ與胡黃連苷Ⅱ的平均轉(zhuǎn)移率47.51%，由于不同產(chǎn)地胡黃連的胡黃連苷Ⅰ與胡黃連苷Ⅱ含量有所不同，參考《中國(guó)藥典》2015年版一部“胡黃連”項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定，確定本品每1g含胡黃連苷Ⅰ與胡黃連苷Ⅱ的總量不得少于0.078%。今后可進(jìn)一步研究積累相關(guān)數(shù)據(jù)再作調(diào)整。

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別 在紅花的薄層鑒別中，相比青島海洋化工廠硅膠H板，煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所H板斑點(diǎn)清晰、分離度好、Rf值適中;分析原因可能是不同生產(chǎn)企業(yè)所用的硅膠質(zhì)量有差別。為驗(yàn)證方法的耐用性，增加人工手鋪薄層板對(duì)照試驗(yàn)。結(jié)果顯示，其與煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所H板的效果一致。

參照《中國(guó)藥典》2015年版“人工牛黃”鑒別項(xiàng)下以膽酸、豬去氧膽酸對(duì)照品為指標(biāo)建立小兒清肺八味丸中人工牛黃的薄層色譜鑒別方法。結(jié)果在與膽酸對(duì)照品相應(yīng)的位置上，陰性有干擾，在與豬去氧膽酸對(duì)照品相應(yīng)位置上，陰性無干擾。因此本次試驗(yàn)僅建立以豬去氧膽酸為對(duì)照品的薄層色譜鑒別方法。

經(jīng)查閱文獻(xiàn)，天竺黃的主要化學(xué)成分為硅酸鹽、無機(jī)元素及氨基酸[12-13]，參照《中國(guó)藥典》2015年版一部“天竺黃”鑒別項(xiàng)下以亮氨酸、丙氨酸為對(duì)照品，對(duì)小兒清肺八味丸進(jìn)行薄層色譜鑒別研究[7]，結(jié)果陰性對(duì)照有干擾，方法專屬性不強(qiáng)，需要進(jìn)一步研究。

此外，上述5個(gè)薄層色譜鑒別方法均對(duì)不同溫度（3.5℃、4.1℃、 2.2℃、4.5℃、3.5℃）、濕度（68%、70%、66%、74%、72%）條件進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示建立的薄層色譜鑒別方法耐用性良好。

3.2 色譜條件選擇 參照《中國(guó)藥典》2015年版一部“胡黃連”項(xiàng)下的含量測(cè)定方法[7]，以甲醇-水-磷酸溶液（35∶[KG-*3/5]65∶[KG-*3/5]0.1）為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示，色譜峰分離度較差且胡黃連苷Ⅰ色譜峰有拖尾現(xiàn)象。經(jīng)試驗(yàn)摸索將流動(dòng)相調(diào)整為甲醇-0.2%磷酸溶液（31∶[KG-*3/5]69）時(shí)，色譜峰分離度達(dá)到要求、拖尾現(xiàn)象改善、出峰時(shí)間適中、峰型較好[14]。

3.3 提取條件選擇 胡黃連中胡黃連苷I和胡黃連苷Ⅱ是環(huán)烯醚萜類化合物，易溶于水和甲醇，可溶于乙醇、丙酮和正丁醇等[15]。因此試驗(yàn)分別比較了水、甲醇、30%乙醇、70%乙醇、乙醇的提取效果。結(jié)果表明，30%乙醇提取效果最佳，峰型最好;試驗(yàn)對(duì)回流提取和超聲提取進(jìn)行了比較[16]。結(jié)果表明，回流提取與超聲提取效率相似?？紤]到方法的簡(jiǎn)便易行，確定采用超聲提取方法;試驗(yàn)對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，超聲提取40min供試品中胡黃連苷Ⅰ和胡黃連苷Ⅱ的含量基本穩(wěn)定不變，故將超聲提取時(shí)間定為40min。

該實(shí)驗(yàn)為小兒清肺八味丸提供了科學(xué)、可靠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確保了用藥的安全、有效。

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