楊柳　黃長江　王名雪

摘要：癌癥的基因治療是利用載體通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因轉(zhuǎn)入病患體內(nèi)，以沉默致病基因、修改突變基因、抑制癌細(xì)胞生長、提高癌癥藥敏性等手段治療癌癥患者。本文對目前癌癥基因治療最常用的五種技術(shù)，即自殺基因療法、基因沉默療法、抑癌基因療法、免疫系統(tǒng)療法和抗血管生成基因療法進(jìn)行綜述，并分析基因治療的應(yīng)用價值和目前存在的安全性問題，以期對相關(guān)研究提供一定的參考。

關(guān)鍵詞：基因治療;癌癥;自殺基因;基因沉默;抑癌基因;免疫療法;抗血管生成

中圖分類號：R730.59? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.03.001

文章編號：1006-1959（2020）03-0001-05

Advances in Gene Therapy for Cancer

YANG Liu，HUANG Chang-jiang，WANG Ming-xue

（Yantai Maibairui International Biomedicine Co.，Ltd.，Yantai 264006，Shandong，China）

Abstract：Gene therapy for cancer is the use of vectors to transfer foreign genes into patients through transgenic technology， and to silence cancer-causing genes， modify mutant genes， inhibit cancer cell growth， and improve cancer drug sensitivity. This article reviews the five most commonly used techniques for cancer gene therapy， namely suicide gene therapy， gene silencing therapy， tumor suppressor gene therapy， immune system therapy， and anti-angiogenic gene therapy，and security issues in order to provide some reference for related research.

Key words：Gene therapy;Cancer;Suicide gene;Gene silencing;Tumor suppressor gene;Immunotherapy;Anti-angiogenesis

自20世紀(jì)70年代以來，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，各種基因編輯技術(shù)不斷發(fā)展，疾病的基因治療也逐漸被提出。癌癥是目前最難攻克的頑疾之一，傳統(tǒng)的病灶切除、化學(xué)療法、放射療法，不僅治療效果有限，而且對患者身體的副作用極大，而基因治療是一種新的治療手段，以其特異性高、針對性強、副作用少等優(yōu)點，備受學(xué)者們的關(guān)注。本文現(xiàn)就自殺基因療法、基因沉默治療、抑癌基因治療、免疫系統(tǒng)療法和抗血管生成基因治療[1]等目前基因治療的主要手段進(jìn)行綜述。

1自殺基因

癌癥的自殺基因治療是利用病毒或非病毒載體，將不存在于哺乳動物中的一些細(xì)菌或病毒中攜帶的藥物敏感酶的基因轉(zhuǎn)入癌癥靶細(xì)胞中，并使其在癌癥靶細(xì)胞中表達(dá)，合成藥物敏感酶，該酶可催化無毒或微毒的藥物前體轉(zhuǎn)化成對細(xì)胞具有毒性的藥物，從而殺死攜帶該基因的受體細(xì)胞，達(dá)到治療癌癥的目的。目前，自殺基因治療系統(tǒng)有很多，如單純皰疹病毒胸苷激酶基因系統(tǒng)（herpes simplex virus type 1 thymidine kinase，HSV-TK）、大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶基因系統(tǒng)（escherichia coli cytosine deaminase，CD）、大腸桿菌嘌呤苷酸磷酸化酶基因系統(tǒng)（purine nucleoside phosphorylase，PNP）、大腸桿菌硝酸還原酶基因系統(tǒng)（escherichia coli nitroreductase）、羧肽酶A羧肽酶G2基因系統(tǒng)（carboxypeptidase A carboxypeptidase G2）和辣根過氧化物酶基因系統(tǒng)（horseradish peroxidase）等，但被研究和應(yīng)用最多的自殺基因治療系統(tǒng)是：HSV-TK和CD[2]。

近幾年，HSV-TK和CD基因系統(tǒng)被不斷改善和研究。Shao D等[3]報道了一種基于量子點的技術(shù)，通過構(gòu)建近紅外熒光量子點（QDs）和TK基因之間的共價連接來揭示HSV-TK/GCV自殺基因治療的過程。這種穩(wěn)定的QDs標(biāo)記不影響QDs熒光及TK基因的生物活性，實現(xiàn)了TK基因在體內(nèi)外抗癌癥過程中，實時動態(tài)的可視化追蹤。Lee M等[4]利用逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制載體，構(gòu)建了一個含有兩個自殺基因的TK-CD系統(tǒng)，對7個膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者進(jìn)行臨床試驗，以檢驗?zāi)孓D(zhuǎn)錄病毒復(fù)制載體構(gòu)建的自殺基因系統(tǒng)的傳遞效率和抗癌作用。通過流式細(xì)胞和高含量分析顯示，在癌細(xì)胞組織中，治療基因的傳遞與前藥更昔洛韋（ganciclovir）和5-氟胞嘧啶的易感性之間存在廣泛的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和良好的相關(guān)性。自殺基因系統(tǒng)與前藥協(xié)同抑制癌細(xì)胞增殖和血管生成，同時增加原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤異種移植物的凋亡。Gwak SJ等[5]開發(fā)了一種聚丙交酯-乙交酯接枝聚乙烯亞胺（PgP）的陽離子雙親共聚物為自殺基因系統(tǒng)的載體，并在細(xì)胞和動物模型中證明了其作為藥物和基因載體的功效。

2016年7月，歐洲藥品管理局（EMA）批準(zhǔn)了首個“自殺基因”療法Zalmoxis。該療法通過向供者移植物中分離得到的T細(xì)胞導(dǎo)入可被誘導(dǎo)的“自殺基因”——HSV-TK基因，使得人們可以隨時使用更昔洛韋藥物殺死引起不良免疫反應(yīng)的T細(xì)胞，以防止移植物抗宿主反應(yīng)的惡化。

2基因沉默

基因沉默又稱RNA干擾技術(shù)，是指內(nèi)源或外源的dsRNA通過轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)座子或病毒感染等方式進(jìn)入受體細(xì)胞，引起靶細(xì)胞特異性的基因沉默。一般在3種水平上實現(xiàn)基因的特異性沉默，即轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平。理論上，通過siRNA的適當(dāng)設(shè)計，可以使用該技術(shù)沉默體內(nèi)的任何基因，在癌癥以及其他疾病的治療（如乙型肝炎病毒、人乳頭狀瘤病毒、高膽固醇血癥和肝硬化）方面提供更大的治療潛力[6，7]。Pang W等[8]就通過設(shè)計siRNA，研究mir-628基因的表達(dá)與胃癌發(fā)生的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)mir-628沉默后，其低表達(dá)與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度及TNM分期密切相關(guān)。

由于siRNA不與染色體DNA相互作用，具有較低的誘導(dǎo)靶細(xì)胞基因改變或突變的風(fēng)險，且siRNA對靶基因高度特異，毒性低，不誘導(dǎo)多藥耐藥等優(yōu)點較突出。siRNA可以誘導(dǎo)許多癌癥相關(guān)的基因沉默，導(dǎo)致腫瘤消退，但不能清除異?；騕9]。siRNA療法可以直接應(yīng)用于癌癥組織，但是無法全身給藥。因為裸siRNA蛋白容易被酶降解、腎濾過和宿主細(xì)胞吞噬等作用而清除?，F(xiàn)已開發(fā)出幾種siRNA輸送系統(tǒng)來保護(hù)它們免受酶降解，并促進(jìn)它們對靶基因的沉默作用。其中針對惡性黑色素瘤的藥物CALAA-01（calando pharmaceuticals）[10]和針對肝癌和實體瘤的ALN-VSPOI（alnylam Pharmaceuticals）即目前臨床試驗中比較受關(guān)注的siRNA輸送系? ?統(tǒng)[11]。然而，由于毒性相對較高和轉(zhuǎn)染效率較低，成功率非常有限[6，12]。

近年來，除了RNA干擾技術(shù)外，利用表觀遺傳學(xué)治療癌癥也頗受各界研究者們的關(guān)注，科研者和臨床醫(yī)生研究出多種甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙酰化酶抑制劑，將為某些癌癥提供替代治療。表觀遺傳抑制劑可單獨或與其他治療藥物聯(lián)合作用于抑癌基因的重新激活并抑制癌細(xì)胞生長[13]。廣泛的DNA甲基化是多種惡性腫瘤的重要標(biāo)志，因此，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTS）抑制劑被證明是有希望成為靶向表觀遺傳密碼的藥物。目前已有5-Azacitidine和Decitabine是兩種長期以來被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于治療血液病的DNMTS抑制劑等較多表觀遺傳抑制劑被批準(zhǔn)用于癌癥治療[14]。

3抑癌基因

某種基因在某些細(xì)胞組織中正常表達(dá)，但在該細(xì)胞組織病變的惡性癌癥組織中，該基因突變致使功能喪失或表達(dá)缺失，若經(jīng)載體將該基因的野生型轉(zhuǎn)入相對應(yīng)的惡性癌癥組織中，癌癥細(xì)胞將大部分或全部消亡，這種基因則被稱之為抑癌基因[15]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的抑癌基因有20多種，包括APC、ATM、ARID1A、p53、PTEN和FHIT等。目前基因替代療法也是一種重要的癌癥基因治療手段，即利用載體將正常的抑癌基因轉(zhuǎn)入癌變靶細(xì)胞內(nèi)，替代突變的抑癌基因，使癌癥細(xì)胞恢復(fù)正常。

p53基因自發(fā)現(xiàn)以來，一直都是備受關(guān)注的熱點抑癌基因。它位于17號染色體上，有11個外顯子和10個內(nèi)含子[16]。人類的癌癥中近一半是由于p53基因錯義突變引起的，而這個突變相當(dāng)微小，僅僅是因為肽鏈上的393個氨基酸中的一個被替換，但大多是中心DNA結(jié)合區(qū)域的氨基酸被替換才會引發(fā)細(xì)胞癌變。目前科學(xué)家已鑒定出一些熱點氨基酸替換位置，包括R175、G245、R248、R249、R273和R282等[17]。在卵巢癌的細(xì)胞組織中有很高比例的p53功能喪失。在臨床前研究中，野生型p53的轉(zhuǎn)導(dǎo)可抑制癌癥增殖[18]，并增加對順鉑[19]和PTX[20]的敏感性。此外，有研究顯示[21]，p53的腺病毒感染是激活癌細(xì)胞凋亡并使耐藥的卵巢癌癥細(xì)胞對紫杉醇（PTX）重新敏感的有效方法，該反應(yīng)由p53上調(diào)的凋亡調(diào)節(jié)劑介導(dǎo)，該調(diào)節(jié)劑是p53的直接下游促凋亡效應(yīng)物。近些年為提高基因治療的效率和靶向性，各種載體被開發(fā)和研究。Lin JT等[22]以酰胺化的人免疫缺陷病毒-1轉(zhuǎn)錄反式激活因子（TAT）修飾的殼聚糖接枝的多聚N-3-羧芐氧基-賴氨酸（CCL）為載體，它可同時將p53和阿霉素共導(dǎo)入細(xì)胞核，發(fā)揮其抗腫瘤作用，相比于傳統(tǒng)載體，其具有更高的基因轉(zhuǎn)染率和藥物傳遞效率。

PTEN基因是自p53基因后最受關(guān)注的抑癌基因，位于10號染色體上，有9個外顯子和8個內(nèi)含子，其表達(dá)蛋白具有磷酸酶活性，參與細(xì)胞的增殖、遷移、入侵，以及細(xì)胞生長周期的調(diào)節(jié)，影響DNA的損傷修復(fù)等[23]。PTEN基因與人類胃癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌等許多癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，研究者們在多種癌癥細(xì)胞組織中均觀察到了PTEN基因的變異[24]。Wu H等[25]用外源性PTEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞系，提高了細(xì)胞組織中PTEN基因的表達(dá)量，導(dǎo)致在細(xì)胞周期的G1期，癌細(xì)胞停止生長并凋亡，顯著得消滅了大量癌細(xì)胞。這可能是由于PI3K/AKT通路的抑制，以及通過降低MMP-9的表達(dá)從而減少癌細(xì)胞遷移和侵襲。研究表明PTEN和p53基因間還有著密切的聯(lián)系，p53基因能直接調(diào)控PTEN基因的轉(zhuǎn)錄，結(jié)合在PTEN基因的序列上游，激活其轉(zhuǎn)錄，并使表達(dá)水平上調(diào)[26]。

目前，針對抑癌基因治療應(yīng)用最多的療法就是溶瘤病毒治療。2005年安柯瑞/Oncorine（重組人5型腺病毒注射液）通過國家食品藥品監(jiān)督管理局審批，成為了全球首個獲批上市的溶瘤腺病毒藥物。2015年10月，Imlygic通過FDA審批，成為首款在美國上市的溶瘤病毒基因療法。Imlygic是一種經(jīng)過基因改造的溶瘤病毒，改造中去掉了兩個基因，增加了GM-CFS基因，適用于治療不能經(jīng)手術(shù)完全切除的黑色素瘤。

4免疫療法

免疫系統(tǒng)是癌癥消亡或蔓延的關(guān)鍵因素，癌癥的免疫治療可分為四大類[27]：主動免疫療法、被動免疫療法、過繼免疫療法和免疫增強療法。免疫療法可包括上述一種或多種方法作為獨特的免疫療法治療，或與其他癌癥療法相結(jié)合。

主動免疫療法是直接使宿主免疫系統(tǒng)對癌癥抗原產(chǎn)生高度特異性的敏感，例如癌癥疫苗。Wolff JA等[28]用含有外源轉(zhuǎn)錄因子的抗原構(gòu)建DNA質(zhì)粒，作為一種癌癥疫苗。將其轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄成肽鏈或蛋白質(zhì)，并誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。與病毒或細(xì)菌載體相比，該技術(shù)被認(rèn)為是相對安全的，不會引起感染或自身免疫紊亂，并且易于商業(yè)開發(fā)和生產(chǎn)[29]。然而，其有效性隨著時間的推移而減弱，因此，需要經(jīng)常加強免疫接種。目前，單抗原質(zhì)粒疫苗的例子有很多，包括治療前列腺癌的前列腺酸性磷酸酶蛋白[30]、人表皮生長因子受體-2（HER-2/neu）、治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的皮內(nèi)低劑量GM-CSF原癌基因[31]和改良的癌胚抗原基因與一種破傷風(fēng)類毒素融合，用以治療結(jié)直腸癌[32]。盡管單抗原質(zhì)粒疫苗的治療耐受性很好，但反應(yīng)小且有效性短暫。因而，科研者現(xiàn)在大都使用多抗原質(zhì)?；呙?，可產(chǎn)生廣泛的特異性、持久性和多功能免疫刺激[33]。

被動免疫療法是利用人源化或嵌合抗體特異性靶向癌癥抗原，而不直接激活宿主免疫系統(tǒng)，例如FDA批準(zhǔn)的幾種抗惡性癌癥的抗體藥物，包括治療乳腺癌的曲妥珠單抗[34]、治療惰性淋巴瘤的利妥昔單抗[35]、治療肺癌的西妥昔單抗[36]和治療各種實體瘤的貝伐單抗[37]等。近幾年，新型抗體偶聯(lián)藥物ADC（antibody-drug conjugate）橫空出世，成為現(xiàn)今抗體藥物研發(fā)的前沿領(lǐng)域，其由單克隆抗體和強效毒性藥物偶聯(lián)而成，是一種融合了小分子藥物毒性和抗體靶向作用的強效抗癌藥物[38]。目前已上市的ADC藥物一共有四種，包括2011年Seattle Genetics和Millennium公司共同開發(fā)的治療霍奇金淋巴瘤的Adcetris;2013年Genentech和ImmunoGen公司研制的治療HER-2陽性晚期乳腺癌的Kadcyla;2017年輝瑞公司開發(fā)的，分別治療急性骨髓性白血病和急性淋巴細(xì)胞白血病的Mylotarg和Besponsa。

過繼免疫療法則是利用患者的免疫細(xì)胞，無論是T細(xì)胞還是樹突狀細(xì)胞，使其在體外受到刺激或操縱，然后注入回體內(nèi)，以更好地對抗癌癥抗原。Hinrichs CS等[39]在對人乳頭狀癌癥病毒（HPV）誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者的研究中，收集了癌癥浸潤的T淋巴細(xì)胞，再將其輸入患者體內(nèi)。研究者隨后從患者體內(nèi)檢測出其白細(xì)胞介素-2的表達(dá)量升高，并有一半患者體內(nèi)的癌癥體積減小，其中有兩名患者在治療18個月和11個月后癌癥完全消退，且機體基本沒有產(chǎn)生副作用。2017年8月，Kymriah通過FDA審批，成為全球首個獲批上市的CAR-T細(xì)胞治療藥物。該療法通過提取、改造和強化患者自己的免疫細(xì)胞來達(dá)到抗癌效果。上市時FDA批準(zhǔn)適應(yīng)癥為治療罹患B細(xì)胞前體急性淋巴性白血?。ˋLL），且病情難治，或出現(xiàn)二次及以上復(fù)發(fā)的25歲以下患者。2018年5月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了Kymriah第2項適應(yīng)證，治療復(fù)發(fā)或難治性大B細(xì)胞淋巴瘤的成人患者。

免疫增強療法在近幾年也成為大眾關(guān)注的熱點，其旨在增強共刺激分子或阻斷抑制分子，利用人體的免疫系統(tǒng)消滅癌細(xì)胞，其中PD-1/PD-L1免疫靶點抑制劑的開發(fā)和應(yīng)用取得了較好的成績[40]。由再生元（Regeneron）開發(fā)的塞普利單抗于2018年9月28日獲FDA批準(zhǔn)上市，后于2019年6月28日獲歐洲藥物管理局（EMA）批準(zhǔn)上市，用于治療轉(zhuǎn)移性皮膚鱗狀細(xì)胞癌（CSCC）或不能接受治愈性手術(shù)或放療的局部晚期CSCC患者。塞普利單抗是一種靶向于PD-1的全人源單克隆抗體，通過阻斷PD-1和PD-L1的結(jié)合阻斷T細(xì)胞失活[41]，增強免疫系統(tǒng)的抗腫瘤反應(yīng)，是FDA批準(zhǔn)的第一例針對晚期CSCC的療法，同時也是第三款獲得FDA批準(zhǔn)的抗PD-1抗體。

5抗血管生成基因治療

在癌癥組織中，促血管生長因子和抗血管生長因子之間的平衡被打破，血管生成能力增強，利于癌癥細(xì)胞的生長和增殖?？寡苌莎煼ǔ晒Φ年P(guān)鍵在于使癌癥細(xì)胞中的抑制劑長期維持在最佳水平，因此基因治療是實現(xiàn)這一目標(biāo)的最好策略。

血管生成受血管內(nèi)皮生長因子及其酪氨酸激酶受體（VEGFR-1/FTL-1、VEGFR-2、VEGFR-3/FTL-4）和血管生成素生長因子及其受體（Tie1和Tie2）的調(diào)節(jié)，無論是單藥治療還是聯(lián)合治療，這一通路已成為多方研究的目標(biāo)[42]。一些抗VEGFR酪氨酸激酶抑制劑的小分子如雷戈拉非尼、法米替尼、阿昔替尼和阿帕蒂尼等已被證明是治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（MCRC）的有效藥物。Fruquintinib是一種新型口服抗VEGFR酪氨酸激酶抑制劑，由和記黃埔醫(yī)藥公司開發(fā)，是一種高效、高選擇性的VEGFR-1、-2和-3小分子抑制劑，同時它也顯示出可接受的安全性和耐受性。根據(jù)多次試驗的數(shù)據(jù)，2018年，中國食品藥品監(jiān)督管理局（CFDA）批準(zhǔn)Fruquintinib用于治療至少接受過兩次標(biāo)準(zhǔn)抗癌治療的MCRC患者[43]。2012年，報道了以腺病毒為載體，釋放的可溶性誘餌VEGF（-1，-2和-3，不含酪氨酸激酶的部分）的抗血管生成基因治療，并通過小鼠模型癌癥實驗，闡明了聯(lián)合基因治療比單基因治療具有更強的抗癌癥作用[44]。此外，如果將PTX添加到聯(lián)合基因治療中，實驗?zāi)Ｐ痛笫蟮拇婊盥蕦⑸遊45]。

6總結(jié)及展望

根據(jù)《The Journal of Gene Medicine》雜志的臨床試驗站點（http：//www.abedia.com/wiley/indications.php）統(tǒng)計，自1989年到2018年12月共有1951個癌癥基因治療臨床試驗，占該注冊中心匯編的基因治療臨床試驗總數(shù)的66.6%。臨床試驗已經(jīng)探索了多種癌癥基因治療手段的可行性和有效性，包括免疫治療、自殺基因和溶瘤病毒治療等。迄今為止，臨床試驗登記處共有69701項癌癥相關(guān)試驗，其中有約57%的臨床試驗項目涉及基因治療。

隨著二代測序、基因編輯等多種生物技術(shù)的涌現(xiàn)，基因治療愈發(fā)成熟和完善。目前的癌癥基因治療遵循生物學(xué)“基因-細(xì)胞-個體”的基本研究方法，針對致病基因、癌變細(xì)胞和癌細(xì)胞微環(huán)境三方面，分別進(jìn)行基因的敲除、沉默和替換等改造;免疫細(xì)胞模型的改構(gòu)與建立;抗癌細(xì)胞血管生成、導(dǎo)入細(xì)胞因子以提高免疫應(yīng)答等。無論是最早的自殺基因療法還是最近的生物創(chuàng)新藥物ADC都在癌癥治療領(lǐng)域取得了較好的成績。但另一方面，癌癥致病基因的多樣性、發(fā)病機制的復(fù)雜性以及個體先天的差異性，導(dǎo)致癌癥的基因治療在臨床試驗和實際治療中應(yīng)用較困難，往往需要聯(lián)合用藥才會有所成效。探索和研究癌癥的多種靶點也一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和科研工作者致力的方向。在安全性方面，目前基因治療中病毒載體的使用飽受爭議，病毒載體雖然高效、易于整合到宿主細(xì)胞，但病毒其自身的感染性和寄生性也需重點關(guān)注，且脫靶問題一直是基因治療的難關(guān)，若插入片段隨機整合到宿主細(xì)胞，則突變引起的病變將不可預(yù)計。

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收稿日期：2019-10-22;修回日期：2019-11-20

編輯/肖婷婷