楊登科 郭奕妤 秦建平 徐杰 黃蘭蘭 陸毓 吳潔

【摘?要】?目的：研究加味凈屑飲對咪喹莫特誘導的銀屑病小鼠模型的治療作用及IL-17產(chǎn)生的影響。方法：通過咪喹莫特誘導銀屑病樣的小鼠模型，隨機分為模型組、陽性藥物及加味凈屑飲低劑量組（3g/kg）、加味凈屑飲中劑量組（6g/kg）、加味凈屑飲高劑量組（12g/kg）組，另設空白對照組;游標卡尺檢測左耳厚度;HE染色檢測銀屑病樣皮損炎癥狀況。ELISA法測定模型小鼠血清Th17細胞細胞因子（IL-17）的表達水平。結果：加味凈屑飲高劑量藥物干預顯著降低咪喹莫特誘導的模型小鼠左耳厚度（P<0.01），減少左耳炎癥細胞的浸潤，降低咪喹莫特誘導的模型小鼠血清IL-17的表達水平（P<0.05）。結論：加味凈屑飲對咪喹莫特誘導的銀屑病小鼠模型有較好的治療作用，其機制可能與抑制IL-17的產(chǎn)生有關。

【關鍵詞】?銀屑病;加味凈屑飲;Th17細胞;IL-17

【中圖分類號】R285.6???【文獻標志碼】 A????【文章編號】1007-8517（2020）5-0006-03

銀屑病是一種遺傳與環(huán)境共同作用誘發(fā)、免疫介導的慢性、復發(fā)性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病[1]。臨床上常反復難愈，影響患者生活質(zhì)量。從病理學上看，角質(zhì)形成細胞增殖和分化的異常，角質(zhì)層中性粒細胞聚集所形成的Munro微膿瘍以及真皮淺層血管周圍以淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤是銀屑病的3個最主要的特點[3]。研究表明，在銀屑病的炎癥反應中，Th17細胞及其分泌的IL-17等對炎癥免疫有著至關重要的作用[3]。本病屬中醫(yī)“白疕”的范疇。筆者應用加味凈屑飲治療血熱證尋常型銀屑病，取得良好臨床療效[4]，為進一步為臨床使用提供客觀的實驗依據(jù)，筆者進一步研究加味凈屑飲對咪喹莫特誘導的銀屑病小鼠模型的治療作用及IL-17產(chǎn)生的影響，現(xiàn)報告如下。

1?實驗材料

1.1?實驗動物?來源，種系，品系：BALB/c小鼠，7～8周齡，體重20～22g，雌性，成都達碩生物科技有限公司提供，合格證號：SCXK（川）2008-24。上述動物飼養(yǎng)于動物實驗屏障系統(tǒng)，飼養(yǎng)一周后使用。溫度（22±1）℃，濕度（55±5）%，12 h光暗循環(huán)。飼料和水均在消毒后由動物自由攝取。

1.2?藥物與試劑?加味凈屑飲組成（60kg成人劑量）：水牛角粉30g，生地15g，紫草15g，白鮮皮15g，漏蘆根15g，雞血藤15g，白花蛇舌草20g，茜草根10g，威靈仙10g，蒼術10g，板藍根15g，苦參15g，玄參15g，昆明山海棠15g等，藥物來自于昆明市中醫(yī)醫(yī)院中藥房。加入10倍的水，浸泡30min，然后煎煮3次，合并煎煮液，紗布過濾、離心后，旋轉蒸發(fā)儀進行蒸發(fā)，最后濃縮成浸膏， 稱取質(zhì)量，折合原藥材1g浸膏相當于2.57g生藥。根據(jù)人與動物間藥物劑量換算比例換算成小鼠劑量，制定出給藥濃度。咪喹莫特乳膏購自湖北科益藥業(yè)股份有限公司（生產(chǎn)批號190801），地塞米松片購自國藥集團容生制藥有限公司（生產(chǎn)批號1509202），IL-17 ELISA檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司（生產(chǎn)批號210754003），其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3?主要儀器設備?離心機來自德國Thermo Scientific Heraeus;石蠟切片機、組織包埋機、烘片機、DM2500正置顯微鏡、全自動組織脫水機均購置德國萊卡儀器有限公司，酶標儀購自美國Bio-Tek公司。

1.4?實驗方法

1.4.1?實驗分組及干預?48只BALB/c雌性小鼠，平均體重18～20g，將其隨機分為6組：空白對照組、模型組、加味凈血飲低、中、高劑量組（分別為相當于生藥3g/kg、6g/kg和12g/kg）及地塞米松陽性對照組（2mg/kg），每組8只。將小鼠耳部的被毛小心剃去，將5%的咪喹莫特乳膏均勻涂抹于耳部，用藥量為10mg，1次/d，連續(xù)用藥5d?？瞻讓φ战M涂抹相同體積的蒸餾水。給藥組灌胃給予相應加味凈血飲，灌胃體積為0.4mL/只，空白對照組、模型組灌胃相同體積的生理鹽水。

1.4.2?左耳厚度檢測?使用游標卡尺測量各組小鼠背左耳皮膚厚度，測量3次，取平均值，于給藥第1天、第3天、和第5天下午3點測量左耳厚度。

1.4.3?HE染色法觀察皮膚的病理損傷程度?取材之后標本放入4%的多聚甲醛溶液中固定，通過包埋，切片，烘干，脫蠟，水化，HE染色等步驟制成透明的組織切片，在倒置光學顯微鏡下觀察各組小鼠皮膚的組織結構及炎癥細胞浸潤情況，并用數(shù)碼相機采集圖像。

1.4.4?ELISA法模型小鼠血清中的IL-17產(chǎn)生水平?收集血清樣本，采用ELISA法測定各組小鼠血清中的IL-17細胞因子的水平，各步驟按照試劑盒操作說明書進行。

1.4.5?統(tǒng)計學處理?采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)加減標準差（x±s）進行描述，兩組間均值的比較采用t檢驗，方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3?結果

3.1?加味凈屑飲對咪喹莫特誘導的模型小鼠左耳厚度的影響?實驗結果顯示，隨著造模時間推移，與空白對照組比較，模型組小鼠左耳厚度顯著增加，在第3天和第5天差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示造模成功;與模型組比較，地塞米松陽性對照組和加味凈屑飲高劑量組藥物干預于第3天和第5天顯著降低咪喹莫特誘導的模型小鼠左耳厚度，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結果見表1。

3.2?加味凈屑飲對咪喹莫特誘導的模型小鼠左耳病理損傷的影響?HE 染色顯示，空白對照組小鼠耳部皮膚表皮層菲薄，細胞形態(tài)正常。與空白對照組比較，模型組耳朵皮膚明顯增厚，炎癥細胞浸潤明顯;與模型組比較，地塞米松陽性對照組和加味凈屑飲不同劑量組藥物干預，顯著降低皮膚厚度，炎癥細胞浸潤減少，陽性對照組和高劑量組效果更好。如圖1所示。

3.3?加味凈屑飲對咪喹莫特誘導的模型小鼠IL-17產(chǎn)生水平的影響?ELISA檢測結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠血清IL-17顯著升高;與模型組比較，加味凈屑飲高劑量組藥物干預下調(diào)咪喹莫特誘導的模型小鼠血清Th17細胞細胞因子（IL-17）的表達水平，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。如圖2所示。

4?討論

銀屑病是一種遺傳與環(huán)境共同作用誘發(fā)、免疫介導的慢性、復發(fā)性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病。屬于中醫(yī)學“白疕”的范疇。清《醫(yī)宗金鑒》指出白疕“固由風邪客皮膚，亦由血燥難榮外”。歷代醫(yī)家多從血論治銀屑病，蜀中中醫(yī)外科名家吳軍教授認為本病病機為素體陽熱偏盛，外受風濕熱邪侵襲，內(nèi)外邪氣搏結于血分，至血熱風燥，肌膚失養(yǎng)而成白疕。治療以清熱涼血、除濕解毒、祛風潤燥為主。

加味凈屑飲是在吳軍老師凈屑飲基礎上加減化裁而成，方中水牛角粉清熱解毒，涼血散瘀;玄參清熱涼血，滋陰解毒共為君藥;生地清熱涼血，滋陰解毒;紫草涼血活血，解毒生肌;漏蘆根清熱解毒散結，共為臣藥。白鮮皮清熱燥濕，祛風解毒;昆明山海棠祛風除濕，活血止血;茜草根涼血止血，疏風通絡;苦參清熱燥濕，涼血解毒;威靈仙祛風濕;蒼術祛風解表，健脾燥濕;板藍根清熱解毒，涼血利咽，上藥共為佐藥;雞血藤行血補血，舒筋活絡，能“治風毒通血脈”，為使藥。全方共奏清熱涼血、除濕解毒、祛風潤燥之功。

銀屑病發(fā)病機制復雜，目前研究認為免疫紊亂是銀屑病發(fā)病機制的重要環(huán)節(jié)，也是當前研究的熱點。最新的研究表明IL-23/Th17免疫調(diào)節(jié)通路在銀屑病的發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵作用[5]。Th17細胞及下游細胞因子IL-17A、IL-17F、IL-22等導致銀屑病的炎癥反應而至發(fā)病。咪喹莫特誘導銀屑病樣小鼠模型皮損特點、病理學特征及細胞因子改變都與銀屑病相似，與銀屑病進行期病理變化基本一致，基本符合中醫(yī)銀屑病血熱證表現(xiàn)[6]。故本研究選用了咪喹莫特誘導BALB /c雌性小鼠作為銀屑病模型。前期研究發(fā)現(xiàn)加味凈屑飲顯著降低銀屑病患者PASI評分和DLQI評分，顯示出較好的臨床療效。本次研究通過構建咪喹莫特誘導的銀屑病模型小鼠，進一步觀察加味凈屑飲干預銀屑病小鼠模型的組織病理改變和對Th17細胞相關細胞因子的影響，結果顯示，加味凈屑飲高劑量藥物干預顯著降低咪喹莫特誘導的模型小鼠左耳厚度，減少左耳炎癥細胞的浸潤，下調(diào)咪喹莫特誘導的模型小鼠血清Th17細胞細胞因子（IL-17）的表達水平。初步結果顯示，加味凈屑飲可能通過抑制IL-17產(chǎn)生水平介導治療銀屑病，然而具體作用機制需要進一步深入研究。

參考文獻

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[2]NESTLE F O，KAPLAN D H，BARKER J.Psoriasis[J].NEnglJ Med，2009，36（5）：496-509.

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[5]GANGULY D，HAAK S，SISIMK V，et al.The role of dendritic cells in autoimmunity[J].Nat Rev Immunol，2013，13（8）：566-577.

[6]李锘，押麗靜，王磊，等.清熱涼血方對IMQ誘導銀屑病小鼠模型IL-17A、IL-10的影響及miR-210激動劑的干預作用[J].中國皮膚性病學雜志，2019，33（8）：885-889.

（收稿日期：2019-12-26?編輯：陶希睿）