王娜娜

摘要：目前已經(jīng)發(fā)展的一些葉酸檢測(cè)的方法各不相同，主要根據(jù)測(cè)定式樣來(lái)決定其測(cè)定方法，最早發(fā)展的是微生物法，靈敏度高，但重復(fù)性相對(duì)較差，主要有比色法、紫外分光光度法、熒光分析法等等。

關(guān)鍵詞：葉酸 檢測(cè) 方法

微生物法

微生物法的檢測(cè)原理為酪乳酸桿菌的生長(zhǎng)必需葉酸，培養(yǎng)基中若缺乏葉酸則該細(xì)菌不能生長(zhǎng)。在一定的條件下，酪乳酸桿菌的生長(zhǎng)及其代謝產(chǎn)物的濃度與培養(yǎng)基中葉酸的含量成正比關(guān)系，可測(cè)定細(xì)菌代謝物或菌體的濃度，即用酸度或渾濁度測(cè)定試樣中葉酸的含量。

熒光法

超聲氧化熒光法

葉酸自身熒光很弱，在中性介質(zhì)中經(jīng)超聲照射后，能被氧化成喋呤羧酸，其熒光強(qiáng)度在462 nm波長(zhǎng)處比葉酸自身有顯著提高?；谝陨犀F(xiàn)象，建立了一種超聲氧化預(yù)處理，熒光檢測(cè)葉酸的方法。

熒光分光光度法

本法利用高錳酸鉀在酸性介質(zhì)中氧化葉酸為1-氨基-4-羥基喋吮-6-葉酸后，其熒光強(qiáng)度可以測(cè)定復(fù)方制劑中葉酸的含量，其他維生素可用硅藻土吸附除去，本法靈敏度較高，可測(cè)得0. l ug/ml的葉酸。

衍生熒光法

在酸性條件下，用強(qiáng)氧化劑氧化葉酸，并于254 nm紫外光下照射30 min，其氧化產(chǎn)物均具有強(qiáng)的熒光性質(zhì)，因此熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)，比葉酸自身靈敏度提高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：高錳酸鉀氧化一光照體系檢出限為3.2 x10 -9mol/L，過(guò)氧化氫氧化一光照體系檢出限為6. 5 x 10 -9mol/L。

離子捕獲法

1995年，wilson等提出了離子捕獲法檢測(cè)葉酸。即在實(shí)驗(yàn)中，樣品中加入變性劑后，葉酸與內(nèi)源性結(jié)合蛋白分離，釋放后的葉酸再與帶有大量陰離子的親合試劑結(jié)合，合成產(chǎn)物經(jīng)過(guò)離子捕獲池而與陽(yáng)離子纖維結(jié)合，最后通過(guò)堿性磷酸酶與喋酸（葉酸的類似物）結(jié)合物對(duì)葉酸結(jié)合蛋白上游離結(jié)合位點(diǎn)的探測(cè)，定量分析樣品中葉酸的含量。

色譜法

高效液相色譜法

在薄膜強(qiáng)陰離子交換樹脂 （0.01 *300cm pellicular）柱上用氯化鉀一磷酸鹽緩沖液（pH = 7.5）在40℃的溫度下進(jìn)行梯度洗脫，可將三經(jīng)基葉酸（THF） ， N5-甲基一三經(jīng)基葉酸（N5-CH3， -THF），去氫葉酸（DHF）、葉酸（FA）等異構(gòu)體的混合物分離，洗脫的順序是：THF， N5- CH3 -THF， DHF， FA。

薄層色譜法

采用過(guò)渡金屬M(fèi)n2+ 、Fe2+ 、Co2+ 、Ni2+ 、Cu2+ 、Cd2+ 、Zn2+ 或Hg2+ 浸漬的硅膠G 薄層板，以正丙醇+正丁醇+水+氨（ 7+ 5+ 1+ 2） 為展開劑，可以對(duì)維生素B 1 、B 2 、B 6 、B 12 和蝶酰谷氨酸（ FA） 進(jìn)行分離 。采用高效纖維素薄層板，以異丙醇和檸檬酸緩沖溶液為展開劑， 采用紫外和熒光檢測(cè)， 可以測(cè)定亞葉酸鈣制劑中0. 1%的FA、10-甲?；淙~酸（ 10-CHO-DHF） 等雜質(zhì) 。

氣相色譜法

有人采用阿拉伯糖乳桿菌合成13C標(biāo)記的葉酸，并以此為內(nèi)標(biāo)，與血液或組織樣品混和，與過(guò)量的葉酸結(jié)合蛋白結(jié)合，除去對(duì)氨基苯甲酸多谷氨酸，然后用6mo1/ L HC1將葉酸分解成對(duì)氨基苯甲酸（PABA）、蝶陡和谷氨酸，采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定PABA。

比色法

茚三酮比色法

本法主要適用于測(cè)定藥劑中的葉酸，采用1， 2萘并喳琳-4磺酸鈉將葉酸還原生成對(duì)氨基苯谷氨酸，在485nm處有最大吸收峰?，F(xiàn)已改為用鋅粉和鹽酸將葉酸還原為2， 4， 5-三胺基-羥基嘧啶。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，TAHP中的5位胺基及6位羥基參加和茚三酮生色反應(yīng)，該紫色化合物在555nm處有最大吸收峰。

還原裂解比色法

本法也適用于測(cè)定藥物中葉酸的含量，其原理是基于將葉酸還原裂解為2-氨基-4-羥基-6-甲基喋啶和對(duì)氨基苯甲酰谷氨酸，后者經(jīng)重氮化后與N-（1-N）-二乙二胺偶合形成紫紅色的偶氮化合物，550nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。

直接比色法

本法適用于測(cè)定純品葉酸。原理為葉酸與Folin一cioalten試劑作用（室溫，堿性介質(zhì)中）產(chǎn)生藍(lán)色，在760nm處有最大吸收峰。在4.4 – 44ug/ml濃度范圍內(nèi)符合Beer定律，顏色可穩(wěn)定90min，葉酸的分解產(chǎn)物對(duì)氨基苯甲酞谷氨酸與F-C試劑產(chǎn)生藍(lán)色。

紫外分光光度法

本法只適用于純?nèi)~酸藥劑及針劑的測(cè)定。測(cè)定原理為葉酸在0.1 mol/L氫氧化鈉中具有最大吸收作用在260nm處和283nm處葉酸的最大吸收可用于定量分析葉酸含量。

電化學(xué)方法

利用葉酸分子在汞電極上的吸附性，采用在適當(dāng)電位預(yù)富集的方法與示差脈沖結(jié)合，建立了測(cè)定痕量葉酸的電化學(xué)分析方法。

高效液相柱后衍生法

高效液相柱后衍生法的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、快捷、靈敏，滿足日常分析。市疾病預(yù)防控制中心劉莉治等人采用該法測(cè)定出了嬰兒保健食品中葉酸的含量，他們?cè)趯?shí)驗(yàn)中選用了含12%乙腈+88% 0.05 mmol/LKH2PO4溶液（pH=3.5）作為流動(dòng)，使用熒光檢測(cè)器檢測(cè)定量，激發(fā)波長(zhǎng)為365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為450 nm，并用外標(biāo)法測(cè)定了葉酸的含量。

單掃描示波極譜法

單掃描示波極譜法的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，不需要昂貴的儀器設(shè)備。集美大學(xué)的彭愛紅等人 采用JP-303型極譜分析儀測(cè)定葉酸，建立了保健食品中葉酸的單掃描二階導(dǎo)數(shù)示波極譜測(cè)定方法，并用正交試驗(yàn)確定了葉酸測(cè)定的最佳底液條件。

參考文獻(xiàn)：

[1]方尚玲. 葉酸及其檢測(cè)[J]. 武漢輕工大學(xué)學(xué)報(bào)， 2000（1）