周春權(quán) 趙立 蔣暢

【摘 要】 目的：觀察畬藥“十二時(shí)辰”醇提液皮膚用藥的慢性毒性作用，初步評(píng)價(jià)其皮膚長(zhǎng)期用藥的安全性。方法：采用新西蘭家兔進(jìn)行皮膚用藥30d涂皮慢性毒性試驗(yàn)，固定涂藥時(shí)間，連續(xù)30d，末次給藥后進(jìn)行血常規(guī)、血液生化指標(biāo)、臟器指數(shù)及組織病理學(xué)檢查。結(jié)果：畬藥“十二時(shí)辰”醇提液用于家兔皮膚慢性毒性實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育良好，血常規(guī)、血液生化指標(biāo)、臟器指數(shù)及組織病理學(xué)檢查與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：畬藥“十二時(shí)辰”醇提液皮膚長(zhǎng)期用藥對(duì)家兔無(wú)明顯毒性，是較安全的皮膚外用藥。

【關(guān)鍵詞】 重瓣鐵線蓮;皮膚用藥;慢性毒性

【中圖分類號(hào)】R285.5 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ? ?【文章編號(hào)】1007-8517（2020）1-0021-04

“十二時(shí)辰”為福建福安民間畬醫(yī)習(xí)用藥，根據(jù)《福安畬醫(yī)畬藥》記載，其性溫，味辛，具有通經(jīng)活絡(luò)、通關(guān)竅、祛風(fēng)除濕、活血止痛、理氣通便、利尿等功效[1]，黃澤豪等[2]對(duì)其進(jìn)行本草考證，福安“十二時(shí)辰”為毛茛科植物重瓣鐵線蓮Clematis florida Thunb.var.plena D.Don的干燥根。重瓣鐵線蓮具有多種生物活性化學(xué)成分，林玲等[3]對(duì)福安的重瓣鐵線蓮的化學(xué)成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其可能含有氨基酸、蛋白質(zhì)、還原糖、多糖、皂苷類、生物堿、黃酮類以及少量的酚類和鞣質(zhì)、有機(jī)酸、內(nèi)酯、香豆素、揮發(fā)油、甾體和萜類等化學(xué)成分。現(xiàn)代藥理研究表明具有抗炎、抗腫瘤、祛風(fēng)除濕、解毒消腫等作用。葉麗穎等[4]發(fā)現(xiàn)鐵線蓮提取物具有一定的抗氧化能力和抑菌能力，能抑制脂質(zhì)體過(guò)氧化，清除超氧陰離子;能抑制金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌和枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)。

“十二時(shí)辰”作為畬族民間習(xí)用藥，具有鮮明的地方與民族特色。當(dāng)?shù)鼐用裼谩笆r(shí)辰”泡酒，藥液作為皮膚外用藥，用來(lái)治療跌打損傷，關(guān)節(jié)腫痛等。本實(shí)驗(yàn)室前期觀察到“十二時(shí)辰”水煎劑小鼠灌胃急性毒性的半數(shù)致死量為60.08g/kg[5]。為分析“十二時(shí)辰”醇提液作為皮膚用藥的毒性，項(xiàng)目組參照《中藥藥理研究方法學(xué)》皮膚用藥毒性試驗(yàn)方法[6]，進(jìn)行“十二時(shí)辰”皮膚用藥慢性毒性試驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭家兔，雌雄各半，（1.5±0.2）kg，購(gòu)自上海市松江區(qū)松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)，合格證號(hào)：20170008000087。

1.2 藥物 “十二時(shí)辰”生藥（閩東畬族青草藥發(fā)展協(xié)會(huì)提供），經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)范世明教授鑒定為毛茛科植物重瓣鐵線蓮Clematis florida Thunb.var.plena D.Don 的干燥根，本實(shí)驗(yàn)采用65%的乙醇提取濃縮制備，每毫升含生藥1.0g。 詩(shī)妃脫毛膏（批號(hào)：PSHG028，廣州詩(shī)妃生物科技有限公司）。

1.3 儀器 YP502N電子天平（上海精密科學(xué)有限公司）;AU480全自動(dòng)生化儀（貝克曼）;XT2000i全自動(dòng)血液分析儀（SYSMEX）;DMi8顯微鏡（LEICA）

2 方法

2.1 分組 通過(guò)前期的皮膚用藥急性毒性試驗(yàn)，未觀察到毒性反應(yīng)，可能是毒性較小，則采用最大濃度最大耐受量進(jìn)行家兔慢性毒性試驗(yàn)，最大濃度為1.0g/mL原藥材。將健康的新西蘭家兔隨機(jī)分成4組，即正常對(duì)照組（涂賦形劑30%乙醇）、“十二時(shí)辰”高劑量組（1.0g/mL）、中劑量組（0.5g/mL）、低劑量組（0.25g/mL），每組6只，雌雄各半。

2.2 給藥方法與觀察[7] 給藥前24h先用電推剪在背部剃毛，然后用詩(shī)妃脫毛膏脫毛，脫毛面積約150cm2。給藥途徑與臨床一致，采用皮膚給藥，每只家兔脫毛區(qū)固定時(shí)間涂藥5mL，涂藥后用紗布固定， 家兔分籠飼養(yǎng)，連續(xù)用藥30d。末次給藥后動(dòng)物禁食不禁水16h，用10% 的水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉。將麻醉后的動(dòng)物仰臥固定，使用一次性采血針從腹主動(dòng)脈采血，血樣用于血常規(guī)和血生化檢測(cè)。采血完后處死動(dòng)物，解剖動(dòng)物，摘取動(dòng)物下列臟器：腦、心、肝、脾、肺、腎（單側(cè)）、胸腺、腎上腺（單側(cè)）、睪丸（單側(cè)）、附睪（單側(cè)）子宮、卵巢（單側(cè)）分別稱重，并計(jì)算主要臟器系數(shù)。計(jì)算公式如下：

臟器系數(shù)=臟器重量/體重×100%

2.3 HE染色病理切片 檢查稱重后，各臟器均浸入4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，用于HE（hematoxylin-eosin staining）染色病理切片。將固定后的主要臟器（心、肝、脾、肺、腎）進(jìn)行修樣后，在脫水機(jī)內(nèi)進(jìn)行梯度脫水及透明。將脫水后的樣本取出，進(jìn)行石蠟包埋。將包埋后的組織樣本固定在切片機(jī)上切片，然后在溫水（42～46℃）中展平、貼片，最后置入烘箱內(nèi)過(guò)夜烘干。次日在二甲苯和乙醇濃度梯度中使切片脫蠟，然后進(jìn)行HE染色，最后進(jìn)行顯微鏡檢查并拍照。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 資料采用SPSS14.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差齊時(shí)兩均數(shù)比較用LSD，方差不齊用秩和檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況和體重增長(zhǎng)的影響 用藥組與對(duì)照組相比，未觀察到家兔的活動(dòng)、 飲食、皮毛光澤的異常，家兔體重隨時(shí)間推移而增加，與正常對(duì)照組比無(wú)明顯變化（P>0.05）（見(jiàn)表l） 。結(jié)果顯示“十二時(shí)辰”醇提液皮膚用藥30d對(duì)家兔的體重變化無(wú)影響。

3.2 對(duì)家兔主要臟器的臟器系數(shù)的影響 取家兔心、腦、肝、脾、肺、腎、胸腺等主要臟器稱重并計(jì)算其臟器指數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組家兔主要臟器的臟器系數(shù)與正常對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。 說(shuō)明“十二時(shí)辰”醇提液皮膚用藥30天對(duì)家兔的主要臟器無(wú)影響。見(jiàn)表2。

3.3 對(duì)家兔血常規(guī)的影響 取各組家兔的血清進(jìn)行血常規(guī)檢查，各給藥組連續(xù)涂抹“十二時(shí)辰”醇提液30d后對(duì)家兔血常規(guī)無(wú)明顯影響，均在正常值范圍內(nèi)。見(jiàn)表3。

3.4 對(duì)家兔血液生化的影響對(duì)各組家兔血清進(jìn)行血液生化檢測(cè)，給藥組連續(xù)涂抹“十二時(shí)辰”醇提液30d后對(duì)家兔血生化指標(biāo)無(wú)明顯影響，均在正常值范圍內(nèi)。見(jiàn)表4。

3.5 對(duì)組織學(xué)的影響 取各組家兔的心、肝、脾、肺、腎、等各臟器組織進(jìn)行HE染色，顯微鏡拍照，由圖1可知，“十二時(shí)辰”醇提液皮膚用藥30d對(duì)家兔主要臟器的組織形態(tài)正常，界限分明，未見(jiàn)明顯異常。

4 討論

實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)“十二時(shí)辰”水煎劑作為內(nèi)服的毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)其水煎劑小鼠灌胃有一定的毒性作用，半數(shù)致死量 （LD50）為60.08g/kg[5] 。其口服有一定的毒性反應(yīng)，那么作為外用制劑，是否也會(huì)有一定的毒性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室采用醇提液進(jìn)行了一系列的皮膚用藥安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)，皮膚給藥急性毒性試驗(yàn)、皮膚刺激試驗(yàn)、皮膚過(guò)敏試驗(yàn)，均未見(jiàn)毒性反應(yīng)。

本次實(shí)驗(yàn)用十二時(shí)辰對(duì)家兔皮膚進(jìn)行30d涂皮實(shí)驗(yàn)研究，在本實(shí)驗(yàn)條件下，30d涂皮試驗(yàn)的3個(gè)劑量組（5.0、2.5、1.25g生藥/只），其體重、血常規(guī)和生化檢測(cè)指標(biāo)，與正常對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），HE染色病理組織學(xué)檢查結(jié)果也表明各試驗(yàn)組家兔的心、肝、脾、肺、腎睪丸、卵巢等組織均未見(jiàn)病理性損傷。表明該樣品外用涂皮對(duì)家兔的生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)不良影響。對(duì)畬藥“十二時(shí)辰”醇提液外用于活血化瘀，治療跌打損傷，關(guān)節(jié)腫痛等臨床具有積極的參考價(jià)值。

畬藥“十二時(shí)辰”屬于福建福安地區(qū)畬族藥，在當(dāng)?shù)匾延?00多年的使用歷史，具有鮮明的地方與民族特色，現(xiàn)在當(dāng)?shù)亻_(kāi)始進(jìn)行大量的人工栽培，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入來(lái)源的一大部分，其在畬族民間也得到廣泛應(yīng)用，民間既可用它作為觀賞性花卉，又可用它泡酒或熬湯當(dāng)作內(nèi)服，還有的用它做成洗劑和搽劑用作外用。但目前對(duì)“十二時(shí)辰”的藥理藥效研究較少，特別是安全性方面的實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。為了有效避免民間應(yīng)用時(shí)可能造成不良反應(yīng)，為保障福建草藥民間的用藥安全。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為“十二時(shí)辰”的外用制劑的開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)，從而為帶動(dòng)當(dāng)?shù)禺屪宓慕?jīng)濟(jì)和畬醫(yī)畬藥的發(fā)展提供一些理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2018-10-29 編輯：程鵬飛）