李芮 馬良會(huì) 王棟 張春雷 周孟 廖尚高

摘 要 目的：研究9種通絡(luò)祛風(fēng)中藥的提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶（XO）的體外抑制活性，以篩選活性突出的中藥提取物。方法：以黃嘌呤為底物、XO為反應(yīng)酶，以別嘌醇為陽(yáng)性對(duì)照，以三角風(fēng)、石胡椒、山莓、金雀花根、紫藤根、牛迭肚根、梓木皮、凌霄花根、爬巖香等藥材的水提物和甲醇提取物（以下簡(jiǎn)稱“醇提物”）以及活性提取物的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水等萃取部位為對(duì)象，采用紫外分光光度法檢測(cè)各樣品對(duì)XO的抑制率，采用Graphpad prism 6.0軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）以篩選活性提取物/部位;采用雙倒數(shù)法判斷藥材的酶抑制作用的類型。結(jié)果：9種中藥共18個(gè)提取物中，500 μg/mL各中藥提取物（除石胡椒醇提物外），250 μg/mL三角風(fēng)、石胡椒、山莓、爬巖香的水提物和醇提物，250 μg/mL梓木皮水提物，250 μg/mL金雀花根、牛迭肚根、凌霄花根醇提物，125 μg/mL金雀花根、牛迭肚根醇提物以及62.5 μg/mL金雀花根醇提物對(duì)XO的抑制率均超過(guò)了50%;其中，金雀花根醇提物的IC50值為43.43 μg/mL，低于其他藥材的提取物，為活性提取物。金雀花根醇提物石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水等萃取部位的IC50值分別為>200、193.35、7.67、14.80、>200 μg/mL，其中乙酸乙酯提取部位的IC50值與陽(yáng)性對(duì)照（5.11 μg/mL）接近。金雀花根醇提物對(duì)XO的抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)-非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，不同于陽(yáng)性對(duì)照的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。結(jié)論：金雀花根、牛迭肚根、石胡椒、山莓、爬巖香、三角風(fēng)等醇提物及三角風(fēng)、石胡椒、梓木皮等水提物對(duì)XO均具有一定的體外抑制活性，以金雀花根醇提物最強(qiáng)，且該提取物的乙酸乙酯萃取部位的抑制活性與別嘌醇相當(dāng)，但抑制類型有所差異。

關(guān)鍵詞 黃嘌呤氧化酶抑制活性;痛風(fēng);中藥;提取物;金雀花根;體外

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study in vitro inhibitory activities of 9 kinds of TCM for dredging collaterals and dispelling wind on xanthine oxidase （XO）， and to screen TCM with outstanding activity. METHODS： Using xanthine as substrate and xanthinase as reaction enzyme， allopurinol as positive control， with water extract and methanol extract （hereinafter referred to as “ethanol extract”） from the stem and leaves of Hedera nepalensis， the whole plant of Piper wallichii， the fruits of Rubus corchorifolius， the root of Caragana sinica， the root of Wisteria sinensis， the root of Rubus crataegifolius， the bark of Catalpa ovata， the root of Campsis grandiflora， the stem of P. hancei （hereinafter referred to by plant name） and petroleum ether， dichloromethane， ethyl acetate， n-butanol and water fraction of active extract as the objects， inhibition rate of each sample to XO was detected by spectrophotometry; IC50 values were calculated with Graphpad prism 6.0 software to screen active extract/fraction. Double reciprocal method was used to determine the type of enzyme inhibition. RESULTS： Among 9 kinds of TCM and 18 kinds of the extracts， the inhibitory rates to XO of 500 μg/mL extracts from each TCM （except for ethanol extract of P. wallichii）， 250 μg/mL water extract and ethanol extract of H. nepalensis， P. wallichii， R. corchorifolius and P. hancei， 250 μg/mL water extract of C. ovata，250 μg/mL ethanol extract of C. sinica，R. crataegifolius and C. grandiflora，125 μg/mL ethanol extract of C. sinica and R. crataegifolius， 62.5 μg/mL ethanol extract of C. sinica were more than 50%. The IC50 value of the ethanol extract from C. sinica was 43.43 μg/mL， which was lower than the extracts of other TCM， and which was the active extract. The IC50 values of petroleum ether， dichloromethane， ethyl acetate， n-butanol and water fraction of ethanol extract from C. sinica were >200， 193.35， 7.67， 14.80 and? >200 μg/mL， respectively. The IC50 value of ethyl acetate extract was close to that of positive control （5.11 μg/mL）. Inhibitory type of ethanol extract from C. sinica to XO was competitive-noncompetitive inhibition， which was different from competitive inhibition of positive control. CONCLUSIONS： The ethanol extracts of C. sinica， R. crataegifolius，P. wallichii，R. corchorifolius，P. hancei，H. nepalensis and the water extracts of H. nepalensis， P. wallichii， C. ovata show certain inhibitory activity in vitro to XO， especially ethanol extract of C. sinica. The ethyl acetate fraction of the ethanol extract of C. sinica has similar inhibitory activity to allopurinol but their inhibition types are different.

2.3.2 酶溶液 稱取XO適量，用水1 mL溶解，得濃度為100 U/mL的XO貯備液;將上述貯備液以每管50 μL分裝至10 mL EPP管中，于-80 ℃冰箱中保存。取上述貯備液適量，用PBS稀釋，制得濃度為0.2 U/mL的XO溶液。溶液配制完畢后，立即置于0 ℃冰箱中保存。

2.3.3 對(duì)照溶液 精密稱取別嘌醇適量，用DMSO溶解，加PBS適量稀釋，制得質(zhì)量濃度為500 μg/mL的別嘌醇母液，待用。采用二倍稀釋法，以含DMSO的PBS為溶劑將上述母液逐級(jí)稀釋，制得質(zhì)量濃度分別為500、250、125、62.5、31.3、15.63、7.82、3.91 μg/mL的對(duì)照溶液，DMSO含量為1%。

2.3.4 樣品溶液 ①9種中藥提取物樣品溶液：分別稱取“2.1”項(xiàng)下各中藥提取物的干燥浸膏適量，研碎，精密稱定，用DMSO溶解，再用PBS稀釋，制得質(zhì)量濃度均為2 000 μg/mL（以干燥浸膏質(zhì)量計(jì)，下同）的提取物樣品母液。采用二倍稀釋法，以含DMSO的PBS為溶劑將上述母液逐級(jí)稀釋，制得質(zhì)量濃度分別均為2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.3 μg/mL的樣品溶液，DMSO含量為1%。②活性提取物各萃取部位樣品溶液：分別稱取“2.2”項(xiàng)下各活性提取物萃取部位浸膏適量，研碎，精密稱定，用DMSO溶解，再用PBS稀釋，制得質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的萃取部位樣品母液。采用二倍稀釋法，以含DMSO的PBS為溶劑將上述母液逐級(jí)稀釋，制得質(zhì)量濃度分別均為1 000、500、250、125、62.5、31.3、15.6 μg/mL的樣品溶液，DMSO含量為1%。

2.4 XO抑制活性的檢測(cè)

在適宜條件下，黃嘌呤會(huì)被XO催化生成尿酸，尿酸在290 nm波長(zhǎng)處有特征吸收峰[16]?；诖耍狙芯坎捎肰ikrama Chakravarthi P等[16]報(bào)道的紫外分光光度法進(jìn)行XO抑制活性的檢測(cè)。反應(yīng)體系總體積為200 μL，將“2.3.4”項(xiàng)下的樣品溶液（或“2.3.3”項(xiàng)下的對(duì)照溶液，反應(yīng)終濃度均較原樣品稀釋4倍）50 μL和酶溶液（反應(yīng)終濃度為0.05 U/mL）50 μL混合后，于25 ℃預(yù)溫育15 min，加入底物溶液（反應(yīng)終濃度為150 μmol/L）50 μL以啟動(dòng)反應(yīng)，于25 ℃溫育20 min后，加入1 mol/L HCl溶液50 μL以終止反應(yīng)。取上述反應(yīng)液適量，使用全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀于290 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各反應(yīng)液的光密度（OD）值，取該值與溫育0 min時(shí)OD值的差值作為檢測(cè)結(jié)果。每樣品平行操作3次，試驗(yàn)重復(fù)2次。同法檢測(cè)空白樣品（即不含受試提取物，以含1%DMSO的PBS替代樣品溶液，以測(cè)定酶的最大反應(yīng)活性）的OD值，并計(jì)算抑制率，抑制率（%）=（1-試驗(yàn)樣品平均OD值/空白樣品平均OD值）×100%[17]。

2.5 IC50的計(jì)算

采用Graphpad prism 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以提取物（或別嘌醇）的（質(zhì)量）濃度（c）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)、其相對(duì)應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，計(jì)算半數(shù)XO被抑制時(shí)的藥物濃度，即IC50。

2.6 抑制類型判斷

采用Graphpad prism 6.0軟件、使用雙倒數(shù)法繪圖以進(jìn)行酶抑制類型的判斷[18]。在5個(gè)劑量黃嘌呤底物（1 200、1 000、800、600、400 μmol/L，反應(yīng)終濃度分別為300、250、200、150、100 μmol/L）以及2個(gè)劑量別嘌醇（250、125 μmol/L，反應(yīng)終濃度分別為62.5、31.25 μmol/L）、活性提取物（1 000、500 μmol/L，反應(yīng)終濃度分別為250、125 μmol/L）的分別作用下，按“2.4”項(xiàng)下方法檢測(cè)。以O(shè)D值20 min內(nèi)變化速率[即（OD20 min-OD0 min）/20]的倒數(shù)（1/v）為因變量、黃嘌呤底物濃度倒數(shù)的105倍[（1/c）×105]為自變量繪制雙倒數(shù)方程曲線，觀察不同抑制劑濃度下兩條曲線的交叉情況。若兩條曲線相交于縱軸，為競(jìng)爭(zhēng)性抑制;若相交于橫軸，為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制;若相互平行無(wú)交叉，為反競(jìng)爭(zhēng)性抑制;若相交于第2象限，為競(jìng)爭(zhēng)-非競(jìng)爭(zhēng)性抑制;若相交于第3象限，為非競(jìng)爭(zhēng)-反競(jìng)爭(zhēng)性抑制[18]。

3 結(jié)果

3.1 9種中藥提取物XO抑制活性的初篩結(jié)果

在相同終濃度條件下，9種中藥共18個(gè)提取物對(duì)XO的抑制率及IC50值見表2。由表2可見，各中藥提取物對(duì)XO的抑制率均有隨劑量降低而下降的趨勢(shì)，其中500? μg/mL各中藥提取物（除石胡椒醇提物超出限度外），250 μg/mL三角風(fēng)、石胡椒、山莓、爬巖香的水提物和醇提物，250 μg/mL梓木皮水提物，250 μg/mL金雀花根、牛迭肚根、凌霄花根醇提物，125 μg/mL金雀花根、牛迭肚根醇提物以及62.5 μg/mL金雀花根醇提物對(duì)XO的抑制率均超過(guò)了50%。當(dāng)提取物劑量為62.5 μg/mL時(shí)，超半數(shù)提取物對(duì)XO的抑制率低于或接近10%，且爬巖香水提物的抑制率低至1.0%;當(dāng)提取物劑量≤31.25 μg/mL時(shí)，除金雀花根醇提物（31.25 μg/mL）對(duì)XO的抑制率為48.3%外，其余提取物對(duì)XO的抑制率均已降至10%以下。在18個(gè)提取物中，金雀花根醇提物的IC50（43.43 μg/mL）雖高于陽(yáng)性對(duì)照別嘌醇（5.11 μg/mL），但明顯低于其余藥材的提取物，表明金雀花根醇提物活性相對(duì)較強(qiáng)，故以其為活性提取物進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3.2 金雀花根醇提物XO抑制活性萃取部位的篩選結(jié)果

活性提取物金雀花根醇提物不同萃取部位對(duì)XO的體外抑制活性檢測(cè)結(jié)果見圖1、表3。由圖1、表3可見，EA、NB、DCM部位對(duì)XO的抑制率有隨劑量增加而降低的趨勢(shì)。其中，EA部位的IC50值為7.67 μg/mL，接近于別嘌醇的5.11 μg/mL，活性最強(qiáng);NB部位的IC50值為14.80 μg/mL，活性次之;DCM部位的IC50值為193.35 μg/mL，活性相對(duì)較弱;而W、PE部位的IC50值均大于200 μg/mL，無(wú)活性。

3.3 金雀花根醇提物酶抑制類型分析

在不同抑制劑濃度下，別嘌醇的兩條曲線相交于縱軸，屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制;而金雀花根醇提物的兩條曲線相交于第2象限，屬于競(jìng)爭(zhēng)-非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，詳見圖2。

4 討論

XO是一種多功能的鉬羥化酶，廣泛分布于肝臟、腎臟、胃腸道、肺、心臟和血管內(nèi)皮中，是嘌呤代謝途徑中的關(guān)鍵酶，能催化次黃嘌呤和黃嘌呤反應(yīng)，產(chǎn)生尿酸和過(guò)氧化物自由基，從而導(dǎo)致痛風(fēng)等疾病的發(fā)生[19-20]。XODI可通過(guò)抑制XO活性，阻止尿酸和過(guò)氧化物的生成，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于高尿酸血癥、痛風(fēng)等癥的臨床治療[21]。鑒于此，本研究基于文獻(xiàn)方法[16]進(jìn)行設(shè)計(jì)，在體外模擬XO誘導(dǎo)黃嘌呤生成尿酸的反應(yīng)體系，擬通過(guò)考察藥物對(duì)酶催化尿酸生成的影響，初步評(píng)價(jià)藥物對(duì)XO的抑制活性。結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照別嘌醇的IC50值為5.11 μg/mL，與文獻(xiàn)[16]數(shù)據(jù)[（6.16±0.10）μg/mL]差異不大，提示方法可行。同時(shí)，為了盡量消除中藥提取物溶解度及顏色對(duì)檢測(cè)結(jié)果所造成的干擾，并綜合儀器限度等多方面因素，本研究最終確定活性初篩試驗(yàn)中各受試藥材樣品溶液的最高反應(yīng)終濃度為500 μg/mL。但需要說(shuō)明的是，在實(shí)際操作中，500 μg/mL石胡椒醇提物樣品溶液的OD值仍超出了儀器的檢測(cè)限度，僅為個(gè)例，故筆者并未對(duì)其進(jìn)行分析。

本研究共納入了9種通絡(luò)祛風(fēng)中藥，均收載于《中華本草》中，且明確記載可用于治療痛風(fēng)等相關(guān)疾病。這9種中藥包含冷僻藥及民族常用藥。其中，瑤藥三角風(fēng)可用于臨床治療風(fēng)濕、關(guān)節(jié)腫痛、跌打損傷、瘡黃腫毒等癥[15]。苗藥石胡椒和爬巖香，前者舒絡(luò)通經(jīng)，多用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等癥，并可與雷公藤、三七、懷牛膝和萊菔子等組方成石藤膠囊[22-23]，該膠囊與爬巖香均可用于治療風(fēng)濕骨痛、手足麻痹[24]。冷僻藥山莓和牛迭肚根均主治痛風(fēng)[25]。金雀花根與紫藤根皆屬豆科，前者民間用以治療風(fēng)濕骨痛、痛風(fēng)等癥[26-27];后者與枸骨根、菝葜根水煎后，以米酒兌服，可治關(guān)節(jié)炎[28]。凌霄花根與梓木皮皆屬紫葳科，凌霄花根具活血、散瘀、解毒和消腫等作用，可治療風(fēng)濕性筋骨痛、急性腸胃炎等多種疾病[29]。梓木皮被收錄于《握靈本草》中，可“治霍亂不吐不瀉，煎湯治手足痛風(fēng)”[30]?；诖耍狙芯恳陨鲜?種中藥為對(duì)象，對(duì)其XO抑制活性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。

作為活性物質(zhì)挖掘的重要環(huán)節(jié)之一，本研究初步評(píng)價(jià)了9種中藥共18個(gè)提取物對(duì)XO的體外抑制活性。為保證整個(gè)體外反應(yīng)體系的可行性，綜合考慮樣品溶解性、最低有效濃度以及儀器限度等多方面因素，并參考已有文獻(xiàn)[11，16，31]，設(shè)置了“2.3”“2.4”“2.6”項(xiàng)下各提取物/萃取部位的反應(yīng)濃度。結(jié)果顯示，18個(gè)中藥提取物對(duì)XO的抑制活性均有隨劑量降低而減弱的趨勢(shì)。其中，紫藤根、凌霄花根等中藥提取物對(duì)XO抑制活性較弱或無(wú)XO抑制活性，提示其對(duì)痛風(fēng)類疾病的治療作用可能與XO抑制無(wú)關(guān);金雀花根、三角風(fēng)、石胡椒等中藥提取物的XO抑制活性較為突出，提示XO抑制可能是這類中藥抗痛風(fēng)的主要機(jī)制，但均有待相關(guān)基礎(chǔ)研究予以確認(rèn)。9種中藥的提取物中，金雀花根醇提物的IC50值為43.36 μg/mL，低于其余中藥，提示其可作為XODI的重要藥材來(lái)源。

本研究進(jìn)一步對(duì)金雀花根醇提物的不同萃取部位進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，EA、NB、DCM部位對(duì)XO的抑制率均有隨劑量增加而降低的趨勢(shì)，其IC50值分別為7.67、14.80、193.35 μg/mL，提示中、高極性部位可能是金雀花根發(fā)揮XO抑制作用的主要有效部位，有進(jìn)行深入挖掘的價(jià)值。此外，抑制類型研究結(jié)果顯示，別嘌醇對(duì)XO的抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)性，與已有文獻(xiàn)[32]結(jié)果基本一致;而金雀花根醇提物對(duì)XO的抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)-非競(jìng)爭(zhēng)性，提示該提取物中可能含有具競(jìng)爭(zhēng)-非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的單體抑制劑，亦有可能含有不同抑制類型的多個(gè)單體抑制劑，但有待通過(guò)成分分析和相應(yīng)基礎(chǔ)研究予以證實(shí)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究金雀花根的作用機(jī)制以及從金雀花根中尋找XODI奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，金雀花根、牛迭肚根、石胡椒、山莓、爬巖香、三角風(fēng)等醇提物及三角風(fēng)、石胡椒、梓木皮等水提物均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的XO抑制活性，這些中藥的抗痛風(fēng)作用可能與其XO抑制活性有關(guān)。此外，金雀花根醇提物中抗XO活性較強(qiáng)的EA和NB萃取部位也有待進(jìn)一步研究與開發(fā)。

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（收稿日期：2019-07-12 修回日期：2020-01-13）

（編輯：張?jiān)拢?/p>