張菁 孫婷 趙昌夢(mèng) 姜建國(guó)

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To identify the main unknow impurity of Oxiracetam capsule and determine its content， so as to improve the standard of quality control. METHODS： Two-dimensional UPLC-IT-TOF-MS was adopted to qualitatively analyze the unknown impurity. One-dimensional liquid chromatogram analysis was performed on ST PAK C18 ES column with mobile phase consisted of 0.02 mol/L sodium dihydrogen phosphate solution at the flow rate of 0.5 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃， sample size was 20 μL. The detection wavelength was set at 210 nm. Two-dimensional liquid chromatogram analysis was performed on Techmate C18-STⅡ column with mobile phase consisted of 0.02 mol/L ammonium acetate solution at the flow rate of 0.5 mL/min. The column temperature was 30 ℃. Mass spectrometry was adopted （electropray ionization source， MS+ and MS- mode data acquisition）. After the target impurity was located by one-dimensional liquid chromatography， it was transferred to two-dimensional liquid chromatography-mass spectrometry system for qualitative analysis. The unknown impurity structure was inferred by means of molecular formula prediction module “Accurate Mass Calculator”in LCMS Solution， and the refined impurity products by preparation and purification were standardized and confirmed. The impurity content was determined by HPLC （with the same condition of one-dimensional liquid chromatography for qualitative analysis）. RESULTS： The main unknown impurity in Oxiracetam capsules is oxiracetam acid. The content of the refined product was 99.5% after preparation and purification. The contents of oxiracetam acid in 9 batches of Oxiracetam capsules were 0.05%-0.14%. CONCLUSIONS： The established two-dementional UPLC-IT-TOF-MS method can accurately locate the peak position of the impurity oxiracetam acid， and analyze its structure， while the corresponding content determination method can better separate the impurity from the main drug and other components， with good sensitivity， precision， repeatability， stability and accuracy. The quality of the finished product of Oxiracetam capsules can be well controlled by using above method.

KEYWORDS? ?Two-dementional UPLC-IT-TOF-MS; HPLC;Oxiracetam capsule;Oxiracetam acid; Impurity; Identification; Content determination

奧拉西坦為吡拉西坦的類似物，其化學(xué)名為4-羥基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1），臨床上主要用于改善老年性癡呆和記憶障礙患者的記憶功能[1]，其作用機(jī)制是通過(guò)促進(jìn)磷酰膽堿和磷酰乙醇胺的合成，提高大腦中腺苷三磷酸（ATP）/腺苷二磷酸（ADP）的比值，增加大腦中蛋白質(zhì)和核酸的合成[2]。按照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）相關(guān)指導(dǎo)原則[3]開(kāi)展的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，奧拉西坦膠囊在貯存過(guò)程中雜質(zhì)含量有逐漸增加的趨勢(shì)。奧拉西坦原料藥現(xiàn)行注冊(cè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其有關(guān)物質(zhì)采用高效液相色譜（HPLC）自身對(duì)照法進(jìn)行測(cè)定[4-5]，但無(wú)法對(duì)有關(guān)物質(zhì)的含量進(jìn)行準(zhǔn)確控制;而奧拉西坦膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)則未對(duì)有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行控制[6]?；诖?，本課題組參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-8]，建立了超高效二維液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜法，對(duì)奧拉西坦膠囊中的主要未知雜質(zhì)進(jìn)行定性分析，確定雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，并對(duì)該雜質(zhì)進(jìn)行含量測(cè)定，為提高奧拉西坦膠囊質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)、確保其臨床使用的有效性和安全性提供技術(shù)支持。

1 材料

1.1 儀器

2D-LC-IT-TOF/MS型超高效二維液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)、SPD-M20A型二極管陣列檢測(cè)器（用于定性分析）、LC-20AD型液相色譜儀（用于含量測(cè)定）均購(gòu)自日本Shimadzu公司;Mercury-400型核磁共振（NMR）儀（美國(guó)Varian公司）;CP225D型十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

奧拉西坦膠囊（廠家A，批號(hào)：20180701、20180702、20180921;廠家B，批號(hào)：264180627、264180268、264180269;廠家C，批號(hào)：180801、180802、180803;規(guī)格均為0.4 g）;奧拉西坦原料藥[石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)（石家莊）有限公司，批號(hào)：264100627，純度：99.3%];醋酸銨、冰醋酸、二氯甲烷、甲醇均為色譜純，氫氧化鈉、濃鹽酸、磷酸二氫鈉均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 奧拉西坦膠囊中主要雜質(zhì)的定性分析

2.1.1 色譜條件 （1）一維液相色譜條件：色譜柱為ST PAK C18 ES柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.02 mol/L磷酸二氫鈉溶液，流速為0.5 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，進(jìn)樣量為20 μL。（2）二維液相色譜條件和質(zhì)譜條件：色譜柱為Techmate C18-STⅡ柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.02 mol/L醋酸銨溶液（用冰醋酸調(diào)節(jié)pH為4.8），流速為0.5 mL/min，柱溫為30 ℃;離子源為電噴霧離子源（ESI），離子源溫度為500 ℃，接口電壓為4 500 V（正離子模式）、-4 500 V（負(fù)離子模式），掃描方式為一級(jí)質(zhì)譜全掃描（正、負(fù)離子模式），去簇電壓為55 V（正離子模式）、-45 V（負(fù)離子模式）。

2.1.2 溶液的制備 （1）供試品溶液：精密稱取奧拉西坦膠囊內(nèi)容物適量，加0.02 mol/L磷酸二氫鈉溶液溶解并稀釋制成每1 mL中含奧拉西坦1 mg的溶液，即得。（2）自身對(duì)照溶液：精密量取上述供試品溶液0.5 mL，置于100 mL量瓶中，加0.02 mol/L磷酸二氫鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 主要未知雜質(zhì)定性分析 精密量取“2.1.2”項(xiàng)下自身對(duì)照溶液和供試品溶液各20 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下條件注入液相色譜儀，經(jīng)一維液相色譜條件分離確定主要未知雜質(zhì)的保留時(shí)間為6.607 min，詳見(jiàn)圖2。將該未知雜質(zhì)（保留時(shí)間為6.607 min的部分）切換到LOOP環(huán)中，進(jìn)行二維脫鹽分析，記錄總離子流圖和未知雜質(zhì)質(zhì)譜圖，詳見(jiàn)圖3、圖4。結(jié)果顯示，在奧拉西坦一維液相色譜圖中保留時(shí)間為6.607 min的未知雜質(zhì)峰，其分子離子峰分別為m/z 159.9[M+H]+和m/z 158.1[M-H]-，分子量為159。采用2D-LC-IT-TOF/MS系統(tǒng)的LCMS Solution Ver 3.70 色譜工作站中的分子式預(yù)測(cè)模塊“Accurate Mass Calculator”，結(jié)合化合物氫碳比、氮規(guī)則、質(zhì)譜信息以及奧拉西坦雜質(zhì)合成路線[9]，預(yù)測(cè)該雜質(zhì)的可能分子式為C6H9NO4，初步推斷該雜質(zhì)為奧拉西坦酸（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）。

2.1.4 破壞試驗(yàn) 取奧拉西坦原料藥適量，經(jīng)0.2 mol/L鹽酸溶液或0.2 mol/L氫氧化鈉溶液分別進(jìn)行酸、堿破壞后，按“2.1.2（1）”項(xiàng)下方法制成兩種破壞樣品供試品溶液后，再按“2.1.1（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定（圖略）。結(jié)果顯示，在一維色譜圖保留時(shí)間約6.6 min處的色譜峰明顯增大，經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)后顯示，其最大吸收波長(zhǎng)為197 nm;然后按“2.1.1（2）”項(xiàng)下條件檢測(cè)后顯示，該雜質(zhì)分子量為159，推測(cè)其為奧拉西坦在酸、堿作用下水解生成的奧拉西坦酸。

2.2 雜質(zhì)奧拉西坦酸的制備純化、標(biāo)化及結(jié)構(gòu)確證

2.2.1 雜質(zhì)奧拉西坦酸的制備純化 參考文獻(xiàn)方法[9]進(jìn)行制備與純化。取奧拉西坦原料藥20 g，置于500 mL回流瓶中，加入0.5 mol/L氫氧化鈉溶液100 mL，攪拌使溶解，加熱保溫回流反應(yīng)5 h后停止;冰浴降溫至0 ℃后，用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH為4，在50 ℃條件下蒸發(fā)至近干后，采用Sep-Pak?Silica固相萃取小柱層析，以二氯甲烷和甲醇梯度洗脫;收集洗脫液，在30 ℃條件下蒸發(fā)至干，得黃色油狀物。取該油狀物，加入90%甲醇50 mL后，在60 ℃條件下加熱使溶解，趁熱過(guò)濾;濾液于0 ℃條件下放置過(guò)夜，析出結(jié)晶后濾過(guò);結(jié)晶以甲醇清洗后，在60 ℃條件下干燥，得白色固體，即得雜質(zhì)奧拉西坦酸精制品。

2.2.2 奧拉西坦酸的標(biāo)化及結(jié)構(gòu)確證 取“2.2.1”項(xiàng)下制備純化所得的奧拉西坦酸精制品適量，加0.02 mol/L磷酸二氫鈉溶液溶解制成每1 mL中含奧拉西坦酸1 mg的溶液，再按“2.1.1（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。采用峰面積歸一化計(jì)算，結(jié)果所制奧拉西坦酸的含量為99.5%（n=6）。經(jīng)1H-NMR（400 MHz，D2O）分析，結(jié)果顯示，δ：4.40（m，1H），4.14（d，2H，J=17.6 Hz），3.92（dd，1H，J=17.6 Hz，6.5 Hz），3.42（dd，1H，J=10.4 Hz，1.9 Hz），2.87（dd，1H，J=17.2 Hz，6.4 Hz），2.28（dd，1H，J=17.2 Hz，2.0 Hz）。

2.3 奧拉西坦膠囊中奧拉西坦酸的含量測(cè)定

采用HPLC法進(jìn)行含量測(cè)定。

2.3.1 色譜條件 采用“2.1.1（1）”項(xiàng)下色譜條件。

2.3.2 溶液的制備 （1）供試品溶液：按“2.1.2（1）”項(xiàng)下方法配制，即得。（2）自身對(duì)照溶液：取上述供試品溶液按“2.1.2（2）”項(xiàng)下方法配制，即得。（3）雜質(zhì)對(duì)照品溶液：精密稱取“2.2.1”項(xiàng)下奧拉西坦酸精制品25 mg，置于25 mL量瓶中，加0.02 mol/L磷酸二氫鈉溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液;臨用前取該貯備液0.5 mL，置于100 mL量瓶中，加0.02 mol/L磷酸二氫鈉溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。（4）空白輔料溶液;取膠囊輔料（本課題組根據(jù)各廠家處方自行配制）按照處方比例混合，精密稱取適量，加0.02 mol/L磷酸二氫鈉溶液溶解制成空白輔料溶液。

2.3.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 稱取“2.2.1”項(xiàng)下奧拉西坦酸精制品適量，加入“2.3.2（2）”項(xiàng)下自身對(duì)照溶液適量，加0.02 mol/L磷酸二氫鈉溶液稀釋制成含奧拉西坦1 μg/mL、奧拉西坦酸5 μg/mL的混合溶液，再按“2.1.1（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定;另取“2.3.2（1）（3）（4）”項(xiàng)下供試品溶液、雜質(zhì)對(duì)照品溶液、空白輔料溶液同法進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示，奧拉西坦和奧拉西坦酸分離度大于4.6，理論板數(shù)按奧拉西坦峰計(jì)不低于5 000，空白輔料無(wú)干擾。

2.3.4 檢出限和定量限考察 取“2.3.2（3）”項(xiàng)下雜質(zhì)對(duì)照品溶液，以0.02 mol/L磷酸二氫鈉溶液為溶劑逐級(jí)稀釋制得系列溶液，按“2.1.1（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，當(dāng)信噪比分別為3 ∶ 1、10 ∶ 1時(shí)，得奧拉西坦酸的檢出限為0.02 ng、定量限為0.1 ng。

2.3.5 線性關(guān)系考察 取“2.3.2（2）（3）”項(xiàng)下自身對(duì)照溶液和雜質(zhì)對(duì)照品溶液，按“2.1.1（1）”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣5、10、20、40、80 μL，記錄峰面積。分別以?shī)W拉西坦和奧拉西坦酸的進(jìn)樣量（X，ng）為橫坐標(biāo)、相應(yīng)峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得兩者回歸方程分別為：奧拉西坦Y=2 007.2X-2 647.2（r=1.000），奧拉西坦酸Y=2 821.0X-15 783.0（r=0.999 6）。結(jié)果表明，奧拉西坦和奧拉西坦酸進(jìn)樣量均在25～400 ng范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.3.3”項(xiàng)下奧拉西坦和奧拉西坦酸混合溶液 20 μL，按“2.1.1（1）”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，奧拉西坦和奧拉西坦酸峰面積的RSD分別為0.6%、0.9%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取奧拉西坦膠囊內(nèi)容物（批號(hào)：180802）適量，共6份，按“2.3.2（1）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，同時(shí)取“2.3.2（3）”項(xiàng)下雜質(zhì)對(duì)照品溶液，分別按“2.1.1（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算奧拉西坦酸平均含量為0.05%（RSD=0.67%，n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取奧拉西坦膠囊內(nèi)容物（批號(hào)：180802）適量，共9份，精密稱定，分別置于25 mL量瓶中，精密加入50 μg/mL雜質(zhì)對(duì)照品溶液[按“2.3.2（3）”項(xiàng)下方法重新配制]0.8、1.0、1.2 mL，每個(gè)質(zhì)量濃度平行3份。加樣后，按“2.3.2（1）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，奧拉西坦酸平均加樣回收率為99.25%（RSD=1.6%，n=9），詳見(jiàn)表1。

2.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（批號(hào)：180802），分別于室溫下放置0、2、4、6、8 h時(shí)，按“2.1.1（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，奧拉西坦酸峰面積的RSD為0.96%（n=5），表明供試品溶液在室溫下放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.10 不同廠家9批樣品中奧拉西坦酸的含量測(cè)定取3個(gè)廠家共9批奧拉西坦膠囊樣品內(nèi)容物適量，按“2.3.2（1）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，同時(shí)取“2.3.2（3）”項(xiàng)下雜質(zhì)對(duì)照品溶液，分別按“2.1.1（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算奧拉西坦酸含量（按膠囊規(guī)格0.4 g計(jì)算）：雜質(zhì)含量=（供試品溶液奧拉西坦酸峰面積×雜質(zhì)對(duì)照品溶液濃度×樣品平均裝量）/（雜質(zhì)對(duì)照品溶液峰面積×供試品溶液濃度×樣品規(guī)格）×100%。每批樣品平行2份測(cè)定，取平均值。結(jié)果，9批樣品中均檢出奧拉西坦酸，其測(cè)定結(jié)果詳見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 色譜分析色譜柱的選擇

現(xiàn)行奧拉西坦膠囊標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)有關(guān)物質(zhì)測(cè)定項(xiàng)，而其原料藥注冊(cè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)測(cè)定采用色譜柱為C8柱或氰基柱。本課題組在相同的色譜條件下，比較了C8柱、氰基柱和C18柱的保留時(shí)間和分離效果。結(jié)果顯示，因奧拉西坦的極性大、分子小，故在C8柱上保留時(shí)間短、分離效果欠佳，主峰無(wú)法與破壞試驗(yàn)中產(chǎn)生的雜質(zhì)峰較好地分離;采用氰基柱分離時(shí)，由酸、堿破壞試驗(yàn)所獲得的雜質(zhì)色譜峰較少，且主峰的純度不高;采用ST PAK C18 ES色譜柱進(jìn)行分析時(shí)，因該色譜柱進(jìn)行了新型聚合物包被，不僅使奧拉西坦有適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r(shí)間，而且對(duì)雜質(zhì)的分離效果也好，故選擇其作為一維色譜分析的色譜柱。

3.2 色譜分析流動(dòng)相的選擇

在確定了色譜柱的基礎(chǔ)上，筆者考慮到需準(zhǔn)確定位雜質(zhì)的出峰時(shí)間，故重點(diǎn)對(duì)一維色譜流動(dòng)相進(jìn)行篩選。先后選用甲醇-水、乙腈-水、水、磷酸鹽緩沖液等系統(tǒng)，并適當(dāng)調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例后進(jìn)行了一系列考察。結(jié)果顯示，流動(dòng)相中如果含有機(jī)溶劑，則柱效低、保留時(shí)間短，主峰與相鄰峰不能得到較好分離;采用水為流動(dòng)相則會(huì)出現(xiàn)較大的溶劑峰和倒峰;而采用磷酸鹽緩沖液系統(tǒng)可避免出現(xiàn)以上情況。通過(guò)試驗(yàn)篩選后發(fā)現(xiàn)，以0.02 mol/L磷酸二氫鈉緩沖鹽為流動(dòng)相時(shí)，主峰保留時(shí)間適宜，與各雜質(zhì)峰的分離度良好，且峰寬較小，便于對(duì)目標(biāo)雜質(zhì)成分進(jìn)行峰切割后轉(zhuǎn)入二維色譜分析。

3.3 奧拉西坦雜質(zhì)的產(chǎn)生

奧拉西坦含酰胺鍵，合成中在無(wú)水碳酸鈉作用下易水解成羧酸，生成奧拉西坦酸（即4-羥基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸）[10]。奧拉西坦酸為合成過(guò)程中的主要副產(chǎn)物，以及在酸性、堿性條件下的主要降解產(chǎn)物，可進(jìn)一步與甲醇和乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)，生成4-羥基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸甲酯和4-羥基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸乙酯，所以控制奧拉西坦酸的含量顯得尤為重要。

綜上所述，奧拉西坦酸為奧拉西坦膠囊中的主要雜質(zhì);制備純化后獲得的奧拉西坦酸精制品含量達(dá)到99.5%，可以滿足作為對(duì)照品的要求;所建立的超高效二維液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜法能準(zhǔn)確定位雜質(zhì)奧拉西坦酸的出峰位置并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，且相應(yīng)的含量測(cè)定方法能較好地分離雜質(zhì)與主藥及其他成分，靈敏度、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度均良好，符合2015年版《中國(guó)藥典》要求[3]。因此，采用單一雜質(zhì)外標(biāo)法測(cè)定奧拉西坦酸的含量，并結(jié)合自身對(duì)照法測(cè)定其他雜質(zhì)，可較好地跟蹤測(cè)定生產(chǎn)制備過(guò)程中的中間體、控制奧拉西坦膠囊的成品質(zhì)量。

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（收稿日期：2019-08-01 修回日期：2019-02-12）

（編輯：段思怡）