張靜驛，高 耀，陳建麗，秦雪梅，田俊生＊＊，武嫣斐

（1. 山西醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院 太原 030001；2. 山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院 太原 030001；3. 山西大學中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心 太原 030006）

抑郁癥是一種以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征的一類心境障礙[1]。其具有疾病發(fā)病率、疾病復發(fā)率、疾病致殘率高“三高”的特點[2]。抑郁癥不僅影響患者的生活質量，還能給患者及家庭帶來嚴重的經濟負擔[3]。因此，研發(fā)有效且不良反應小的抗抑郁癥藥物對于抑郁癥的治療有重要的意義。

PC12 細胞是一種具有神經內分泌作用的腎上腺髓質嗜鉻瘤細胞，常用于抑郁癥等疾病的研究[4]。CORT 是HPA 軸末端的重要激素，其異常增加可以導致抑郁特征[5]。實驗結果發(fā)現(xiàn)大部分抑郁癥患者體內的HPA 軸異常激活，從而引起細胞的損傷或凋亡[6]。課題組前期采用代謝組學方法研究確認了CORT誘導低分化PC12 細胞可以作為最適的抑郁癥體外研究模型[7]。本實驗小組按照新藥技術路線，將復方柴歸方（FFCGF）研發(fā)成的抗抑郁中藥新藥“柴歸顆粒”已經獲得國家藥物臨床試驗批件（2018L03149）[8.9]。

課題組前期采用行為絕望模型、慢性溫和不可預知應激模型、利血平拮抗模型、5-HT 誘導甩頭模型等抑郁癥動物模型反復多次對FFCGF 的抗抑郁藥效進行了驗證，結果發(fā)現(xiàn)對小鼠不動時間，CUMS 模型引起的大鼠體重下降、快感缺乏、活動力降低，利血平拮抗致小鼠眼瞼下垂、體溫下降、運動不能，5-HT 誘導甩頭等主要藥效指標均具有明顯的改善[9-11]，但FFCGF在細胞水平的神經保護作用機制尚不清楚。

本研究擬采用CORT 誘導低分化PC12 抑郁細胞模型，通過測定乳酸脫氫酶釋放率、細胞凋亡、線粒體膜電位以及細胞內鈣離子含量等指標，探討FFCGF 細胞保護和抗凋亡作用，觀察其對PC12 細胞神經保護作用機制，為柴歸顆粒治療抑郁癥作用機制研究提供科學依據。

1 材料

1.1 細胞

PC12細胞購自中國科學院細胞庫。

1.2 藥品

FFCGF 中藥材均購自山西省華陽藥業(yè)有限公司，經檢測符合《中國藥典》2015年版規(guī)定。

1.3 試劑

胰蛋白酶：北京索萊寶科技有限公司，MTT、DMSO：美國西格瑪奧德里奇有限公司，RPMI 1640 培養(yǎng)液、血清：Hyclone，Logan，USA，乳酸脫氫酶試劑盒：北京索萊寶科技有限公司，CORT：中國成都化夏化學試劑有限公司，線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）、Fluo-3 Am 鈣離子熒光探針：碧云天生物技術有限公司。

1.4 儀器

細胞培養(yǎng)箱，低速離心機，TGL-16 高速臺式冷凍離心機，SynergyMx 多功能酶標儀，BD FACSCalibur 流式細胞儀。

2 方法

2.1 FFCGF提取物的制備及質量控制

按照處方比例組成，參考已有制備工藝及質量控制方法，獲得FFCGF 提取物，并對其進行相應的質量控制（每g 提取物中含芍藥苷8.9 mg，柴胡皂苷a 2.5 mg）[8]。

2.2 細胞分組、造模及給藥

低分化PC12 細胞生長于含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24 h 后，分為6 組，分別是空白組，模型組（500 μM CORT 損傷），F(xiàn)FCGF 低劑量組（50 mg·L-1），F(xiàn)FCGF 中劑量組（100 mg·L-1），F(xiàn)FCGF高劑量組（200 mg·L-1），F(xiàn)FCGF 極高劑量組（400 mg·L-1），逍遙散（XYS）組（200 mg·L-1）、給藥時間為36 h。

2.3 細胞活力的測定

給藥36 h 之后，首先移除細胞培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液100 μL，等待4 h 之后，去掉培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL，混合均勻，最后采用MTT 法于490 nm下測定吸光度值。

2.4 乳酸脫氫酶的測定

給藥36 h 之后，將培養(yǎng)液通過1000 rpm 離心機離心5 min，取離心管中的上清液，按照乳酸脫氫酶試劑盒說明書測定乳酸脫氫酶測定。

2.5 細胞凋亡測定

給藥36 h 之后，胰酶消化后收集細胞，刺激結束后，用胰酶消化細胞，收集細胞，用PBS 洗滌2次，1000 rpm 離心機離心5 min，然后丟掉上清液，重新加入PBS，通過敲打和過濾的方法制備成細胞懸浮液體，最后加入Annexin V-FITC/PI 雙染色劑，孵育時間為20 min，上機檢測。

2.6 線粒體膜電位測定

給藥36 h 之后，胰酶消化后收集細胞，用PBS 洗滌2 次，1000 rpm 離心機離心5 min，然后丟掉上清液，重新加入PBS，通過敲打和過濾的方法制備成細胞懸浮液體，加入JC-1 染色工作液，孵育時間為20 min，1000 rpm 離心機離心5 min，收集細胞，加入JC-1 染色緩沖液，上機檢測。

2.7 細胞內鈣離子的測定

給藥36 h 之后，胰酶消化后收集細胞，用DHanks 緩沖液洗滌1 次，沉淀細胞，加入Fluo-3 Am 探針37℃孵育30 min。孵育結束后，加入D-Hanks 緩沖液洗滌，沉淀細胞后，于37℃孵育30 min 后，上機檢測。

2.8 統(tǒng)計學分析

實驗數據以平均值±S.D.形式表示，使用SPSS17.0對實驗數據進行統(tǒng)計分析。通過單因素方差分析統(tǒng)計，P ＜0.05 表示具有顯著性差異，P ＜0.01 表示具有極顯著性差異。

3 結果

3.1 FFCGF 對CORT 誘導的低分化PC12 細胞活力的影響

FFCGF 對CORT 致低分化PC12 損傷細胞活力的影響如圖1 所示。模型組的細胞活力與空白組比較，細胞活力值極顯著降低。FFCGF 各給藥組（100-400 mg·L-1）與模型組比較，細胞活力值均明顯升高。結果顯示FFCGF 在100 mg·L-1出現(xiàn)統(tǒng)計學意義，且之后隨著濃度的升高其吸光度值增加幅度不大，因此后續(xù)研究中乳酸脫氫酶的測定、細胞凋亡測定、線粒體膜電位測定、細胞內鈣離子的測定均采用100 mg·L-1作為該藥物的中劑量組。研究結果同樣也表明FFCGF 給予CORT 誘導的PC12 細胞，未表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關系。

圖1 FFCGF對CORT致低分化PC12損傷細胞活力的影響

圖2 FFCGF對CORT致低分化PC12損傷細胞乳酸脫氫酶釋放率的影響

圖3 不同組Annexin V-FITC/PI雙染測凋亡流式散點圖

3.2 FFCGF 對CORT 誘導的低分化PC12 細胞乳酸脫氫酶釋放率的影響

FFCGF 對CORT 致低分化PC12 損傷細胞乳酸脫氫酶釋放率的影響如圖2所示。模型組的細胞活力與空白組比較，乳酸脫氫酶釋放率極顯著增加。FFCGF與模型組比較，乳酸脫氫酶釋放率明顯降低，并且不同濃度的FFCGF 之間無顯著性差異。實驗結果表明FFCGF 可通過降低CORT 誘導低分化PC12 細胞乳酸脫氫酶釋放率發(fā)揮保護作用。

3.3 FFCGF 對CORT 誘導低分化PC12 細胞凋亡率的影響

不同組Annexin V-FITC/PI 雙染測凋亡流式散點圖如圖3所示。散點圖左上角、右上角、右下角和左下角分別表示死亡、晚凋、早凋和正常狀態(tài)的細胞。通過散點圖我們可以發(fā)現(xiàn)模型組的細胞凋亡率與空白組比較，早凋、晚凋和死細胞增加。FFCGF 與模型組比較，早凋、晚凋和死細胞明顯降低。

圖4 FFCGF對CORT致低分化PC12損傷細胞凋亡率的影響

通過計算不同象限細胞數多少表示細胞的凋亡率結果如圖4所示。通過凋亡率結果可以發(fā)現(xiàn)模型組的細胞活力與空白組比較，細胞的凋亡率增加。FFCGF 與模型組比較，細胞的凋亡率明顯降低。實驗結果表明FFCGF 可通過降低CORT 誘導低分化PC12細胞凋亡率發(fā)揮保護作用。

3.4 FFCGF 對CORT 誘導低分化PC12 細胞線粒體膜電位的影響

不同組線粒體膜電位流式散點圖如圖5所示。通過散點圖我們可以發(fā)現(xiàn)模型組的細胞線粒體膜電位與空白組比較，線粒體膜電位極顯著降低。FFCGF 與模型組比較，線粒體膜電位都有顯著的升高。

通過計算線粒體膜電位的細胞比例結果如圖6所示。通過凋亡率結果我們可以發(fā)現(xiàn)模型組的細胞活力與空白組比較，線粒體膜電位降低的細胞數目。FFCGF 與模型組比較，線粒體膜電位降低的細胞顯著減少。實驗結果表明FFCGF 可通過降低CORT 誘導低分化PC12細胞凋亡發(fā)揮保護作用。

3.5 FFCGF 對CORT 誘導的低分化PC12 細胞鈣離子的影響

不同組鈣離子細胞流式圖如圖7所示。通過細胞流式圖我們可以發(fā)現(xiàn)模型組的鈣離子與空白組比較，細胞內游離鈣離子濃度較大。FFCGF 與模型組比較，細胞內游離鈣離子濃度減少。通過定量計算峰面積如圖8所示。通過凋亡率結果我們可以發(fā)現(xiàn)模型組的細胞活力與空白組比較，熒光強度增至40%左右。FFCGF 與模型組比較，各給藥組熒光強度均顯著下降。實驗結果表明FFCGF 可通過降低CORT 誘導低分化PC12細胞內游離鈣離子濃度發(fā)揮保護作用。

圖5 不同組JC-1探針染色測線粒體膜電位流式散點圖

圖6 FFCGF對CORT致低分化PC12損傷線粒體膜電位的影響

4 討論

不同的細胞指標都可以用于評價細胞損傷和凋亡的程度。本研究采用不同的指標對皮質酮誘導低分化PC12 抑郁細胞模型的損傷程度進行綜合評價。FFCGF 對皮質酮誘導的低分化PC12 抑郁細胞模型的保護作用也可以用這些指標綜合評價。細胞活力是體外細胞培養(yǎng)和研究中的一個重要結果[12]。細胞活力可用于評價模型復制是否成功，同時可以用于評價藥物的效應。這些指標均可為新藥研究提供重要技術支撐。乳酸脫氫酶是一種糖酵解酶，以氧化型輔酶Ⅰ（MADI）為氫受體，在細胞內催化L-乳酸與丙酮酸之間可逆反應的一種脫氫酶。當細胞膜的通透性發(fā)生變化時，細胞胞間的乳酸脫氫酶活性升高[13]，所以乳酸脫氫酶活性可以用來評價細胞的損傷和凋亡程度。

細胞凋亡是指為了維持內環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡[14]。細胞凋亡早期的特征之一是磷脂酰絲氨酸從細胞膜內轉移到細胞膜外，使磷脂酰絲氨酸暴露在細胞膜外表面。而人膜聯(lián)蛋白V（AnnexinV）對磷脂酰絲氨酸具有特異的親和作用，將Annexin V 進行熒光素——FITC 標記，作為一敏感的探針可檢測暴露在細胞膜表面的磷脂酰絲氨酸，利用流式細胞儀觀察細胞凋亡現(xiàn)象，從而可以用于研究FFCGF對細胞的保護作用。

線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件[15，16]。JC-1是一種理想的用于檢測線粒體膜電位的熒光探針，可以檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。同時，鈣離子是機體各項生理活動不可缺少的離子。它對于維持細胞膜兩側的生物電位，維持正常的神經傳導功能。鈣離子的水平的變化影響很多生命活動的變化，例如神經遞質的釋放、細胞間的信息傳遞和神經元的存活，因此可以依據鈣離子水平的變化判斷細胞的存活狀態(tài)[17，18]。

圖7 不同組Fluo-3 Am染色測鈣離子細胞流式圖

圖8 FFCGF對CORT致低分化PC12損傷細胞內鈣離子的影響

本課題研究中采用基于抑郁癥中HPA 軸活化的理論建立的細胞模型，即高濃度CORT進行刺激，并采用PC12 細胞作為應激對象。HPA 軸亢進假說是建立抑郁癥體外模型最常用的理論之一，CORT 誘導PC12細胞損傷模型已經被廣泛地應用于抗抑郁藥物的藥效及機制研究。神經細胞損傷的重要指標之一是神經細胞凋亡。鈣離子內流和線粒體膜電位丟失是評價神經細胞凋亡的具體指標。鈣離子信號通路在神經元系統(tǒng)的發(fā)育中具有至關重要的作用。在神經元中鈣離子可調節(jié)神經遞質的釋放、細胞間的信息傳遞和神經元的存活，因此測定神經元中鈣離子水平的變化是對細胞存活狀態(tài)觀察的一個重要指標。同樣，線粒體膜電位丟失是細胞早期凋亡的重要特征。線粒體膜電位的降低導致細胞色素C等釋放，活化Caspase蛋白酶家族，引起細胞凋亡級聯(lián)反應，通過檢測線粒體膜電位能夠判斷細胞是否進入不可逆的過程。本文采用流式細胞儀利用JC-1 探針對線粒體膜電位進行檢測，從另一個重要方面對藥物的保護作用進行研究。因此，抗抑郁藥物對膜電位和鈣離子濃度變化的影響，對細胞起到很好的保護作用，抑制細胞凋亡，從而可以評價藥物對神經細胞的保護作用。

本研究結果表明皮質酮誘導PC12 細胞損傷后，細胞活力指標下降，而乳酸脫氫酶釋放率、細胞凋亡率及鈣離子濃度指標升高，與已有文獻報道一致[19-21]。給予FFCGF 后對應的指標發(fā)生回調，表明FFCGF 對CORT 誘導低分化PC12 細胞損傷具有較好的保護作用。該研究結果為復方柴歸方抗抑郁藥物的成藥性評價提供了充分科學依據。