周倍伊，萬 娟，周 圍，謝金玲，鐘衛(wèi)干，楊力強，羅 眈，黃鎧琴

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西中藥藥效研究重點實驗室，廣西 南寧 530200）

造血干細(xì)胞移植技術(shù)成為有效治療多種疑難血液病的方法，也為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究帶來新的切入點。單純的造血干細(xì)胞移植技術(shù)一方面給許多絕癥患者帶來了生存的希望，另一方面因移植所帶來的并發(fā)癥導(dǎo)致的移植失敗也給患者帶來巨大風(fēng)險［1］。既往對移植失敗研究多側(cè)重在造血干細(xì)胞方面，而對造血干細(xì)胞賴以生存的造血微環(huán)境（造血龕，niche）缺乏足夠的重視［2］。實驗研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）和造血干細(xì)胞（HSC）是造血龕的構(gòu)成細(xì)胞，在“龕”內(nèi)MSCs對HSC有促增殖作用。研究還發(fā)現(xiàn)MSCs與HSC通過細(xì)胞接觸產(chǎn)生多種可溶性的和膜結(jié)合的細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞歸巢定位、增殖分化及凋亡［3］。臨床研究證明，HSC與MSCs共移植能盡快地恢復(fù)造血微環(huán)境（造血龕）的造血重建［4-5］。中醫(yī)藥副作用低，以及具有較好的調(diào)節(jié)造血微環(huán)境（造血龕）的作用［6-7］，有望成為配合治療血液病的方法之一。

復(fù)方扶芳藤合劑是廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠的產(chǎn)品，臨床用于心脾兩虛、氣血不足之證。該制劑由扶芳藤、黃芪、人參組成，有研究表明，黃芪的有效成分黃芪甲苷和人參的有效成分人參皂苷Rg1均可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）與HSC的體外增殖［8-9］。本課題前期的研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方扶芳藤合劑對大鼠BMSCs和HSC均有促增殖作用［10-11］，但對大鼠BMSCs和HSC共培養(yǎng)體外模擬的“造血龕”有何影響尚未明了。為探討不同培養(yǎng)模式體外模擬的“造血龕”中BMSCs對HSC增殖的作用，以及復(fù)方扶芳藤合劑含藥血清對“龕”內(nèi)HSC增殖的影響，本文開展如下實驗，為研究復(fù)方中藥對造血微環(huán)境（造血龕）的調(diào)節(jié)作用提供參考。

1 實驗材料

1.1 動物 SPF級健康4周齡SD大鼠120只，體質(zhì)量100±20 g，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，許可證號為SCXK（湘）2016-0002，試驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器 Attune NxT流式細(xì)胞儀（美國Invitrogen公司）；美天旎細(xì)胞手動分選儀Miltenyi MidiMACS?Starting Kit LS（德國Milteny公司）；Transwell共培養(yǎng)板（0.4μm，美國Corning公司）；GIBCO DMEM低糖液體培養(yǎng)基（美國Thermo Fisher公司，C11885500BT，LOT:8118190）；Phosphate Buffer Saline pH 7.4 basic磷酸緩沖鹽溶液（美國Thermo Fisher公司，C10010500BT，LOT:8117069）；Percoll?PLUS細(xì)胞分層液（美國Sigma公司，1002698877，LOT:#SLBX1265）；

CD90.1-APC（Thy-1.1）Monoclonal Antibody（HIS51）（美 國Thermo Fisher公 司，17-0900-82，LOT：4322557）；0.25%Trypsin-EDTA胰蛋白酶溶液（美國Thermo Fisher公司，25200-056，LOT：1859509）。

2 方法

2.1 BMSCs的原代分離培養(yǎng) 取4周齡雄性SPF級健康SD大鼠，頸椎脫臼處死，75%乙醇全身浸泡1min，無菌條件下快速去除肌肉等軟組織，取出股骨及脛骨，以75%乙醇浸泡清洗1次，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）浸泡清洗2次。無菌條件下剪去長骨的骨骺端，露出骨髓腔，用含有10%胎牛血清（FBS）的低糖液體培養(yǎng)基（L-DMEM）沖洗骨髓腔，直至骨質(zhì)發(fā)白；將沖出的骨髓內(nèi)容物制成單細(xì)胞懸液，靜置后，移取上清液至新離心管中，沉淀物用完全培養(yǎng)基重懸后種瓶，置于37°C、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 BMSCs的培養(yǎng)、純化及傳代 在原代細(xì)胞培養(yǎng)過程中，24 h后換液更換半數(shù)培養(yǎng)基，48 h后換液更換全量培養(yǎng)基。此后每2～3天全量更換1次完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底約90%時，使用胰酶-EDTA（乙二胺四乙酸）溶液消化，按1∶2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.3 BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞培養(yǎng)中，每日用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長狀況［10］。

2.4 BMSCs表面標(biāo)記物的表達(dá)鑒定 收集P3代生長良好的細(xì)胞，0.25%胰酶消化，4℃離心，1 000 r/min，3 min，PBS清洗細(xì)胞3次，細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整濃度為1×106cells/ml，各管加入100μl細(xì)胞懸液，各管依次加入單克隆抗體CD29、CD34、CD44、CD45和四染管，同時每管單染管設(shè)立陰性對照組，避光孵育15min，每管加入2m l流式緩沖液清洗3次，除去未結(jié)合抗體，300 r/min離心5min，棄上清，500μl流式緩沖液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。

2.5 HSC體外分選與生物學(xué)性狀鑒定 頸椎脫臼法處死4周齡SD大鼠，75%乙醇浸泡，超凈工作臺內(nèi)無菌取脛骨和股骨，剪開兩端骨骺，培養(yǎng)基L-DMEM反復(fù)沖洗骨髓腔，40μm篩網(wǎng)過濾，離心收集細(xì)胞。配制密度為1.087 g/m l的細(xì)胞分層液（Percoll），將骨髓細(xì)胞小心覆加于Percoll上，室溫密度梯度離心，1 000 r/min，25 min，收集中間白膜層細(xì)胞，分選緩沖液（MACS Buffer）清洗2次，離心，300 r/min，10min，細(xì)胞計數(shù)。按1×107cells/90μl MACS Buffer進(jìn)行重懸，再按1×107cells/10μl加入磁珠CD90.1，混勻，4℃孵育15min；MACSBuffer清洗2次，加入0.3μl CD90.1（Thy-1.1）Monoclonal Antibody（HIS51），4℃孵育5 min；按照1×107cells/2m l加入MACSBuffer清洗2次，300 r/min離心10 min，去上清；按照1×108cells/500μl加入MACSBuffer重懸。置LS柱于MACS（細(xì)胞手動分選儀）系統(tǒng)，加MACSBuffer 3m l潤濕LS柱，再加入前述經(jīng)Thy-1.1單抗和磁珠CD90.1標(biāo)記的細(xì)胞懸液，待其自然流下，即為Thy-1.1-細(xì)胞。使用3m lMACSBuffer清洗LS柱3次，收集所有流出液體，仍為Thy-1.1-細(xì)胞。將LS柱撤離MACS系統(tǒng)，加入5mlMACSBuffer，用配套針芯推出所有液體，收集至另一干凈試管，即為Thy-1.1+細(xì)胞。使用流式細(xì)胞儀檢測分選后細(xì)胞中Thy-1.1+細(xì)胞的百分比。分別取離心分選前后的細(xì)胞懸液10μl，加入0.4%臺盼藍(lán)染液10μl，混勻，靜置3min，取10μl細(xì)胞懸液進(jìn)行活性檢測，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.6 BMSCs與HSC共培養(yǎng) 取24孔板和Transwell用于共培養(yǎng)，在90%DMEM-F12+10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d。從第1天起每48 h收集各組HSC細(xì)胞，進(jìn)行熒光拍照，使用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況。設(shè)置分組如下。①HSC單獨培養(yǎng)組：24孔板內(nèi)單獨接種HSC；②Transwell共培養(yǎng)組：24孔板對應(yīng)規(guī)格Transwell內(nèi)單獨接種HSC于上室，接種BMSCs于下室；③2D接觸共培養(yǎng)組：24孔板內(nèi)共同接種HSC與BMSCs。每組設(shè)4個復(fù)孔，其中間充質(zhì)干細(xì)胞5×105cells/孔；HSC為1×105cells/孔。各組細(xì)胞培養(yǎng)1～7 d后，收集HSC單獨培養(yǎng)組全部細(xì)胞；收集實驗組（Transwell共培養(yǎng)組）上室全部細(xì)胞并用PBS洗滌3次；2D接觸共培養(yǎng)組吸出懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中的熒光細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和增殖情況，每孔樣本單獨離心并重懸至100μl后添加至96孔培養(yǎng)板中，每孔加入CCK-8試劑10μl，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測吸光度值，以培養(yǎng)時間為橫軸，吸光度為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。

2.7 復(fù)方扶芳藤合劑含藥血清干預(yù) 同2.6項方法，分組如下。①空白血清HSC單獨培養(yǎng)組：24孔板內(nèi)單獨接種HSC，使用空白血清干預(yù)；②空白血清Transwell共培養(yǎng)組：24孔板對應(yīng)規(guī)格Transwell內(nèi)單獨接種HSC于上室，接種BMSCs于下室，使用空白血清干預(yù)；③空白血清2D接觸共培養(yǎng)組：24孔板內(nèi)共同接種HSC與BMSCs，使用空白血清干預(yù)；④含藥血清HSC單獨培養(yǎng)組：24孔板內(nèi)單獨接種HSC，使用含藥血清干預(yù)；⑤含藥血清Transwell共培養(yǎng)組：24孔板對應(yīng)規(guī)格Transwell內(nèi)單獨接種HSC于上室，接種BMSCs于下室，使用含藥血清干預(yù)；⑥含藥血清2D接觸共培養(yǎng)組：24孔板內(nèi)共同接種HSC與BMSCs，使用含藥血清干預(yù)。每組設(shè)4個復(fù)孔，其中間充質(zhì)干細(xì)胞5×105cells/孔；HSC為1×105cells/孔。各組細(xì)胞培養(yǎng)1～7 d后，收集HSC單獨培養(yǎng)組全部細(xì)胞；收集實驗組（Transwell共培養(yǎng)組）上室全部細(xì)胞并用PBS洗滌3次；2D接觸共培養(yǎng)組吸出懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中的熒光細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和增殖情況，每孔樣本單獨離心并重懸至100μl后添加至96孔培養(yǎng)板中，每孔加入CCK-8試劑10μl，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測吸光度值，以培養(yǎng)時間為橫軸，吸光度為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。

3 結(jié) 果

3.1 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 使用全骨髓貼壁培養(yǎng)法接種骨髓細(xì)胞于培養(yǎng)瓶后觀察發(fā)現(xiàn)，鏡下檢查細(xì)胞數(shù)量多，種類雜，圓形透亮的為紅細(xì)胞且占大多數(shù)。24 h后觀察發(fā)現(xiàn)存在部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁分散生長，通過半換液去除未貼壁的細(xì)胞。48 h后觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)瓶底出現(xiàn)多個細(xì)胞集落，呈放射狀，伸出長短不一、粗細(xì)不均的突起，未出現(xiàn)融合生長，單個細(xì)胞形態(tài)呈梭形（圖1A）。繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞集落面積不斷增大，且與周邊集落逐漸融合生長，培養(yǎng)7 d后長梭形細(xì)胞集落呈漩渦狀或放射狀，同向排列（圖1B）。傳代前記錄發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞排列緊密，均勻鋪滿培養(yǎng)瓶底，約占據(jù)90%瓶底空間，部分細(xì)胞沒有生長空間，出現(xiàn)重疊或漂浮情況（圖1C）。傳代培養(yǎng)：1∶2消化傳代后，傳代細(xì)胞24 h即完全貼壁生長。細(xì)胞形態(tài)均一，呈典型梭形，旋渦狀或放射狀排列生長，細(xì)胞生長旺盛，每5 d即可傳代1次。

圖1 BMSCs形態(tài)學(xué)特征

3.2 BMSCs表面標(biāo)記物的表達(dá) 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)的第3代大鼠BMSCs均一表達(dá)CD29、CD44，陽性率分別為99.709%、99.734%，而CD34、CD45呈陰性，陽性率分別為0.114%、0.013%。見圖2。

圖2 BMSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)

3.3 大鼠CD90.1+細(xì)胞純度及鑒定 分選出的CD90.1+細(xì)胞呈球形，體積偏?。慌_盼藍(lán)拒染得出細(xì)胞存活率為97%；熒光顯微鏡下可激發(fā)綠色熒光；流式檢測細(xì)胞純度，分選后細(xì)胞純度為為99.071%。見圖3。

圖3 HSC熒光圖像與表面標(biāo)志物的表達(dá)

3.4 BMSCs與HSC共培養(yǎng)與生長曲線測定 對不同天數(shù)測得的吸光度值進(jìn)行組間比較，見表1。結(jié)果顯示：各組HSC數(shù)量均隨著培養(yǎng)時間的增加而增加（P＜0.05）；自第5 d起，Transwell共培養(yǎng)組及2D接觸共培養(yǎng)組的HSC吸光度值均高于HSC單獨培養(yǎng)組（P＜0.05）。在應(yīng)用不同共培養(yǎng)模式下，2D接觸共培養(yǎng)組細(xì)胞增殖數(shù)量最多，其對應(yīng)熒光圖像也呈現(xiàn)相似趨勢。見圖4、圖5。

表1 各組HSC吸光度比較（）

表1 各組HSC吸光度比較（）

注：與同組d1比較，①P＜0.05；與HSC單獨培養(yǎng)組比較，②P＜0.05

組 別HSC單獨培養(yǎng)組Transwell組2D接觸共培養(yǎng)組d1 0.1428±0.002 0.1440±0.007 0.1461±0.012 d3 0.1633±0.008①0.1678±0.017①0.1785±0.019①d5 0.1900±0.022①0.2346±0.028①②0.2710±0.030①②d7 0.2468±0.029①0.3199±0.031①②0.3306±0.035①②

圖4 各組HSC吸光度值隨時間的變化情況

圖5 各組HSC熒光圖像變化

3.5 復(fù)方扶芳藤合劑含藥血清干預(yù)與生長曲線測定 對共培養(yǎng)1 d、3 d、5 d、7 d的HSC樣本進(jìn)行CCK-8檢測，統(tǒng)計每一天的吸光度值并進(jìn)行組間比較（見表2、圖6），各組熒光圖像見圖7。結(jié)果顯示：含藥血清HSC單獨培養(yǎng)組吸光度值高于空白血清HSC單獨培養(yǎng)組（P＜0.05）；含藥血清Transwell組的HSC吸光度值高于空白血清Transwell組（P＜0.05）；含藥血清2D接觸共培養(yǎng)組HSC吸光度值高于空白血清2D接觸共培養(yǎng)組（P＜0.05）。以上結(jié)果說明：復(fù)方扶芳藤合劑含藥血清能進(jìn)一步增強各培養(yǎng)模式中HSC增殖能力。

圖6 經(jīng)干預(yù)后各組HSC吸光度值隨時間的變化情況

4 討 論

國內(nèi)外研究證明，HSC與MSCs共培養(yǎng)的二維（2D）和三維培養(yǎng)體系均可以體外模擬造血龕，在一定程度上都可反映造血龕的功能。三維模擬造血龕在空間上更與體內(nèi)造血龕相近，但是不利于細(xì)胞回收作進(jìn)一步分析。二維模擬造血龕體系，MSCs屬貼壁細(xì)胞，HSC屬非貼壁細(xì)胞，所以容易分離細(xì)胞作進(jìn)一步研究［12-15］。目前國內(nèi)外公認(rèn)的，研究最多的造血龕有三種：HSC與MSCs組成的造血龕、HSC與成骨細(xì)胞組成的造血龕以及由HSC與內(nèi)皮細(xì)胞組成的造血龕。無論從臨床運用，還是體外二維、三維模擬造血龕都以HSC與MSCs最多。臨床研究發(fā)現(xiàn)，HSC與MSCs共移植治療惡性血液病，可以加快骨髓造血干細(xì)胞微環(huán)境（造血龕）造血功能的重建，能促進(jìn)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能，降低最主要的并發(fā)癥——移植物抗宿主?。℅VHD）的發(fā)生，提高造血干細(xì)胞移植成功率［2］。實驗研究證明，是間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）和造血干細(xì)胞（HSC）構(gòu)成造血龕，“龕”內(nèi)細(xì)胞MSCs數(shù)量增多時HSC數(shù)量增多，MSCs對HSC有促增殖作用。MSCs與HSC通過細(xì)胞接觸產(chǎn)生多種可溶性的和膜結(jié)合的細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞歸巢定位、增殖分化及凋亡［3］。本實驗中HSC+BMSCs Transwell共培養(yǎng)組HSC吸光度值高于HSC單獨培養(yǎng)組HSC吸光度值（P＜0.05）；HSC+BMSCs 2D接觸共培養(yǎng)組HSC吸光度值高于Transwell共培養(yǎng)組（P＜0.05）。實驗證明BMSCs+HSC共培養(yǎng)組均能促進(jìn)HSC增殖，BMSCs+HSC接觸共培養(yǎng)促HSC增殖效果最明顯。

表2 經(jīng)干預(yù)后各組HSC吸光度值的變化情況（）

表2 經(jīng)干預(yù)后各組HSC吸光度值的變化情況（）

注：與空白血清HSC單獨培養(yǎng)組比較，①P＜0.05；與空白血清Transwell組比較，②P＜0.05；與空白血清2D接觸共培養(yǎng)組比較，③P＜0.05

組 別空白血清HSC單獨培養(yǎng)組含藥血清HSC單獨培養(yǎng)組空白血清Transwell組含藥血清Transwell組空白血清2D接觸共培養(yǎng)組含藥血清2D接觸共培養(yǎng)組d1 0.1397±0.004 0.2014±0.019①0.1414±0.006 0.2163±0.020②0.1421±0.011 0.2208±0.023③d3 0.1685±0.007 0.2644±0.021①0.1738±0.015 0.3113±0.025②0.2201±0.021 0.4346±0.034③d5 0.2054±0.011 0.3147±0.029①0.2430±0.019 0.4744±0.039②0.2781±0.032 0.6317±0.047③d7 0.2547±0.016 0.3878±0.033①0.3314±0.029 0.6125±0.041②0.3392±0.035 0.7287±0.052③

中醫(yī)推測認(rèn)為，BMSCs是“脾腎相關(guān)”細(xì)胞層次的表達(dá)形式，但究其實質(zhì)仍屬于“先天之精”范疇［16］。唐宗海在《血證論·藏府病機(jī)論》中提出：“心之能事，又主生血，而心竅中數(shù)點血液，則又血中之最精微者，乃生血之源泉，亦出神之淵海。”［17］其對“血中之最精微者”“生血之源泉”的描述與現(xiàn)在的外周血HSC極為相似。中醫(yī)認(rèn)為，“脾為氣血生化之源，為后天之本”“后天濟(jì)先天”“精氣互化”“精血相生”［18］，所以中醫(yī)在臨床上對血液病的治療多以補腎填精、益氣健脾的扶正固本方法為主。本實驗中，復(fù)方扶芳藤合劑含藥血清干預(yù)的Transwell共培養(yǎng)組HSC吸光度值高于空白血清干預(yù)的Transwell共培養(yǎng)組（P＜0.05）；復(fù)方扶芳藤合劑含藥血清干預(yù)的2D接觸共培養(yǎng)組HSC吸光度值高于Transwell共培養(yǎng)組（P＜0.05），說明BMSCs與HSC共培養(yǎng)使BMSCs對HSC有促增殖作用，復(fù)方扶芳藤合劑含藥血清的干預(yù)加強了這種促增殖作用，為我們進(jìn)一步研究復(fù)方中藥對造血微環(huán)境（造血龕）的調(diào)節(jié)作用提供參考。

圖7 經(jīng)干預(yù)后各組1、3、5、7 d的HSC熒光圖像