王小琴 王嵐

430061 武漢，湖北省中醫(yī)院/湖北省中醫(yī)藥研究院/湖北中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科(王小琴)；430061 武漢，湖北中醫(yī)藥大學第一臨床學院(王嵐)

慢性腎臟病(CKD)因其高發(fā)病率、高致殘率、高醫(yī)療費業(yè)已成為危害全球人類健康的公共衛(wèi)生問題。礦物質(zhì)骨代謝異常(mineral and bone disorder，MBD)作為CKD3-5期繼發(fā)的嚴重并發(fā)癥，其發(fā)病機制尚未完全闡明。盡管活性維生素D、磷結(jié)合劑、擬鈣劑等藥物以及甲狀旁腺手術(shù)等在CKD-MBD中得到廣泛應(yīng)用，但MBD仍然是導(dǎo)致CKD患者繼發(fā)心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)甚至死亡的主要危險因素[1]。中醫(yī)認為人體骨骼生長發(fā)育與腎臟的關(guān)系最為密切，提出了“腎主骨”理論，并在長期的臨床實踐中得到驗證。但如何運用現(xiàn)代醫(yī)學知識理解它、用分子生物學技術(shù)解析它，通過中西醫(yī)理念與技術(shù)的整合互補，深入研究(chronic kidney disease-mineral and bone disorder，CKD-MBD)的發(fā)病機制及治療手段，是一個值得深入探討的問題。

一、“腎主骨”理論的起源及意義

中醫(yī)理論認為人體骨骼的生長發(fā)育與腎臟的關(guān)系最為密切，這一理論思想首次出現(xiàn)在成書于公元前一世紀的《黃帝內(nèi)經(jīng)》中。《黃帝內(nèi)經(jīng)》的第一章《素問 上古天真論》指出，“女子七歲，腎氣盛，齒更發(fā)長……三七，腎氣平均，故真牙生而長極。四七，筋骨堅，發(fā)長極，身體盛壯”?！罢煞虬藲q，腎氣實，發(fā)長齒更……三八，腎氣平均，筋骨勁強，故真牙生而長極；四八，筋骨隆盛，肌肉滿壯；五八，腎氣衰，發(fā)墮齒槁……七八，腎藏衰，形體皆極；八八，則齒發(fā)去。” 首次認識到生命的生長規(guī)律與骨骼的發(fā)育周期高度一致，而這一過程由腎臟產(chǎn)生的精氣所主宰，即所謂“腎藏精而主骨”[2-3]，簡稱“腎主骨”理論。

腎藏精而主骨有兩重涵義。從廣義的角度說，腎中藏有精氣。腎精包括先天之精和后天之精，它部分取決于先天稟賦和遺傳因素，部分來源于后天環(huán)境的補充。腎精是人生長、發(fā)育、生殖和各種功能活動(包括骨骼發(fā)育)的物質(zhì)基礎(chǔ)。腎精生成腎氣，腎氣分為腎陰和腎陽。腎陽促進和推動生長，腎陰則滋養(yǎng)和濡潤各器官。二者相互制約，相互依存，其中的精細調(diào)控保證身體機能處于不斷變化但又時刻平衡的狀態(tài)。腎精的虛損或陰陽平衡的破壞可以直接影響各種慢性疾病的發(fā)展，并加速人的衰老。從狹義的角度說，腎精對骨骼的發(fā)育極其重要。腎中精氣充盈，才能充養(yǎng)骨髓，強壯骨質(zhì)。小兒囟門遲閉，骨軟無力，以及老人骨質(zhì)疏松，易于骨折，都與腎中精氣不足有關(guān)。

基于這個理論，中國的歷代醫(yī)家多注重采用補腎益精法治療各種骨骼疾病和慢性病，并用于延緩衰老，已取得了滿意的臨床療效。例如，具有補腎強骨作用的骨碎補，能促進骨折愈合，改善骨折相關(guān)癥狀。具有補腎陽作用的黃芪、仙茅、淫羊藿、巴戟天、肉蓯蓉、杜仲、補骨脂、菟絲子、續(xù)斷，以及具有補腎陰作用的女貞子等中草藥對骨質(zhì)疏松具有一定的治療作用[4]。在發(fā)生骨折的最初6個月內(nèi)，采用中醫(yī)藥治療的患者，與非中藥治療者相比，癥狀改善加快，住院醫(yī)療花費減少，而且合并冠狀動脈疾病、慢性阻塞性肺疾病、糖尿病、高血壓及腦卒中患者的發(fā)病率明顯降低[5-6]。臨床采用具有補腎壯骨功效的中草藥治療CKD，發(fā)現(xiàn)其療效機制與調(diào)節(jié)鈣磷代謝有關(guān)。Chung-Yu Huang等[7]在中國臺灣進行了一項關(guān)于2型糖尿病患者使用中醫(yī)藥的流行病學研究，從1998至2008年間隨機抽取的100萬人中包含40 136例2型糖尿病病例，其中31 289例(78.0%)至少一次在門診使用過中醫(yī)藥，4 351例(10.8%)使用中醫(yī)藥為主治療糖尿病。在排名前幾名的中藥處方中，包括知柏地黃丸、杞菊地黃丸、濟生腎氣丸、八味腎氣丸，它們幾乎全部由六味地黃丸衍生而來，而六味地黃丸是公認的補腎名方；較多臨床及實驗研究證實其具有調(diào)節(jié)鈣磷代謝、促進骨骼生長的作用[7-8]。

二、“腎主骨”與腎-骨內(nèi)分泌軸

腎藏精而主骨是一個古老的理念，在長期的臨床實踐中已得到了驗證。但是，如何運用現(xiàn)代醫(yī)學的生化知識和分子機制來理解它，一直是一個值得探討的問題。腎臟作為活性維生素D生成的主要場所、骨骼作為調(diào)磷激素生成的重要器官，兩者通過分泌眾多內(nèi)分泌因子并相互應(yīng)答，在維護機體鈣磷穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。如骨形成蛋白7(BMP-7)作為腎-骨連接的信號因子，雖然在促進腎臟和成骨細胞發(fā)育過程中起重要作用，而在CKD中，BMP-7減少可加速腎臟、骨骼病變及血管鈣化的進展[9]。近年來，腎-骨內(nèi)分泌軸的發(fā)現(xiàn)，對我們理解“腎主骨”理論提供了進一步的線索。這個腎-骨對話是通過骨骼分泌的成纖維細胞生長因子23(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF23)和腎臟合成的α-klotho(以下簡稱Kl)基因來實現(xiàn)的。

1997年Kuro-o等[10]首次發(fā)現(xiàn)Kl在腎臟強表達，其編碼的Kl蛋白位于腎小管上皮細胞膜上，為膜型Kl，而胞外結(jié)構(gòu)域被剪切后進入血液循環(huán)，成為可溶性Kl(soluble Kl，sKl)。Kl基因缺陷動物表現(xiàn)出骨質(zhì)疏松、生長緩慢、異位鈣化及早衰等[11]。2000年White等[12]首次在常染色體顯性遺傳佝僂病(ADHR)患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)由骨骼分泌的FGF23的基因變異，導(dǎo)致其裂解障礙而使循環(huán)中FGF23升高，引起低磷血癥、骨質(zhì)疏松、異位鈣化及矮小癥等。這些研究發(fā)現(xiàn)Kl與FGF23基因缺陷表型相似，提示兩者之間存在共同的信號傳導(dǎo)路徑。Urakawa等[13]通過研究發(fā)現(xiàn)Kl與FGF23存在受體與配體關(guān)系，從此開啟了骨-腎內(nèi)分泌軸研究的序幕。隨后不斷有報道證實，腎小管上皮細胞分泌的膜型Kl經(jīng)FGF受體1(FGF receptor，F(xiàn)GFR 1)自身攜帶的絡(luò)氨酸激酶介導(dǎo)，與FGFR1結(jié)合形成Kl/FGFR1二元復(fù)合物；經(jīng)細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)磷酸化介導(dǎo)，與FGF23結(jié)合形成Kl/FGFR1/FGF23三元復(fù)合物；通過誘導(dǎo)腎臟24-羥化酶(CYP24)表達，抑制α羥化酶(CYP27B1)表達，平衡活性維生素D的生成與降解，并調(diào)節(jié)甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)的釋放，從而在腎-骨-甲狀旁腺之間形成一個正負反饋調(diào)節(jié)環(huán)路，將細胞外鈣磷濃度控制在一個精確的范圍。在CKD患者中，因腎臟結(jié)構(gòu)和功能受損，Kl表達下降，對FGF23的應(yīng)答減弱，鈣磷平衡的調(diào)節(jié)機制被打斷，最終導(dǎo)致骨骼異常礦化和血管異位鈣化[14]。

目前有多種假設(shè)解釋骨骼分泌FGF23的啟動機制。Knab等[15]采用C57BL及ADHR小鼠模型，給予PTH皮下注射，發(fā)現(xiàn)2 h后血C端-FGF23片段(C-terminal FGF，cFGF23)及全段FGF23(Intact FGF，iFGF23 )較假注射組顯著升高，但在2 h后即開始下降，特別是在6 h后，iFGF23的下降與PTH呈劑量依賴關(guān)系；小鼠股骨FGF23mRNA、骨骼裂解液FGF23蛋白表達，在注射PTH 2 h后明顯增強，但隨著時間延長逐漸減弱，說明PTH參與調(diào)節(jié)骨骼分泌FGF23的作用極為有限。Andrukhova等[16]采用膜型Kl單基因和膜型Kl/FGF23雙基因敲除小鼠，給予sKl或聯(lián)合重組FGF23，均不能誘導(dǎo)動物模型鈣磷濃度的變化，說明sKl不能代替膜型Kl與FGF23產(chǎn)生應(yīng)答效應(yīng)。血磷作為腎-骨環(huán)路中的效應(yīng)因子，同時又是重要的主動調(diào)節(jié)因子。較多的研究表明，升高血磷能明顯誘導(dǎo)骨骼分泌FGF23，進一步的研究證實，其作用機制是在轉(zhuǎn)錄后對FGF23的表達進行調(diào)控，而非誘導(dǎo)FGF起始轉(zhuǎn)錄；雖然在細菌和酵母菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)磷感受體(磷結(jié)合蛋白PstS)參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外鈣磷濃度，但尚未在人體證實骨骼細胞的磷感受體[17]。1，25(OH)2VitD3作為Kl/FGFR1/FGF23復(fù)合物調(diào)控的下游產(chǎn)物，在腎臟合成分泌后進入血液循環(huán)，通過與靶器官細胞核中配體依賴性維生素D受體(VDR)結(jié)合，發(fā)揮多種生物學效應(yīng)。其中在腸道1，25(OH)2VitD3與VDR結(jié)合，促進鈣磷吸收，在骨骼則調(diào)節(jié)礦化動態(tài)平衡；研究表明循環(huán)1，25(OH)2VitD3升高能明顯誘導(dǎo)骨骼FGF23表達增加[18]。這些研究說明FGF23的合成與分泌受多種因素調(diào)控，其中1，25(OH)2VitD3與骨骼的相互應(yīng)答是核心環(huán)節(jié)。

1，25(OH)2VitD3在腎臟合成分泌后進入循環(huán)，通過與靶器官細胞核中配體依賴性VDR結(jié)合，發(fā)揮多種生物學效應(yīng)。其中在腸道1，25(OH)2VitD3與VDR結(jié)合，促進鈣磷吸收，在骨骼則調(diào)節(jié)礦化動態(tài)平衡；研究表明循環(huán)1，25(OH)2VitD3升高能明顯誘導(dǎo)骨骼FGF23表達增加[18]。當游離的1，25(OH)2VitD3以彌散方式進入細胞后，轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，與VDR結(jié)合形成復(fù)合物，引起VDR磷酸化，轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨问降腣DR，與維甲酸受體(RXR)形成異二聚體，進一步與靶基因啟動子區(qū)域VDR反應(yīng)元件(VDREs)結(jié)合，從而啟動靶基因轉(zhuǎn)錄。Yu等[19]采用VDR基因敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)動物模型出現(xiàn)低磷低鈣血癥，而在血中幾乎檢測不到FGF23；在正常小鼠模型，經(jīng)1，25(OH)2VitD3干預(yù)后，F(xiàn)GF23 mRNA表達升高80倍，經(jīng)1，25(OH)2VitD3處理的骨肉瘤細胞FGF23 mRNA 增加78倍。Saini等[20]采用正常小鼠顱骨細胞及小鼠骨肉瘤細胞(UMR-106)作為模型，結(jié)果顯示，經(jīng)10 nmol/L濃度的1，25(OH)2D3處理的正常小鼠骨骼細胞FGF23 mRNA表達增加了5倍，而UMR-106細胞FGF23 mRNA增加了2 000倍以上；在所有被檢測的轉(zhuǎn)錄因子中，VDRmRNA表達最為強烈；說明1，25(OH)2D3通過增加VDR蛋白及VDREs，刺激FGF23基因表達；進一步采用凝膠遷移技術(shù)(EMSA)對32P-標記的候選VDREs進行分析，結(jié)果表明VDR/RXR對1，25(OH)2D3的親和性最強。這些研究證實骨骼通過核受體VDR/RXR對腎臟合成的1，25(OH)2D3做出應(yīng)答，從而啟動FGF23合成與分泌。腎骨甲狀旁腺應(yīng)答環(huán)路如圖1所示。

三、中醫(yī)理論指導(dǎo)下的CKD-MBD研究

因Kl基因表達下降所導(dǎo)致的MBD與腎精虛損所表現(xiàn)的發(fā)育遲緩、骨骼痿軟、早衰等臨床表型十分吻合，認為腎主骨是通過腎臟分泌的Kl與骨骼分泌的FGF23相互應(yīng)答、共同完成的。在CKD中，因腎臟結(jié)構(gòu)和功能受損，Kl基因表達下降，即腎精不足，腎氣生成減少，主骨功能減弱，即Kl與骨骼分泌的FGF23應(yīng)答障礙。陰陽失衡，則為 1，25(OH)2VitD3與 24，25(OH)2VitD3的生成與降解失衡，鈣磷穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機制被打亂，臨床表現(xiàn)出腎虛骨弱之證，即腎性骨病。而濁毒內(nèi)蘊，表現(xiàn)為血中FGF23升高、低鈣高磷或高鈣高磷血癥、尿毒癥毒素蓄積等。濁毒瘀血傷及血脈，脈絡(luò)瘀阻，即為血管等軟組織對FGF23產(chǎn)生了錯誤應(yīng)答，導(dǎo)致血管鈣化，最終引起CVD等致命并發(fā)癥。有學者采用 PCR聯(lián)合直接測序方法，對67例2型糖尿病引起的糖尿病腎臟病患者Kl-G-395A 位點單核苷酸多態(tài)性進行檢測，以56 例 2型糖尿病非腎臟病患者及55 例健康志愿者作為對照。結(jié)果表明A等位基因是2型糖尿病繼發(fā)腎臟病的獨立危險因素；GA及AA 基因型是糖尿病腎臟病的易感基因；而A等位基因與脾腎陽虛證有顯著的相關(guān)性[21]。

一項中藥復(fù)方制劑天芪降糖膠囊(黃芪、天花粉、女貞子、石斛、人參、地骨皮、黃連(酒蒸)、山茱萸、墨旱蓮、五倍子)治療420例糖耐量異?；颊叩碾S機雙盲對照研究表明，經(jīng)12個月的治療，中藥組較安慰劑組患糖尿病的風險減少32.1%，說明補腎壯骨中藥對糖尿病有一定的預(yù)防作用[22]。腎元顆粒由生黃芪、淫羊藿、酒制大黃組成，具有補腎壯骨、通腑泄?jié)峁π23]，隨機對照臨床研究表明其在改善CKD患者的臨床癥狀、糾正低鈣血癥、穩(wěn)定腎功能方面明顯優(yōu)于對照藥物[24]。采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù)，以《中國藥典》規(guī)定的黃芪、淫羊藿及酒大黃主要藥性成分的單體標準品(黃芪甲苷、淫羊藿苷、大黃酚、大黃酸、大黃素)為對照，給予大鼠該復(fù)方中藥灌胃，將含藥血清與空白血清、標準品進行比較，結(jié)果顯示該制劑吸收進入血液的藥效物質(zhì)主要包括淫羊藿苷、黃芪甲苷、大黃素等，其含量分別為0.87 μg/mL，0.76 μg/mL，13.6 μg/mL[25]。在高糖環(huán)境下，發(fā)現(xiàn)該含藥血清能明顯誘導(dǎo)人腎小管上皮細胞(HK-2)Kl表達上調(diào)，協(xié)同增加FGF23誘導(dǎo)的Kl與FGFR1表達及共表達，調(diào)節(jié)下游CYP24、p-ERK1/2及 CYP27B1表達[26-27]。在鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)及高磷飲食誘導(dǎo)的糖尿病腎病小鼠模型中，補腎壯骨、通腑泄?jié)嶂兴幠苊黠@降低尿白蛋白排泄、降低血FGF23水平，糾正低鈣高磷，其機制與增強腎臟Kl 與 FGFR1表達及共表達、抑制CYP24、CYP27B1 及p-ERK1/2表達有關(guān)；進一步觀察到胸主動脈鈣鹽沉積減輕、脛骨骨膜下軟骨細胞病變得到一定程度修復(fù)[28-29]。在5/6腎切除加高磷飲食大鼠模型中，Kl、BMP-7 mRNA及蛋白在腎皮質(zhì)小管表達較正常組明顯降低，與血鈣濃度呈正相關(guān)，與血磷水平呈負相關(guān)；采用補腎壯骨、通腑泄?jié)嶂兴幐深A(yù)后，血磷及堿性磷酸酶水平明顯下降，腎臟Kl、BMP-7 mRNA及蛋白表達增加，骨密度得到明顯改善[30-31]。這些研究證實在“腎主骨”理論指導(dǎo)下，采用的補腎壯骨、通腑泄?jié)岱ㄖ委烠KD-MBD的作用機制，與增強腎臟Kl與骨骼FGF23之間的應(yīng)答有關(guān)。

四、研究展望

盡管Kl與FGF23的應(yīng)答機制能夠部分解釋腎主骨的科學內(nèi)涵及CKD-MBD的發(fā)病機制，但Kl與FGF23調(diào)控的核心環(huán)節(jié)是平衡活性維生素D的生成與降解，而活性維生素D作用的靶器官除了骨骼以外還有腸道、甲狀旁腺，因此，腎-腸-骨-甲狀旁腺這一大內(nèi)分泌軸在CKD-MBD發(fā)病機制中的調(diào)節(jié)機制仍有待闡明；BMP-7作為腎骨發(fā)育重要的調(diào)節(jié)因子，在CKD-MBD中確切的作用機制及與腎-骨軸的關(guān)系有待進一步研究；中醫(yī)藥療法對CKD-MBD的作用靶點除了腎-骨軸外，對腎-腸-骨-甲狀旁腺內(nèi)分泌軸的影響也有待進一步探討。希望在未來通過中西醫(yī)理念與技術(shù)的整合互補，深入解析CKD-MBD的發(fā)病機制，發(fā)掘更有效的作用靶點，并基于這些靶點，開發(fā)安全有效、作用機制明確的中藥制劑或中藥有效成分，豐富中西醫(yī)結(jié)合防治CKD-MBD的理論與實踐。