趙艷龍，田普訓(xùn)，程小紅，丁晨光，田 耘，于小勇，史 健，徐 薇，張 鵬，宋阿苗

1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院腎病醫(yī)院血液透析室（西安710003）；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟病醫(yī)院腎移植科（西安710061）；3.陜西省中醫(yī)醫(yī)院腎病醫(yī)院腎病科（西安710003）

腎缺血再灌注損傷 （Ischemia reperfusion injury，IRI）與急性腎損傷、慢性腎臟病及腎纖維化、移植腎急慢性排斥、移植腎功能延遲恢復(fù)等疾病的發(fā)病密切相關(guān)，有較高的發(fā)病率和病死率，目前仍缺乏有效的干預(yù)措施。DNA甲基化是一種表觀修飾方式，參與基因表達(dá)調(diào)整，與IgA腎病、慢性腎臟病的纖維化進(jìn)展、糖尿病腎病等密切相關(guān)［1－4］。抑制DNA甲基化可能減低或阻止IRI導(dǎo)致的急性腎損傷（Acute kidney injury，AKI）向慢性腎臟病（Chronic kidney disease，CKD）進(jìn)展的纖維化過程，但抑制DNA甲基化對(duì)早期腎IRI的影響未見報(bào)道。DNA甲基化參與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等病理過程［5－7］，而氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)是腎IRI發(fā)病的重要病因，因此，我們推測(cè)干預(yù)DNA甲基化可能成為防治腎IRI的新策略或新方法。

地西他濱（Decitabine，DCA），即5－脫氧雜氮胞苷（5－aza－2deoxycytidine），是臨床上治療骨髓增生異常綜合征、慢性粒細(xì)胞白血病和急性髓性白血病等疾病的常用藥物［8］，屬于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（DNA methyltransferases，Dnmts），主要作用于增殖期（S期）細(xì)胞，使高甲基化的抑癌基因恢復(fù)正常的去甲基狀態(tài)，從而重新激活這些抑癌基因，發(fā)揮抑癌功能，恢復(fù)細(xì)胞正常終末分化［9－10］、肺炎［11－12］。有報(bào)道 DCA 可以增強(qiáng)腦對(duì)IRI的抵抗［13］，因此，我們將DCA用于腎IRI，探索其治療腎IRI的可能。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性C57BL／6小鼠（8～10周，20～25g）購買并飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF動(dòng)物房，溫度20～26℃；相對(duì)濕度50%～80%，白天、夜晚時(shí)間均為12h，自由接觸水和飼料。

2 主要試劑 胎牛血清（Gibco公司）；DMEM／F12培養(yǎng)基（Hyclone公司）；地西他濱DCA（Pharmachemie B.V.）；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（博士德公司）；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物）；羊抗鼠PCNA一抗（abcam公司）；大鼠抗小鼠Ly6B一抗（AbD Serotec）；調(diào)整性 T淋巴細(xì)胞（Treg）檢測(cè)試劑盒（ebioscience公司）；流式抗體：PE標(biāo)記抗鼠F4／80、PerCP標(biāo)記抗鼠CD206（ebioscience公司）；Tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Roche公司）；膠原酶Ⅳ、DNA酶Ⅰ（Worthington公司）；小鼠淋巴細(xì)胞分離液（Cedarlane公司）。

3 體外HK－2培養(yǎng)及MTT檢測(cè) 用含100ml／L胎牛血清的完全培養(yǎng)基懸浮HK－2細(xì)胞，接種到培養(yǎng)皿中，輕輕吹打混勻，37℃50ml／L CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的HK－2細(xì)胞，以2.0×103cells／孔接種于96孔板，每孔100μl細(xì)胞懸液，同時(shí)設(shè)空白組，37℃培養(yǎng)過夜，每孔再加入10μl MTT，37℃孵育4h，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光值A(chǔ)568，判斷不同劑量DCA對(duì)腎小管上皮細(xì)胞增殖的影響。

4 HK－2凋亡檢測(cè)及缺氧－復(fù)氧模型建立 HK－2細(xì)胞以每孔5×105個(gè)接種于細(xì)胞培養(yǎng)6孔板，37℃、50ml／L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，更換含不同DCA濃度的培養(yǎng)基處理72h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度DCA對(duì)HK－2凋亡的影響；上述條件培養(yǎng)的細(xì)胞再予缺氧培養(yǎng)（20ml／L O2，930ml／L N2，50ml／L CO2）24h及復(fù)氧培養(yǎng)6h后，建立缺氧－復(fù)氧（A／R）或A／R＋DCA模型。

5 小鼠腎IRI建立及DCA干預(yù) 20g／L水合氯醛按小鼠體重（0.02ml／g）腹腔注射麻醉，肋下脊柱兩側(cè)備皮1.5cm2，切口采用脊柱旁0.5cm、肋下0.5cm、平行脊柱的雙側(cè)切口，長1cm。先行左側(cè)切口，提取腎臟，鈍性分離腎蒂，暴露血管，無損傷血管夾夾閉左側(cè)腎動(dòng)脈30min，使腎臟缺血。同法暴露右腎及血管，0號(hào)線結(jié)扎血管，切除右腎，間斷縫合皮下及皮膚。左腎血管夾閉到30min后，去掉血管夾，使腎臟再灌注，見腎臟變紅后回納腹腔，縫合（IRI組）。假手術(shù)組（Sham）除夾閉血管步驟外，執(zhí)行相同的手術(shù)過程。DCA組為建立IRI手術(shù)前4d應(yīng)用DCA［溶于PBS中，0.1mol／L，按 DCA0.5mg／（kg·d）腹腔注射］預(yù)處理C57BL／6小鼠，行腎IRI，術(shù)后DCA繼續(xù)干預(yù)2d。

6 樣本收集及檢測(cè) 每組6～8只小鼠，腎IRI后2d處死小鼠，抗凝全血400g，室溫，離心10min，取上層血清，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定腎功血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）。1／3腎組織40g／L多聚甲醛固定后石蠟包埋。4μm切片用于 HE染色和凋亡細(xì)胞（Tunel染色）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的免疫熒光染色及嗜中性粒細(xì)胞（Ly6B）的免疫組化染色。其余腎組織膠原酶Ⅳ消化后，淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg、M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)。

7 病理觀察及判定 每只小鼠4張切片，每張切片隨機(jī)于400×視野下選擇10個(gè)非重復(fù)視野。HE染色結(jié)果的病理學(xué)評(píng)分：根據(jù)皮髓交界以及外髓質(zhì)部位的損傷腎小管細(xì)胞壞死、小管腔膨脹、微絨毛脫落及管型形成等病理改變的比例進(jìn)行小管損傷程度評(píng)分：0分，未見；1分，＜10%；2分，10%～25%；3分，25%～50%；4分，50%～75%；5分，75%～100%。免疫熒光染色：計(jì)數(shù)每個(gè)400×視野下陽性的細(xì)胞數(shù)。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 選用 Graph Pad Prism 6統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多個(gè)樣本均數(shù)比較采用方差分析，三個(gè)樣本間兩兩比較采用Newman－keuls法（q檢驗(yàn)），多個(gè)樣本間兩兩比較涉及重復(fù)測(cè)量時(shí)用Bonferroni校正。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 低劑量的DCA體外抑制HK－2細(xì)胞凋亡 不同劑量DCA干預(yù)體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞系HK－2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著劑量增加HK－2細(xì)胞增殖明顯受到抑制，其凋亡也逐步增加（P＜0.05或0.01）（圖1A、B、C）。低劑量的DCA對(duì) A／R（模擬體內(nèi)IRI過程）誘導(dǎo)的HK－2細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用（F＝338.30，P＜0.01）（圖1D、E）。見表1、2。

表1 不同濃度DCA對(duì)HK－2細(xì)胞增殖及凋亡影響

2 DCA減輕腎IRI 與假手術(shù)組比較（sham組），模型組（IRI組）SCr、BUN 明顯升高（P＜0.01）；而DCA干預(yù)組腎功較IRI組明顯下降（P＜0.01）（圖2A、B）。病理學(xué)檢查亦提示DCA的腎臟保護(hù)作用，IRI導(dǎo)致嚴(yán)重的腎小管上皮細(xì)胞的凋亡、壞死、擴(kuò)張及刷狀緣脫落，但DCA組上皮細(xì)胞損傷程度輕于IRI組（P＜0.05）（圖2C、D）。見表3。

表2 DCA對(duì)缺氧－復(fù)氧（A／R）誘導(dǎo)的HK－2細(xì)胞凋亡影響

表3 各組腎功能及腎小管損傷評(píng)分

圖1 DCA對(duì)HK－2細(xì)胞增殖及凋亡的影響

圖2 DCA改善腎IRI小鼠腎功及病理損傷

3 DCA減低腎IRI小鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡體內(nèi)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與IRI組比較，DCA同樣減低了腎小管上皮細(xì)胞凋亡（P＜0.01）（圖3A、B）。應(yīng)用PCNA為標(biāo)記反映腎小管細(xì)胞的增殖狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)與IRI組比較，DCA并未促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖（P＝0.15）（圖3C、D）。見表4。

表4 各組腎小管上皮細(xì)胞凋亡及增殖情況

4 DCA減低腎IRI小鼠腎組織嗜中性粒細(xì)胞浸潤，增加Treg、M2型巨噬細(xì)胞表達(dá) 各組腎組織嗜中性粒細(xì)胞染色提示，DCA減低IRI腎組織嗜中性粒細(xì)胞浸潤（P＜0.05或0.01）（圖4A、B）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，腎IRI環(huán)境下，DCA可以促進(jìn)腎組織Treg擴(kuò)增及M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)（P＜0.01）（圖4C、D、E、F）。見表5。

表5 各組腎組織中嗜性粒細(xì)胞、Treg及M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)

討 論

DNA甲基化是基因表達(dá)的重要調(diào)控機(jī)制，與IgA腎病、慢性腎臟病的纖維化進(jìn)展、糖尿病腎病等密切相關(guān)。有研究報(bào)道，腎IRI過程中亦有DNA甲基化參與［14－15］。地西他濱（Decitabine，DCA）為 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，使高甲基化的抑癌基因恢復(fù)正常的去甲基狀態(tài)，從而重新激活這些抑癌基因，發(fā)揮抑癌功能，恢復(fù)細(xì)胞的正常分化。DCA除臨床上用于腫瘤治療外，基礎(chǔ)研究提示DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑能影響炎癥反應(yīng)過 程［5－7，10－12，16］。而 細(xì)胞凋亡、再生及炎癥反應(yīng)是腎IRI的重要特征。因此，DCA可能對(duì)腎IRI過程存在影響，但未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究把抗腫瘤藥物DCA應(yīng)用于腎IRI過程，旨在探索其對(duì)腎IRI的影響，為開辟新的治療策略提供依據(jù)。

DCA摻入DNA，抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，引起DNA低甲基化和細(xì)胞分化或凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用。我們實(shí)驗(yàn)中，DCA針對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的體外研究提示隨著劑量的增加腎小管上皮細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，且隨劑量增加其誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡作用也逐步增加。但是，能導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞HK－2凋亡的DCA對(duì)缺氧－復(fù)氧誘導(dǎo)的HK－2細(xì)胞凋亡反而起到保護(hù)作用。這提示DCA可能對(duì)腎IRI存在保護(hù)作用。

DCA具有骨髓抑制（導(dǎo)致中性粒細(xì)胞、血小板減低）及致房顫，咳嗽、腹瀉、便秘等副作用［9］。我們實(shí)驗(yàn)過程中，所有小鼠均未發(fā)現(xiàn)明顯的腹瀉、便秘、出血等副作用，結(jié)合臨床上低劑量DCA應(yīng)用劑量為10～30mg／m2、正常劑量為40～50mg／m2及相關(guān)文獻(xiàn)在小鼠上的應(yīng)用［8，10］，我們給腎IRI小鼠腹腔注射劑量為0.5mg／kg，屬于低劑量應(yīng)用。在低劑量DCA干預(yù)腎IRI小鼠模型的研究中，我們觀察到小鼠腎功較模型組明顯改善，同時(shí)組織學(xué)檢查也發(fā)現(xiàn)低劑量的DCA減低了IRI小鼠腎小管上皮細(xì)胞的刷狀緣脫落、凋亡、壞死，結(jié)合體外研究結(jié)果，進(jìn)一步確定DCA對(duì)腎IRI具有保護(hù)作用。

圖3 DCA減低腎IRI小鼠腎小管細(xì)胞凋亡

圖4 DCA減低腎IRI小鼠腎組織嗜中性粒細(xì)胞浸潤，增加Treg、M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)

腎臟IRI因?yàn)檠趸瘧?yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙、鈣超載等導(dǎo)致組織、細(xì)胞代謝障礙、結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞凋亡、壞死等，而其恢復(fù)過程表現(xiàn)為細(xì)胞的增殖，組織損傷修復(fù)。因此，我們體內(nèi)探討了DCA對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的凋亡與增殖影響。細(xì)胞凋亡、壞死，染色體DNA斷裂，產(chǎn)生3’－OH末端，應(yīng)用Tunel標(biāo)記3’－OH端，標(biāo)示細(xì)胞凋亡、壞死，觀察到低劑量DCA干預(yù)的IRI模型的腎小管上皮細(xì)胞凋亡明顯減少（與體外研究一致）。但對(duì)細(xì)胞增殖未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與IRI后2d的檢測(cè)評(píng)估時(shí)間距發(fā)病時(shí)間較短有關(guān)，也可能由于DCA的保護(hù)作用，DCA組本來凋亡的細(xì)胞少有關(guān)。而DCA減低腎小管上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制是什么呢？既可能與DCA通過調(diào)整基因甲基化、調(diào)整了小管細(xì)胞中某種基因、蛋白表達(dá)有關(guān)，也可能有其他機(jī)制，如控制炎癥反應(yīng)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，小管細(xì)胞表達(dá)的KLF4與DNA甲基化明顯相關(guān)［17－18］，Klotho的甲基化也與腎IRI明顯相關(guān)［19－20］，DCA可能通過調(diào)整上述基因表達(dá)，而達(dá)到保護(hù)腎IRI作用。本研究更關(guān)注炎癥反應(yīng)狀態(tài)。免疫炎癥反應(yīng)既是腎IRI后的重要臨床表現(xiàn)，也是導(dǎo)致腎組織損傷的重要原因。天然免疫反應(yīng)與適應(yīng)性免疫反應(yīng)相互影響，促進(jìn)免疫炎癥反應(yīng)不斷增強(qiáng)，最終導(dǎo)致組織損傷進(jìn)一步加重，因此抑制炎細(xì)胞聚集及細(xì)胞因子釋放可以減輕腎IRI損傷。本研究除觀察到小管細(xì)胞的變化外，也發(fā)現(xiàn)DCA組整體炎細(xì)胞浸潤較IRI組明顯減少，接下來的嗜中性粒細(xì)胞染色同樣觀察到DCA減低了腎組織嗜中性粒細(xì)胞浸潤。表明DCA可以減低腎組織炎性反應(yīng)。

多篇文獻(xiàn)報(bào)道DCA可以促進(jìn)Treg表達(dá)而抑制炎癥反應(yīng)［5，16，21］。我們研究證明了在IRI條件 下，DCA確實(shí)抑制了腎組織炎癥細(xì)胞表達(dá)，同時(shí)也促進(jìn)了腎組織Treg表達(dá)。所以我們推測(cè)DCA可能通過促進(jìn)Treg表達(dá)而抑制炎癥反應(yīng)，減低小管細(xì)胞凋亡，保護(hù)腎功能。巨噬細(xì)胞在IRI發(fā)病及組織修復(fù)過程中也發(fā)揮重要作用［22－23］。如M1型巨噬細(xì)胞加重腎臟損傷，清除M1型巨噬細(xì)胞或抑制M1型巨噬細(xì)胞可以保護(hù)腎IRI［24］；而M2型巨噬細(xì)胞可通過抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖發(fā)揮保護(hù)腎IRI作用［25］，也可通過調(diào)整免疫炎癥反應(yīng)保護(hù)腎臟IRI。有文獻(xiàn)報(bào)道DCA也可能促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)移，因此，我們實(shí)驗(yàn)中同樣檢測(cè)了腎IRI后2d腎組織M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)DCA同樣促進(jìn)了IRI后腎組織巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)移，這也可能與DCA的腎臟保護(hù)作用相關(guān)。

綜上所述，DCA對(duì)腎臟IRI確實(shí)存在保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡、抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。雖然我們研究沒有對(duì)DCA對(duì)腎IRI的遠(yuǎn)期療效做進(jìn)一步評(píng)價(jià)，DCA對(duì)腎IRI的保護(hù)機(jī)制探索也只停留在抑制細(xì)胞凋亡、抑制綜合免疫炎癥反應(yīng)方面，沒有做進(jìn)一步深入研究。但是我們證明了其對(duì)腎IRI損傷的保護(hù)作用，可能成為干預(yù)腎IRI的新方法，接下來我們將對(duì)其遠(yuǎn)期效果、機(jī)制及用藥劑量、持續(xù)時(shí)間方面進(jìn)行深入探索。