陳 洋，許乃恒，王小三，金青哲，王興國(guó)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122)

羊毛脂是由羊的皮脂腺分泌出來的天然物質(zhì)，與一般動(dòng)植物油脂不同，羊毛脂幾乎不含甘油三酯，而主要含蠟酯(由甾醇、脂肪醇與脂肪酸所生成)，約占95%，還含有4%的游離醇以及少量的游離脂肪酸和烴類物質(zhì)[1]。羊毛酸作為羊毛脂衍生物中最重要的產(chǎn)品之一，被廣泛應(yīng)用于化妝品中，較高純度的羊毛酸是制備各種羊毛脂衍生物的主要原料[2]。研究表明，羊毛脂中含有豐富的支鏈脂肪酸(BCFA)，其包含了胎脂中可檢測(cè)到的全部支鏈脂肪酸[3]。支鏈脂肪酸對(duì)新生兒腸道及人類健康具有重要的作用[4-5]，但其天然來源含量較低，人工合成價(jià)格高昂，而羊毛脂中支鏈脂肪酸含量高達(dá)50%以上，因此制備較高純度的羊毛酸為提取并富集支鏈脂肪酸提供了可能[6]。

羊毛脂皂化產(chǎn)物中包含羊毛酸鈉、未皂化脂、羊毛醇以及過量的氫氧化鈉，由于前三者都具有表面活性而且性質(zhì)極其相似，在分離過程中極易乳化并形成微乳液，從而導(dǎo)致分離不徹底[7]。目前常用的皂、醇、脂分離方法主要有鹽析法、溶劑萃取法和超臨界CO2萃取法。鹽析法并不能徹底有效地解決羊毛酸中不皂化物含量問題[8]；溶劑萃取法有機(jī)溶劑使用量大，毒性強(qiáng)[9]；超臨界CO2萃取法雖然能夠達(dá)到較好的分離效果，但是設(shè)備昂貴，尚不能工業(yè)化生產(chǎn)。張玨等[10]通過兩步加酸、溶劑萃取的方式制取羊毛酸，引入苯等大量有毒試劑，且純度低。

本研究以羊毛脂為原料，在現(xiàn)有的羊毛脂皂化工藝基礎(chǔ)上，增加了鈣化、醇洗步驟，對(duì)鈣化、醇洗過程的影響因素進(jìn)行了初步探究，并結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)所制羊毛酸的脂肪酸組成進(jìn)行分析。本研究提供了一種制備羊毛酸的新路徑，相較于傳統(tǒng)方法，羊毛酸的產(chǎn)率和純度均得到了明顯提高，為從羊毛脂中提取并富集支鏈脂肪酸提供了可能，為羊毛脂的深層次利用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

羊毛脂，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、無水氯化鈣、三氟化硼-乙醚、無水硫酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、無水甲醇、異丙醇為試劑級(jí)；正己烷，色譜純，美國(guó)Fisher公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

JJ-1B強(qiáng)力恒速電動(dòng)攪拌器；HH-601超級(jí)恒溫水??；Re-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵；單重四級(jí)桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(ISQTMGC/MS with TRACE GC Ultra)；帶2414型示差折光檢測(cè)器的Waters 1525型高效液相色譜儀(HPLC-RID)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羊毛酸的制備

1.2.1.1 工藝流程

羊毛脂—皂化—鈣化—醇洗—酸化—萃取—有機(jī)層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)—羊毛酸。

1.2.1.2 工藝說明

(1)皂化

羊毛脂的皂化遵循張玨等[11]的方法。在三頸燒瓶中加入1.5倍理論值的氫氧化鈉和與羊毛脂體積質(zhì)量比值為3的80%乙醇溶液，待體系溫度達(dá)到70℃后，緩慢加入熔融態(tài)的羊毛脂，于70℃攪拌反應(yīng)4 h。理論堿量按下式計(jì)算。

式中：SV為羊毛脂的皂化值(KOH)，mg/g；56.11為氫氧化鉀的摩爾質(zhì)量，g/mol；40為氫氧化鈉的摩爾質(zhì)量，g/mol。

(2)鈣化

皂化結(jié)束后加入鹽酸將體系pH調(diào)至8～9，加入一定量的無水氯化鈣，一定溫度下反應(yīng)一定時(shí)間后抽濾，得到濾餅層。

(3)醇洗

將鈣化得到的濾餅層粉碎后加入3倍體積的溶劑，于一定溫度下攪拌回流2 h后抽濾，得到濾餅層，如此反復(fù)數(shù)次。

(4)酸化、萃取、有機(jī)層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)

將醇洗后得到的濾餅層(脂肪酸鈣)粉碎后，加入去離子水，使用鹽酸將pH調(diào)至3左右，于65℃下攪拌回流2 h，加入正己烷萃取析出的羊毛酸后轉(zhuǎn)移至分液漏斗，水洗至中性。去除水層，有機(jī)層加入無水硫酸鈉干燥后抽濾，濾液在45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去正己烷，得到羊毛酸。

1.2.2 高效液相色譜法(HPLC-RID)測(cè)定羊毛酸純度

對(duì)制備的羊毛酸采用HPLC-RID進(jìn)行分析，色譜條件：硅膠柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；柱溫30℃；樣品質(zhì)量濃度20 mg/mL；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相為正己烷-異丙醇-甲酸(體積比15∶1∶0.003)，流速1.0 mL/min。采用面積歸一化法定量，以羊毛酸的相對(duì)含量表示產(chǎn)物羊毛酸純度。對(duì)制備的羊毛酸稱重并按下式計(jì)算羊毛酸產(chǎn)率。

所得羊毛酸量=C1×M1

式中：C1為產(chǎn)物中羊毛酸的含量；M1為產(chǎn)物羊毛酸的質(zhì)量，g；SV為羊毛脂的皂化值(KOH)，mg/g；56.11為氫氧化鉀的摩爾質(zhì)量，g/mol；320為羊毛酸的摩爾質(zhì)量，g/mol；M2為羊毛脂的質(zhì)量，g。

1.2.3 羊毛酸脂肪酸組成分析

脂肪酸甲酯化：取羊毛酸1～2滴，加入2 mL體積比為1∶3的三氟化硼-乙醚甲醇溶液，70℃振蕩反應(yīng)3 min，加入2 mL正己烷、2 mL飽和氯化鈉溶液，上清液于10 000 r/min離心5 min，過膜待分析。

采用單重四級(jí)桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析。氣相色譜條件：DB-5色譜柱(30 m×0.25 mm，0.10 m)；升溫程序?yàn)槌鯗?20℃，保持0.5 min，以10℃/min升至230℃，保持8 min；進(jìn)樣口溫度280℃；分流比100∶1；載氣為He，流速1.2 mL/min。質(zhì)譜條件：傳輸線溫度250℃，離子源溫度230℃，電子能70 eV，質(zhì)量掃描范圍50～500 u，溶劑延遲5 min。

通過檢索NIST譜圖庫(kù)和Wiley以及參考文獻(xiàn)[12-14]進(jìn)行譜圖解析，確認(rèn)各個(gè)脂肪酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)，進(jìn)行定性分析。采用面積歸一化法進(jìn)行定量分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)至少平行測(cè)定3次，所有數(shù)據(jù)均使用Origin 8.0軟件中的一維ANOVA處理，并以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。用Turkey檢驗(yàn)比較組內(nèi)數(shù)據(jù)的差異性，以不同字母表示在P<0.05水平上存在顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 鈣化工藝條件的優(yōu)化

在醇洗溶劑為乙醇、醇洗溫度60℃、醇洗次數(shù)4次的條件下，改變鈣化工藝條件，以羊毛脂為原料按1.2.1制備羊毛酸，考察鈣化工藝條件對(duì)羊毛酸產(chǎn)率的影響。

2.1.1 無水氯化鈣添加量對(duì)羊毛酸產(chǎn)率的影響

在鈣化溫度50℃、鈣化時(shí)間1 h條件下，選取5種不同的無水氯化鈣添加量1x、1.1x、1.2x、1.3x和1.4x(x為無水氯化鈣理論添加量)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察無水氯化鈣添加量對(duì)羊毛酸產(chǎn)率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 無水氯化鈣添加量對(duì)羊毛酸產(chǎn)率的影響

無水氯化鈣與皂化反應(yīng)之后的羊毛酸鈉進(jìn)行復(fù)分解反應(yīng)，生成在水和低級(jí)醇中幾乎不溶的羊毛酸鈣沉淀。由于體系中存在一定量的氫氧化鈉，加入的無水氯化鈣不僅會(huì)與羊毛酸鈉反應(yīng)，同時(shí)也會(huì)與殘余的氫氧化鈉發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致羊毛酸產(chǎn)率低，因而選擇加入過量的無水氯化鈣。無水氯化鈣添加量過少，則體系中存在未反應(yīng)的羊毛酸鈉，導(dǎo)致羊毛酸產(chǎn)率降低；無水氯化鈣過量，不僅造成原料的浪費(fèi)，同時(shí)增加后期水洗的負(fù)擔(dān)。由圖1可知，隨著無水氯化鈣添加量的增加，羊毛酸產(chǎn)率逐漸增加，當(dāng)無水氯化鈣添加量為1.2倍理論值時(shí)，羊毛酸產(chǎn)率基本達(dá)到平衡，雖然隨著無水氯化鈣添加量的繼續(xù)增加，羊毛酸產(chǎn)率略微增加，但趨于平緩。綜合考慮，選取無水氯化鈣添加量為1.2倍理論值。

2.1.2 鈣化溫度對(duì)羊毛酸產(chǎn)率的影響

在加入1.2倍理論值的無水氯化鈣、鈣化時(shí)間1 h條件下，選取5種不同的鈣化溫度40、45、50、55、60℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察鈣化溫度對(duì)羊毛酸產(chǎn)率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 鈣化溫度對(duì)羊毛酸產(chǎn)率的影響

皂化反應(yīng)結(jié)束后，由于體系中含有一定量的羊毛醇，羊毛醇熔點(diǎn)較高，體系溫度較低，造成羊毛醇凝固，無法進(jìn)行有效的攪拌，從而導(dǎo)致反應(yīng)不充分，因此選取40℃作為起始溫度來探究鈣化溫度對(duì)羊毛酸產(chǎn)率的影響。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，鈣化溫度較低時(shí)出現(xiàn)了較細(xì)的結(jié)塊顆粒，說明在反應(yīng)中發(fā)生了晶粒包裹現(xiàn)象。羊毛酸鈉與無水氯化鈣的復(fù)分解反應(yīng)較快，體系中的鈣離子首先與產(chǎn)物顆粒表面的羊毛酸鈉反應(yīng)生成羊毛酸鈣沉淀，進(jìn)而將顆粒內(nèi)部的羊毛醇和未反應(yīng)的羊毛酸鈉包裹進(jìn)去，導(dǎo)致反應(yīng)不充分，羊毛酸產(chǎn)率較低[15]。由圖2可知，隨著鈣化溫度的升高，羊毛酸產(chǎn)率不斷增加，當(dāng)鈣化溫度達(dá)到50℃時(shí)，羊毛酸產(chǎn)率達(dá)到最高，鈣化溫度繼續(xù)升高羊毛酸產(chǎn)率反而略微降低，因此選取鈣化溫度為50℃。

2.1.3 鈣化時(shí)間對(duì)羊毛酸產(chǎn)率的影響

在加入1.2倍理論值的無水氯化鈣、鈣化溫度50℃條件下，選取5種不同的鈣化時(shí)間0.5、1、1.5、2、2.5 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察鈣化時(shí)間對(duì)羊毛酸產(chǎn)率的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，鈣化反應(yīng)0.5 h，羊毛酸產(chǎn)率即可達(dá)到70%以上，鈣化反應(yīng)1 h，反應(yīng)即可達(dá)到平衡，羊毛酸產(chǎn)率達(dá)到82.38%。羊毛酸鈉與無水氯化鈣的鈣化反應(yīng)屬于復(fù)分解反應(yīng)，反應(yīng)速度較快，短時(shí)間內(nèi)即可形成脂肪酸鈣沉淀。因此，選取1 h作為優(yōu)選的鈣化時(shí)間。以優(yōu)選的鈣化反應(yīng)條件進(jìn)行醇洗工藝條件的優(yōu)化。

圖3 鈣化時(shí)間對(duì)羊毛酸產(chǎn)率的影響

2.2 醇洗工藝條件的優(yōu)化

2.2.1 醇洗溶劑類型對(duì)羊毛酸純度的影響

羊毛醇以及未皂化完全的羊毛脂在苯和熱的低級(jí)醇中均有較好的溶解性。由于苯毒性較強(qiáng)，出于安全以及環(huán)保的考慮，本研究選取低級(jí)醇作為醇洗溶劑。在醇洗溫度60℃、醇洗次數(shù)4次條件下，選取3種不同的醇洗溶劑無水乙醇、無水甲醇和異丙醇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察醇洗溶劑類型對(duì)羊毛酸純度的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 醇洗溶劑類型對(duì)羊毛酸純度的影響

由圖4可知，3種低級(jí)醇均能較好地去除羊毛酸鈣中攜帶的羊毛醇以及未皂化的羊毛脂，無水乙醇和異丙醇的效果更佳。由于無水乙醇成本較低，選取無水乙醇作為醇洗溶劑。

2.2.2 醇洗溫度對(duì)羊毛酸純度的影響

在無水乙醇為醇洗溶劑、醇洗次數(shù)4次條件下，選取5種不同的醇洗溫度50、55、60、65、70℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察醇洗溫度對(duì)羊毛酸純度的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，醇洗溫度對(duì)羊毛酸純度具有較大的影響。當(dāng)溫度較低時(shí)，一部分羊毛醇未能充分地溶解于無水乙醇中，在抽濾的過程中，羊毛酸鈣中存在著一部分未溶解的羊毛醇，導(dǎo)致后續(xù)制取的羊毛酸純度較低。隨著醇洗溫度的不斷升高，羊毛醇更好地溶解于無水乙醇中，羊毛酸純度不斷增加，當(dāng)醇洗溫度達(dá)到60℃后，羊毛酸純度趨于穩(wěn)定。因此，選取60℃作為優(yōu)選的醇洗溫度。

圖5 醇洗溫度對(duì)羊毛酸純度的影響

2.2.3 醇洗次數(shù)對(duì)羊毛酸純度的影響

在醇洗溶劑為無水乙醇、醇洗溫度60℃條件下，選取5種不同的醇洗次數(shù)2、3、4、5、6次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察醇洗次數(shù)對(duì)羊毛酸純度的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 醇洗次數(shù)對(duì)羊毛酸純度的影響

由圖6可知，醇洗次數(shù)對(duì)羊毛酸純度影響較大，隨著醇洗次數(shù)的增加，混雜于羊毛酸鈣中的羊毛醇以及未皂化的羊毛脂不斷被去除，當(dāng)醇洗次數(shù)達(dá)到4次時(shí)，羊毛酸純度達(dá)到平衡。雖然隨著醇洗次數(shù)的持續(xù)增加，羊毛酸純度略微增加，但無水乙醇的用量增大，增加了溶劑回收的成本。綜合考慮，醇洗次數(shù)優(yōu)選為4次。在此條件下，羊毛酸純度達(dá)到84.76%。

本研究同時(shí)采用張玨[16]、Yao[6]等的方法制備羊毛酸，發(fā)現(xiàn)羊毛酸產(chǎn)率不到20%，同時(shí)純度不到60%，羊毛酸中含有較多的羊毛醇，羊毛酸產(chǎn)品品質(zhì)較低。由此可見，本研究提出并優(yōu)化的羊毛酸制取新工藝，能夠顯著提高羊毛酸產(chǎn)率和純度。

2.3 羊毛酸脂肪酸組成分析

采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)所制備的羊毛酸進(jìn)行脂肪酸組成分析，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，羊毛酸中主要為飽和脂肪酸，其中支鏈脂肪酸含量高達(dá)64.35%，碳鏈長(zhǎng)度為C10～C29。研究表明母乳中主要的支鏈脂肪酸為iso-C14∶0、iso-C15∶0、anteiso-C15∶0、iso-C16∶0、iso-C17∶0和anteiso-C17∶0[17]。羊毛酸中含有以上6種支鏈脂肪酸，且含量較高，后期可以采用尿素包埋等方法富集支鏈脂肪酸。

表1 羊毛酸脂肪酸組成 %

3 結(jié) 論

本研究在現(xiàn)有的羊毛脂皂化工藝基礎(chǔ)上，增加了鈣化、醇洗步驟，對(duì)鈣化、醇洗過程的影響因素進(jìn)行了初步探究，并結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)所制羊毛酸的脂肪酸組成進(jìn)行了分析。優(yōu)化的鈣化反應(yīng)條件為：無水氯化鈣添加量為理論值的1.2倍，鈣化溫度50℃，鈣化時(shí)間1 h。優(yōu)化的醇洗條件為：醇洗溶劑為無水乙醇，醇洗溫度為60℃，醇洗次數(shù)4次。在優(yōu)化條件下，羊毛酸產(chǎn)率為82.38%，羊毛酸純度為84.76%。羊毛酸中檢測(cè)出25種支鏈脂肪酸，含量為64.35%。本研究提供了一種制備較高純度羊毛酸的新路徑，同時(shí)為從羊毛脂中提取并富集支鏈脂肪酸提供了可能，為羊毛脂的深層次利用奠定基礎(chǔ)。