何曉明，沈雄雅，趙月鈞，葉冰潔，章舒祺

(1.綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司，杭州 310052； 2.麗水藍(lán)城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司，浙江 麗水 323000)

植物生長調(diào)節(jié)劑(Plant growth regulators，PGRs)是一種與天然植物激素功能相似，具有促進(jìn)植物生長、提高作物品質(zhì)的人工合成化合物，廣泛應(yīng)用于油料作物生產(chǎn)中，如6-芐基腺嘌呤在油菜，2，4-二氯苯氧乙酸在大豆，多效唑、烯效唑在花生生產(chǎn)中均已普遍使用[1-3]。隨著PGRs使用的日益增多，其安全性也越來越受到重視。研究表明，殘留在植物中的PGRs可通過食物鏈對人體健康產(chǎn)生危害[4-5]。但目前我國PGRs的研究大多針對蔬菜、瓜果等初級農(nóng)產(chǎn)品，對于油料作物，特別是植物油的限量制定方面還不完善，GB 2763—2016《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中僅規(guī)定了菜籽油中的多效唑限量為0.5 mg/kg，沒有包含6-芐基腺嘌呤、2，4-二氯苯氧乙酸、烯效唑等常見PGRs。

植物油中農(nóng)藥殘留檢測的難點在于其高含量的油脂成分所帶來的基質(zhì)效應(yīng)，如果樣品凈化不充分容易對分析造成干擾，還會污染儀器，降低儀器使用壽命。傳統(tǒng)的提取凈化方法主要是固相萃取法[6-7]和凝膠色譜法[8-9]，雖能獲得較好的凈化效果，但存在操作煩瑣、處理時間長、成本高的問題。QuEChERS方法由于快速、簡單、廉價、高效、耐用、安全的特點，在植物油農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用日趨增多[10-11]，但傳統(tǒng)的QuEChERS方法主要針對蔬菜、水果等含水量多、基質(zhì)干擾少的樣品，應(yīng)用于高脂肪含量樣品時，選擇性不夠高，凈化效果不理想，對檢測結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度產(chǎn)生影響[12]。

本實驗采用改良的QuEChERS方法，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法用于植物油中10種PGRs的測定，以期為監(jiān)管部門制定相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

市售植物油。甲酸、乙腈和甲醇(HPLC級，美國Thermo公司)；增強(qiáng)型基質(zhì)去除吸附劑(EMR-Lipid，美國Agilent公司)；十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)，N-丙基乙二胺(PSA)(天津博納艾杰爾科技有限公司)；實驗用水為Milli-Q超純水；其他試劑均為分析純。10種PGRs標(biāo)準(zhǔn)品，即6-芐基腺嘌呤、吲哚乙酸、吲哚丁酸、2，4-二氯苯氧乙酸、4-氯苯氧乙酸、氯吡脲、多效唑、噻苯隆、4-氟苯氧乙酸和異戊烯腺嘌呤，純度均大于95%，購于Dr.Ehrenstorfer公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

LC-MS 8050三重四級桿液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本Shimadzu公司)；DMT-2500多管渦旋混合儀(杭州米歐儀器有限公司)；ST16R高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo公司)；超純水機(jī)(美國Millipore公司)；KQ-500E超聲波清洗器(500 W)。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取10種PGRs標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4℃下避光保存。用時根據(jù)需要用空白基質(zhì)提取液逐級稀釋配成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 樣品前處理

稱取2.00 g植物油樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸-乙腈溶液，超聲提取10 min，8 000 r/min離心3 min，上清液待凈化。移取4 mL上清液至裝有0.5 g EMR-Lipid凈化管中(使用前用2 mL水充分潤濕活化)，渦旋2 min，8 000 r/min離心3 min，取凈化液至已提前加入0.5 g氯化鈉和1.0 g無水硫酸鎂的10 mL離心管中，渦旋1 min，8 000 r/min離心3 min，將凈化液移入10 mL離心管中，40℃下氮吹至干，加入1.0 mL 10%甲醇水溶液復(fù)溶，過0.22 μm濾膜，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.2.3 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；進(jìn)樣量3 μL；柱溫30℃；流動相為0.1%甲酸-2 mmol/L甲酸銨水溶液(A)和甲醇(B)；流速0.3 mL/min；采用梯度洗脫，洗脫程序為0～0.5 min 10% B,0.5～1.5 min 10%～30% B,1.5～5.5 min 30%～70% B，5.5～6.5 min 70% B，6.5～7.5 min 70%～10% B。

1.2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)溫度400℃，毛細(xì)管電壓4 000 V；掃描方式為正、負(fù)離子模式；霧化氣流量3.0 L/min；加熱氣流量10.0 L/min；定性與定量離子對、碰撞能量等參數(shù)見表1。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20軟件進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用電噴霧離子源，在正、負(fù)離子掃描模式下對10種PGRs的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子全掃描，再對其子離子全掃描。參照歐盟EU第2002/657/EC號決議中的有關(guān)規(guī)定[13]，每個目標(biāo)物選擇2對響應(yīng)值較高的特征離子對作為定量及定性離子化，最后以多反應(yīng)監(jiān)測模式優(yōu)化各種質(zhì)譜參數(shù)，相關(guān)參數(shù)見表1。

表1 10種PGRs的質(zhì)譜參數(shù)

注：*為定量離子。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

流動相的選擇對目標(biāo)物的離子化及質(zhì)譜檢測的靈敏度有一定作用。結(jié)合文獻(xiàn)報道[2,14-15]，分別以甲醇、乙腈作為有機(jī)相，0.1%甲酸-2 mmol/L甲酸銨、0.1%甲酸-5 mmol/L甲酸銨、0.5%甲酸-2 mmol/L甲酸銨和0.5%甲酸-5 mmol/L甲酸銨作為水相，比較了不同流動相下的分離效果。結(jié)果表明，采用甲醇作為有機(jī)相時，分離效果好于乙腈；水相中加入0.1%甲酸時，10種PGRs峰形和靈敏度均較好，而加入0.5%甲酸時，吲哚乙酸、吲哚丁酸、氯吡脲和多效唑的響應(yīng)值明顯上升，但系統(tǒng)中酸含量增加，降低了負(fù)離子掃描下6-芐基腺嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸、4-氯苯氧乙酸、噻苯隆、4-氟苯氧乙酸和異戊烯腺嘌呤的響應(yīng)強(qiáng)度。對比了0.1%甲酸-2 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸-5 mmol/L甲酸銨作為水相時的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用0.1%甲酸-2 mmol/L甲酸銨時分離度和重復(fù)性更好。因此，選擇0.1%甲酸-2 mmol/L甲酸銨與甲醇作為流動相。10種PGRs的總離子流色譜圖見圖1。

注：1.異戊烯腺嘌呤；2.6-芐基腺嘌呤；3.吲哚乙酸；4.4-氟苯氧乙酸；5.噻苯隆；6.4-氯苯氧乙酸；7.吲哚丁酸；8.氯吡脲；9.2,4-二氯苯氧乙酸；10.多效唑。

圖1 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定10種PGRs標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/L)的總離子流色譜圖

2.3 前處理方法的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的優(yōu)化

目前QuEChERS方法提取溶劑大多采用甲醇或乙腈，以及酸性的甲醇或乙腈[16]。以10種PGRs添加水平為5 μg/kg的植物油樣品為實驗材料，分別比較了甲醇、乙腈、1%甲酸-甲醇溶液、1%甲酸-乙腈溶液對10種PGRs回收率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同提取溶劑對10種PGRs提取效果的影響

從圖2可以看出，甲醇和酸性甲醇的基質(zhì)效應(yīng)較大而導(dǎo)致回收率偏低，酸性乙腈的提取效果最好。這可能因為用甲醇提取時植物油中的雜質(zhì)隨著目標(biāo)物一起被提取出來，對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響[17]。此外，PGRs屬于酸性化合物，在乙腈中添加適量的甲酸可以抑制PGRs在溶液中電離成離子形態(tài)，提高提取效率。因此，選擇1%甲酸-乙腈溶液作為提取溶劑。

2.3.2 提取方法的優(yōu)化

以10種PGRs添加水平為5 μg/kg的植物油樣品為實驗材料，考察了振蕩提取(2 000 r/min，40℃)與超聲提取(200 W，40℃)兩種方法的回收率，結(jié)果見圖3。

圖3 不同提取方法對10種PGRs提取效果的影響

從圖3可以看出，10種PGRs經(jīng)振蕩提取后回收率在65.3%～77.1%，超聲提取后10種PGRs回收率上升至84.9%～90.7%。

進(jìn)一步比較了不同的超聲時間(5、10、20、30 min)對10種PGRs回收率的影響。結(jié)果顯示，回收率隨著超聲時間的延長而增加，在10 min時趨于平衡，繼續(xù)延長超聲時間，回收率基本不變。因此，選擇超聲時間10 min。

2.3.3 凈化方法的優(yōu)化

植物油樣品中主要的基質(zhì)干擾為脂類物質(zhì)，其會干擾目標(biāo)物的測定，因此選擇合適的吸附劑除去脂類干擾成為QuEChERS方法的關(guān)鍵。對傳統(tǒng)QuEChERS方法中常用的吸附劑C18、PSA和增強(qiáng)型基質(zhì)去除吸附劑EMR-Lipid進(jìn)行考察。取1 mL空白植物油提取液分別加入0.5 g EMR-Lipid、0.5 g C18和0.5 g PSA，得到凈化后基質(zhì)溶液，以基質(zhì)效應(yīng)(ME)評價3種吸附劑對10種PGRs的凈化效果。ME=基質(zhì)空白加標(biāo)溶液響應(yīng)值/空白溶劑中加標(biāo)溶液響應(yīng)值×100%。ME值越高,表示經(jīng)凈化后目標(biāo)物信號越強(qiáng)，基質(zhì)干擾越低，凈化效果越理想。3種吸附劑對10種PGRs凈化效果的影響見圖4。

圖4 不同吸附劑對10種PGRs凈化效果的影響

由圖4可以看出：傳統(tǒng)吸附劑C18、PSA對高油脂樣品凈化效果不理想，凈化液較混濁，10種PGRs的ME值均低于80%；采用EMR-Lipid凈化效果最好，10種PGRs的ME值在82.1%～90.3%之間，基質(zhì)干擾小，加標(biāo)樣品的分離度和峰形均較好。這可能是與硅膠基質(zhì)為主鍵合C18、PSA等吸附劑相比，特殊聚合物基質(zhì)EMR-Lipid能夠?qū)ｉT吸附C5及以上的長鏈脂類，選擇吸附性好，可以獲得理想的除脂凈化效果[18-19]。

PGRs在植物油中以痕量存在，加大樣品濃縮倍數(shù)是提高方法靈敏度的有效手段，但由于吸附劑吸附能力有限，樣品凈化量過大則會影響凈化效果。實驗考察了不同樣品凈化量(1、2、4、6、8 mL)對PGRs凈化效果的影響，發(fā)現(xiàn)樣品凈化量超過4 mL時，吲哚丁酸、氯吡脲、異戊烯腺嘌呤的回收率有不同程度的下降，這可能是未被消除的雜質(zhì)所造成的基質(zhì)效應(yīng)。因此，選擇4 mL提取液進(jìn)行EMR-Lipid凈化。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與定量限

由2.3.3結(jié)果可知，在經(jīng)過QuEChERS凈化處理后仍存在一定的基質(zhì)效應(yīng)，因此采用基質(zhì)匹配工作標(biāo)準(zhǔn)曲線作為校正曲線，以消除基質(zhì)效應(yīng)帶來的偏差。用空白植物油樣品提取液作為溶液配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液，按1.2.3、1.2.4方法進(jìn)行測定，以定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在最低添加水平下，以3倍信噪比確定方法檢出限，以10倍信噪比確定方法定量限，結(jié)果見表2。由表2可知，在1～100 μg/L范圍內(nèi)，10種PGRs線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)為0.991～0.998，檢出限為0.014～0.188 μg/kg，定量限為0.048～0.625 μg/kg。

表2 10種PGRs的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.4.2 回收率與精密度

在空白菜籽油、大豆油和花生油樣品中添加高、中、低3個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)結(jié)果見表3。

表3 空白樣品中10種PGRs的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

由表3可知，在優(yōu)化的實驗條件下10種PGRs的回收率在70.2%～94.7%之間，RSD為1.2%～10.2%，準(zhǔn)確度與精密度能滿足實際分析的要求。

2.5 與國標(biāo)方法的比較

與GB/T 20770—2008方法進(jìn)行比較，本方法的優(yōu)勢體現(xiàn)在以下幾個方面：①檢測的植物生長調(diào)節(jié)劑種類由2種增加至10種，覆蓋面更廣；②對于高油脂樣品的分析更具有針對性，靈敏度更高；③國標(biāo)的凈化方式為凝膠色譜凈化，存在凈化時間長、操作煩瑣、有機(jī)溶劑使用量大的問題，本方法直接通過QuEChERS方法凈化，所用的試劑少、簡單、易于操作。

2.6 實際樣品的測定

采用本方法對30批次市售菜籽油、大豆油和花生油進(jìn)行測定。檢測結(jié)果表明，上述10種PGRs均未檢出。考慮到此次被檢樣品來自于大型超市品牌廠家生產(chǎn)，而植物油生產(chǎn)企業(yè)眾多，有不少小型植物油生產(chǎn)企業(yè)，質(zhì)量意識淡薄，有潛在的質(zhì)量安全風(fēng)險，所以植物油中PGRs殘留問題仍需連續(xù)監(jiān)測。

3 結(jié) 論

本實驗將新型吸附劑EMR-Lipid應(yīng)用到的QuEChERS前處理方法，并結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了同時測定植物油中10種PGRs檢測方法。本方法線性范圍為1～100 μg/L，10種PGRs線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)為0.991～0.998。檢出限為0.014～0.188 μg/kg，定量限為0.048～0.625 μg/kg。10種PGRs的回收率在70.2%～94.7%之間，RSD為1.2%～10.2%。相比于傳統(tǒng)QuEChERS法，本方法除脂凈化效果更好，可用于植物油中多種PGRs殘留的快速篩查和確證，為植物油中PGRs限量的設(shè)定建立前期風(fēng)險監(jiān)測基礎(chǔ)。