鄒明園，吳國球,2

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南京210009；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院檢驗科，南京210009)

自2019年12月底武漢暴發(fā)新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)疫情以來，全球累計報告的確診病例已超過10萬例，隨著疫情升級，目前已蔓延至除南極洲以外的所有大洲。此次COVID-19是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的以肺部病變?yōu)橹鞯男掳l(fā)傳染病，也可引起消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，嚴重者可導(dǎo)致死亡[1]。COVID-19主要經(jīng)呼吸道飛沫和密切接觸傳播。SARS-CoV-2感染的患者，包括無癥狀感染者均為傳染源，且人群普遍易感[2]。故對SARS-CoV-2感染者及時隔離，是阻止疫情蔓延的關(guān)鍵。然而，根據(jù)目前流行病學(xué)數(shù)據(jù)，COVID-19的潛伏期為1～14 d，多為3～7 d[3]。輕、中癥患者早期臨床表現(xiàn)缺乏特異性，以上呼吸道癥狀(發(fā)熱、干咳、乏力)為主[1,4]。因此，很難從臨床表現(xiàn)對COVID-19和普通感冒(上感)或流行性感冒(流感)進行鑒別診斷。此外，春季為上感和流感的高發(fā)季節(jié)，大量的上感、流感患者加大了COVID-19的診斷難度。

2020年3月3日發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》(以下簡稱“第七版方案”)[5]，新增加了抗體血清學(xué)檢測作為診斷病毒感染確診的另一關(guān)鍵證據(jù)。而此前的版本均以實時熒光RT-PCR檢測SARS-CoV-2核酸陽性為COVID-19疑似病例的確診依據(jù)?？贵w血清學(xué)檢測與核酸檢測相比，操作相對簡便，可實現(xiàn)自動化、大批量分析，且無需對患者進行咽拭子采樣，可降低醫(yī)護人員暴露風險[6-7]。然而，對于抗體血清學(xué)檢測作為COVID-19疑似病例的確診依據(jù)可能會受其他亞型冠狀病毒的影響，而造成假陽性增加。為探討該問題，本文針對SARS-CoV-2的生物學(xué)特征、抗體產(chǎn)生的特點、抗體檢測的方法以及檢測結(jié)果的影響因素等方面進行討論。

1 SARS-CoV-2的命名及生物學(xué)特征

冠狀病毒是一個大型病毒家族，根據(jù)血清型和基因組特點,冠狀病毒亞科被分為α、β、γ和δ 4個屬，而α與β屬只會感染哺乳動物，γ與δ屬則主要感染禽類[8]。冠狀病毒是普通感冒的主要病原之一，迄今為止，共確認了7種能引起人類感染的冠狀病毒亞型，即人冠狀病毒229E型(human coronavirus 229E,hCoV-229E)、人冠狀病毒NL63型(hCoV-NL63)、人冠狀病毒OC43型(hCoV-OC43)、人冠狀病毒HKU1型(hCoV-HKU1)、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)、中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)以及此次發(fā)現(xiàn)的SARS-CoV-2。除hCoV-229E和hCoV-NL63為α屬外，其余5種均為β屬。其中，hCoV-229E、hCoV-OC43、hCoV-NL63和hCoV-HKU1致病性相對較弱，在人群中持續(xù)存在，分布于全世界各個地區(qū)，常于冬季和早春引起人呼吸道感染系列癥狀，包括高發(fā)病率的肺炎和支氣管炎。

2 SARS-CoV-2抗體檢測原理

第七版方案明確，如果疑似病例的血清SARS-CoV-2特異性IgM抗體和IgG抗體陽性，以及血清SARS-CoV-2特異性IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性或恢復(fù)期較急性期4倍及以上升高，則可被確診為COVID-19病例。一般情況下，IgM抗體在病毒感染早期，約在感染病毒后1周出現(xiàn)，是急性期感染的診斷指標，但濃度相對較低、維持時間短、親和力較低。IgG抗體約在感染病毒后3周出現(xiàn)，并在血液循環(huán)中較長時間存在，且抗體滴度有一個持續(xù)增高的過程，故血清IgG陽性提示感染中后期或既往感染。

冠狀病毒至少編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白：棘突蛋白(spike protein，S蛋白)、小包膜糖蛋白(envelope protein，E蛋白)、膜糖蛋白(membrane protein，M蛋白)以及核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N蛋白)?？贵w檢測的特異性主要與抗原位點的選擇有關(guān)，N蛋白和S蛋白是SARS-CoV-2檢測的主要抗原位點。利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，可通過抗原檢測抗體的存在。截至2020年3月7日，國家藥品監(jiān)督管理局共批準SARS-CoV-2抗體檢測試劑5個。采用的檢測方法主要有膠體金法和化學(xué)發(fā)光法，見表1。

表1 目前已獲批上市的新冠病毒抗體檢測試劑

3 免疫交叉反應(yīng)對SARS-CoV-2抗體檢測的影響

目前已有大量研究提示，不同種冠狀病毒N蛋白或S蛋白存在免疫交叉反應(yīng)[9-13]。Shao等[9]通過western blot分析提示，α屬的hCoV-229E和hCoV-NL63的N蛋白存在免疫交叉反應(yīng)。Dijkman等[11]也通過N蛋白競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗分析證實β屬hCoV-OC43與hCoV-HKU1存在免疫交叉反應(yīng)。且冠狀病毒的N蛋白和S蛋白的免疫交叉反應(yīng)不僅存在亞屬內(nèi)，也存在于不同亞屬間，如SARS-CoV與hCoV-229E、hCoV-NL63也可能存在N蛋白和S蛋白的免疫交叉反應(yīng)[12-13]。因此，SARS-CoV-2抗體檢測可受其他種類冠狀病毒的影響，可能具有一定的假陽性率，但還需在臨床檢測中進一步證實。尤其是COVID-19暴發(fā)于上感流行季節(jié)，大量的hCoV-229E、hCoV-OC43、hCoV-NL63和hCoV-HKU1病毒感染引起的上感患者可影響SARS-CoV-2抗體的檢測結(jié)果。

本課題組從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取7種冠狀病毒N蛋白、S蛋白的氨基酸序列,用DNAStar軟件對7種冠狀病毒N蛋白和S蛋白的氨基酸序列進行同源性分析及繪制同源性樹狀圖。N蛋白同源性分析結(jié)果顯示與SARS-CoV-2相似性最高的是同為β亞屬的SARS-CoV，相似指數(shù)為90%；最低的是α亞屬的hCoV-229E，相似指數(shù)為24.1%，見表2。根據(jù)Woo等[13]的報道，即便是相似指數(shù)僅為23.2%的SARS-CoV，與hCoV-229E都可出現(xiàn)N蛋白的交叉反應(yīng)。而SARS-CoV-1與另外6種冠狀病毒的相似指數(shù)均在24.1%以上。7種冠狀病毒N蛋白的系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果如圖1A所示，與SARS-CoV-2最為接近的是SARS-CoV，該結(jié)果與表2同源性分析結(jié)果基本相符。同樣地，7種冠狀病毒S蛋白分析顯示，SARS-CoV-2與另外6種冠狀病毒的相似指數(shù)均在29.3%以上，其中同源性最高的是SARS-CoV，相似指數(shù)為75.3%，見表3；系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果顯示，SARS-CoV-2與hCoV-229E和SARS-CoV可歸為一大類，見圖1B。上述結(jié)果提示，基于N或S蛋白的抗體血清學(xué)檢測，可能受其他冠狀病毒感染影響出現(xiàn)交叉反應(yīng)而導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

表2 7種冠狀病毒間N蛋白氨基酸序列的同源性(%)

表3 7種冠狀病毒間S蛋白氨基酸序列的同源性(%)

圖1 7種冠狀病毒N蛋白(A)與S蛋白(B)系統(tǒng)進化樹分析

4 結(jié)語

綜上所述，核酸檢測是病毒存在的直接證據(jù)，而抗體檢測則是間接證據(jù)，抗體聯(lián)合核酸檢測可能有助于進一步提高新型冠狀病毒感染的檢出率。在建立抗體檢測方法時，應(yīng)盡可能考慮選擇特異性抗原表位(線性表位)，同時也應(yīng)考慮空間表位對檢測的影響，以最大限度減少交叉反應(yīng)。由于目前批準的抗體(IgM/IgG)檢測試劑盒多為應(yīng)急審批，未經(jīng)過嚴格的特異性(與其他冠狀病毒的交叉反應(yīng))測試，也未經(jīng)過臨床驗證；此外，類風濕因子、嗜異性抗體、補體以及外源性干擾等因素也可能造成試驗結(jié)果的假陽性。因此，若抗體檢測陽性時，應(yīng)該動態(tài)檢測抗體滴度，結(jié)合臨床和核酸檢測結(jié)果進行鑒別診斷，以排除其他冠狀病毒感染的可能性。