許丁帆,劉艷軍,通信作者,賀峰
(1.天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院,天津 300384;2.魏縣益聚種植園藝設(shè)計(jì)有限公司,河北 邯鄲 056800)
玫瑰石斛(Dendrobium crepidatumLindl.et Paxt.)是蘭科石斛屬多年生草本植物,莖粗壯,肉質(zhì),味苦,以新鮮或干燥莖入藥,多附生于山谷巖石或樹(shù)干上,主要分布于云南、貴州兩地,印度、緬甸、老撾、尼泊爾等地也有分布[1]。玫瑰石斛含有多種藥用成分,具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、降血糖等多種藥用功效,是加工水草楓斗、黃草石斛的植物材料之一,且玫瑰石斛花開(kāi)艷麗,具有較高的園藝觀賞價(jià)值[2-3]。近年來(lái),野生玫瑰石斛遭受到掠奪式的采挖,資源較為匱乏,有些地區(qū)甚至已到瀕臨滅絕的境地。
玫瑰石斛大面積人工種植的關(guān)鍵是解決種源問(wèn)題。當(dāng)前,玫瑰石斛以傳統(tǒng)的分株和扦插等方式繁殖為主,其生產(chǎn)效率低,而且長(zhǎng)此以往會(huì)導(dǎo)致植物病毒的積累與品種退化。利用生物技術(shù)方法對(duì)玫瑰石斛的研究也主要集中于組培試管苗的快繁和有效藥用成分的分析與提取方面,對(duì)玫瑰石斛人工種子研究較少[4-5]。采用組培試管苗解決玫瑰石斛的種源問(wèn)題,存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)、成本高、移栽和管理技術(shù)要求高等不足[6-9]。而利用原球莖或胚狀體制作而成的人工種子,具有生產(chǎn)成本低、便于貯藏和運(yùn)輸、易于保存、適合機(jī)械化操作,可直接在土壤中萌發(fā)且發(fā)育同步化高等優(yōu)點(diǎn)[10-11]。
蘇江等利用玫瑰石斛的莖段為外植體進(jìn)行了原球莖的誘導(dǎo)[12]。本研究采用玫瑰石斛組培苗葉片為外植體,進(jìn)行原球莖的誘導(dǎo)與增殖研究,目的是建立和完善穩(wěn)定高效的玫瑰石斛原球莖生產(chǎn)體系,為玫瑰石斛人工種子的研究利用奠定基礎(chǔ)。
本研究中所用的玫瑰石斛組培苗由天津農(nóng)學(xué)院園林植物實(shí)驗(yàn)室提供。
1.2.1 玫瑰石斛原球莖的誘導(dǎo)試驗(yàn)
本研究選取玫瑰石斛組培苗葉片為外植體,誘導(dǎo)其產(chǎn)生原球莖。在超凈臺(tái)中,剪取帶有一定量葉鞘組織的葉片,將葉片直接接種到原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用 MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,附加 30 g/L蔗糖和不同濃度配比的2,4-D、BA和NAA,采用7 g/L瓊脂粉進(jìn)行固化,并調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為5.8,121 ℃下滅菌20min。用150 mL廣口三角瓶為容器,加入配制好的培養(yǎng)基40 mL。每個(gè)處理重復(fù)10瓶,每瓶接種5個(gè)外植體。將接種后的三角瓶放到組培室中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為:首先進(jìn)行避光培養(yǎng),溫度26 ℃,經(jīng)過(guò)大約30 d后將其繼代到相同的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)條件同前面,繼代培養(yǎng)20 d。經(jīng)過(guò)2次繼代培養(yǎng)后,待到葉片基部周?chē)性蚯o類(lèi)似物產(chǎn)生時(shí),將材料轉(zhuǎn)移到連續(xù)光照條件下,光照強(qiáng)度為2 000 lx,培養(yǎng)溫度不變。培養(yǎng)結(jié)束后,統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理原球莖誘導(dǎo)情況。
原球莖誘導(dǎo)率/%=產(chǎn)生原球莖的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)
1.2.2 玫瑰石斛原球莖的增殖試驗(yàn)
將上一步獲得的玫瑰石斛原球莖從外植體上剝離下來(lái),將其轉(zhuǎn)接到已配制好的增殖培養(yǎng)基上。增殖培養(yǎng)基采用 MS為基本培養(yǎng)基,附加不同量的2,4-D、NAA和BA。培養(yǎng)基容器采用150 mL廣口三角瓶,每瓶加入30 mL培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)到5.8,蔗糖添加量為30 g/L,采用7 g/L瓊脂粉進(jìn)行固化,經(jīng)過(guò)高溫滅菌后備用。每個(gè)處理重復(fù)10瓶,每瓶接種原球莖塊數(shù)為5。將接種好的材料放置在組培室中進(jìn)行原球莖增殖培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為24 h連續(xù)光照,光照強(qiáng)度為2 000 Lx,培養(yǎng)溫度26 ℃。培養(yǎng)后每天進(jìn)行試驗(yàn)觀察,記錄試驗(yàn)情況。經(jīng)過(guò)大約30 d培養(yǎng),調(diào)查試驗(yàn)結(jié)果并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
由表1可知,不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)玫瑰石斛誘導(dǎo)效果差異明顯。具體來(lái)看,只加入 2,4-D時(shí),在葉片基部誘導(dǎo)出愈傷組織,到培養(yǎng)后期,未出現(xiàn)原球莖結(jié)構(gòu),說(shuō)明2,4-D只能誘導(dǎo)出愈傷組織。只加入 BA時(shí),沒(méi)有愈傷組織或原球莖出現(xiàn),葉片出現(xiàn)增大現(xiàn)象,說(shuō)明只使用分裂素不能誘導(dǎo)玫瑰石斛產(chǎn)生原球莖。當(dāng)加入 2.0 mg/L的 BA與2,4-D時(shí),在葉片基部逐漸出現(xiàn)原球莖結(jié)構(gòu),但生長(zhǎng)速度較慢,說(shuō)明在分裂素與2,4-D配合使用時(shí)可誘導(dǎo)出原球莖。為了提高原球莖的生長(zhǎng)速度,在培養(yǎng)基中加入了NAA。結(jié)果顯示,在BA濃度為1.0 mg/L時(shí),加入2,4-D并附加NAA后,初期有類(lèi)似原球莖產(chǎn)生,隨著培養(yǎng)時(shí)間增加,逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橛鷤M織,說(shuō)明較低濃度的 BA和較高濃度的2,4-D以及有NAA共同存在時(shí),細(xì)胞容易轉(zhuǎn)變?yōu)楸”诩?xì)胞,最終轉(zhuǎn)變?yōu)橛鷤M織細(xì)胞。當(dāng)采用2.0 mg/L的BA與2,4-D附加0.5 mg/L的NAA時(shí),誘導(dǎo)原球莖的效率與生長(zhǎng)速度明顯增加,說(shuō)明NAA在原球莖加速生長(zhǎng)方面起到了促進(jìn)作用。綜合以上結(jié)果,試驗(yàn)最終選擇玫瑰石斛原球莖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+2.0 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L BA+0.5 mg/L NAA。
表1 不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)玫瑰石斛原球莖試驗(yàn)結(jié)果
從表2可以看出,在不同的增殖培養(yǎng)基上,玫瑰石斛原球莖的增殖與生長(zhǎng)情況各不相同。具體來(lái)看,在繼續(xù)使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基 MS+2.0 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L BA+0.5 mg/L NAA時(shí),原球莖開(kāi)始增長(zhǎng),但逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)松散的愈傷組織。當(dāng)降低 2,4-D使用濃度時(shí),原球莖生長(zhǎng)速度較快,但在培養(yǎng)后期,原球莖顏色變白,質(zhì)地變軟,并向著愈傷組織轉(zhuǎn)變,這說(shuō)明加入 2,4-D時(shí),原球莖會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)橛鷤M織。只使用 BA原球莖的生長(zhǎng)速度較慢,且結(jié)構(gòu)緊密,不是理想的原球莖類(lèi)型,增加 BA用量,增殖速度變得更慢,同時(shí)原球莖緊密結(jié)合在一起,形成一團(tuán)組織,說(shuō)明只使用分裂素不利于其增殖培養(yǎng)。為此在培養(yǎng)基中加入了NAA,加入后生長(zhǎng)狀況明顯改變,生長(zhǎng)速度加快,結(jié)構(gòu)也變得松散。對(duì)比0.5 m/L BA 與1.0 m/L BA,后者增殖效果更好一些,并可保持穩(wěn)定原球莖長(zhǎng)時(shí)間繼代培養(yǎng)。因此,選用MS+1.0 mg/L BA+0.2 mg/L NAA增殖培養(yǎng)基,玫瑰石斛原球莖可以穩(wěn)定增殖生長(zhǎng)。
表2 玫瑰石斛原球莖在不同培養(yǎng)基上的增殖結(jié)果
原球莖是多肉類(lèi)植物在組培期間出現(xiàn)的一種特殊的組織結(jié)構(gòu),與胚性愈傷組織有著本質(zhì)的區(qū)別。原球莖實(shí)質(zhì)是球形不定芽結(jié)構(gòu),這種球形結(jié)構(gòu)可在一定的培養(yǎng)基上形成完整的植株,是一種理想的組培快繁材料或人工種子的包埋物。胚性愈傷組織則是一種特殊愈傷組織,它具有愈傷組織的主要特點(diǎn),但又有其獨(dú)特性,是一種個(gè)體小、細(xì)胞質(zhì)濃,分裂旺盛的愈傷組織,可以在無(wú)激素的培養(yǎng)基上形成胚狀體,進(jìn)而發(fā)育成苗[13]。原球莖通常使用植物激素誘導(dǎo),首先,必須使用細(xì)胞分裂素,原球莖的誘導(dǎo)實(shí)際是分生組織的增殖過(guò)程,要求培養(yǎng)基中含有一定量的分裂素促進(jìn)細(xì)胞增殖,同時(shí)也要加入一定量的生長(zhǎng)素,促進(jìn)原球莖細(xì)胞的快速生長(zhǎng)[14]。如黃靖等[15]在鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo)中使用了BA與NAA,誘導(dǎo)出了原球莖,而在本試驗(yàn)中,除了使用這兩種激素外,還加入了2,4-D,其主要作用不是使細(xì)胞脫分化轉(zhuǎn)變?yōu)橛鷤M織細(xì)胞,而是加快細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此,其用量一定要準(zhǔn)確控制,過(guò)多會(huì)造成愈傷組織產(chǎn)生。在誘導(dǎo)原球莖過(guò)程中,適當(dāng)減少滲透壓也可以促進(jìn)原球莖的形成,因?yàn)樵蚯o細(xì)胞快速生長(zhǎng)時(shí),低滲透壓可以為細(xì)胞快速生長(zhǎng)提供快速的營(yíng)養(yǎng)與水分,如古碧珠等[16]在蘭花種子的原球莖誘導(dǎo)試驗(yàn)時(shí),采用 B5培養(yǎng)基有利于原球莖的誘導(dǎo)和分化。但有些植物中也可用 MS等滲透壓較高的培養(yǎng)基培養(yǎng),如本試驗(yàn)就采用 MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)玫瑰石斛原球莖,誘導(dǎo)率可達(dá) 94%。另外,蘇江等利用玫瑰石斛的莖段為外植體進(jìn)行了原球莖的誘導(dǎo),而本試驗(yàn)采用帶有葉鞘組織的葉片為外植體同樣可以誘導(dǎo)出原球莖,因?yàn)槿~片葉鞘組織和莖段中均含有一定量的分生組織,這些分生組織可能對(duì)原球莖的分化有促進(jìn)作用??傊蚯o的誘導(dǎo)一定要根據(jù)試驗(yàn)材料采用適合的培養(yǎng)條件才能獲得理想的原球莖。
本研究得出,利用玫瑰石斛葉片誘導(dǎo)原球莖的適宜方法為:將玫瑰石斛組培苗帶葉鞘葉片接種于MS+2.0 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L BA+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)30 d,并繼代培養(yǎng)2次,每次培養(yǎng)時(shí)間為20 d。玫瑰石斛原球莖適宜的增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L BA+0.2 mg/L NAA。本試驗(yàn)結(jié)果可為玫瑰石斛人工種子的研制提供依據(jù)。