楊旭，楊亞亞，曹燕，丁向彬，郭益文，郭宏，劉新峰

（天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

驢為馬屬動(dòng)物，具有性情溫和、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、便于飼養(yǎng)等特點(diǎn)[1]。近年來(lái)隨著人們生活水平的逐漸提高，驢作為“使役工具”的時(shí)代已經(jīng)過(guò)去，而驢本身及其副產(chǎn)品逐漸演變成人們生活中的“營(yíng)養(yǎng)食品”或“藥用食品”，如驢乳、驢肉、驢皮、驢鞭、驢血、驢骨等都具有很高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值。目前已知，驢肉中蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸以及微量元素的含量均高于豬、牛和羊肉，而脂肪含量低于豬、牛和羊肉[2-3]。據(jù)報(bào)道，全世界養(yǎng)驢數(shù)在 1996年時(shí)已達(dá)到4 346.7萬(wàn)頭，其中養(yǎng)驢數(shù)目最多的是亞洲，達(dá)2 131.6萬(wàn)頭，中國(guó)的養(yǎng)驢數(shù)占到亞洲的51.24%，達(dá)1 092.3萬(wàn)頭。但到1997年統(tǒng)計(jì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，全世界養(yǎng)驢數(shù)減少到 4 331.8萬(wàn)頭，我國(guó)減少到1 073.3萬(wàn)頭[4]。截至2016年，我國(guó)養(yǎng)驢數(shù)僅為456.9萬(wàn)頭，占世界驢存欄量4 412.56萬(wàn)頭的10.35%[5]。驢養(yǎng)殖數(shù)量的持續(xù)下降，主要與國(guó)內(nèi)外養(yǎng)殖業(yè)以豬、牛、羊養(yǎng)殖為主，驢品種資源少、繁殖效率低有關(guān)。精液保存的目的是能最大限度地延長(zhǎng)精子的存活時(shí)間且維持其受精能力。保存的精液經(jīng)不同地區(qū)間的運(yùn)輸，可擴(kuò)大精液的使用范圍、增加受配動(dòng)物的數(shù)量、提高種公畜的利用效率，使優(yōu)良種公畜的繁殖潛力和遺傳優(yōu)勢(shì)得到充分發(fā)揮。目前，驢精液保存的相關(guān)研究還比較少，隨著養(yǎng)驢業(yè)的興起和不斷發(fā)展，開展驢精液保存的研究，不僅可以解決我國(guó)驢存欄量持續(xù)減少和養(yǎng)驢規(guī)模日益縮小的問(wèn)題，也可進(jìn)一步推動(dòng)養(yǎng)驢生產(chǎn)的發(fā)展。本文主要針對(duì)驢精液的低溫保存展開研究，以期篩選出適合驢精液的低溫保存稀釋液及稀釋液的過(guò)濾方式，旨在為提高驢的繁殖效率奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇4～6歲健康的種公驢5頭，且具有正常生殖能力，種公驢均由天津龍?zhí)煨竽琉B(yǎng)殖有限公司提供并養(yǎng)殖，每日定時(shí)飼喂，自由采食，自由飲水。

1.2 試驗(yàn)試劑

三羥甲基氨基甲烷（Tris），北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；檸檬酸，天津大學(xué)科威公司生產(chǎn)；葡萄糖，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；果糖、青霉素和鏈霉素均由 Amresco生產(chǎn)；氧化石墨烯，AFNANO.INT生產(chǎn)；VC，Alfa Aesar（china）生產(chǎn)；VE，東京化成工業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 稀釋液的配置

（1）基礎(chǔ)液的配置：Tris，3.04 g；檸檬酸，1.70 g；葡萄糖，1.5 g；果糖，1.5 g；青霉素，0.08 g；鏈霉素，0.14 g；雙蒸水100 mL。（2）稀釋液的配置：取適量基礎(chǔ)液，按體積百分比添加 15%卵黃作為低溫保存基礎(chǔ)液；取適量低溫保存基礎(chǔ)液分別添加不同濃度的VC、VE和氧化石墨烯（見試驗(yàn)分組），開展后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 試驗(yàn)分組

（1）稀釋液過(guò)濾方式：第一組為基礎(chǔ)液添加15%卵黃后過(guò)濾；第二組為基礎(chǔ)液過(guò)濾后再添加15%卵黃；第三組為卵黃過(guò)濾后，再按 15%的體積百分比添加到基礎(chǔ)液中（各組的過(guò)濾方式均為先用0.45 μm孔徑的過(guò)濾器過(guò)濾，再用0.22 μm孔徑的過(guò)濾器過(guò)濾）。（2）VC添加組：取適量低溫保存的基礎(chǔ)液過(guò)濾后再添加 15%卵黃的稀釋液，分別按100、200、300 μg/100 mL濃度添加VC。（3）VE添加組：取適量低溫保存的基礎(chǔ)液過(guò)濾后再添加15%卵黃的稀釋液，分別按5%、10%、15%濃度添加VE。（4）氧化石墨烯添加組：取適量低溫保存的基礎(chǔ)液過(guò)濾后再添加 15%卵黃的稀釋液，分別按 20%、25%、30%濃度添加氧化石墨烯。

1.3.3 鮮精的采集及低溫保存

使用假陰道法采集精液，4層無(wú)菌紗布過(guò)濾，收集到50 mL滅菌離心管內(nèi)。將采集的鮮精和各組稀釋液分別按體積比為1∶2的方式添加到5 mL滅菌離心管中，混合均勻后將離心管封口放入盛有25 ℃水的燒杯中，轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱中保存，每隔24 h或48 h觀察精子的活率，并進(jìn)行記錄。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)用SPSS 20.0進(jìn)行處理，用方差分析做差異顯著性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)結(jié)果均用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”進(jìn)行表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋液不同過(guò)濾方式對(duì)驢精子低溫保存活率的影響

由表1可見，在低溫保存2、4、6 d后，3組間精子活率均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；在低溫保存1 d后3組間精子活率均有顯著性差異（P＜0.05），且第二組稀釋液中精子活率最高；在低溫保存3 d后，第二組和第三組間精子活率存在顯著差異（P＜0.05），但第一組與其他兩組間差異不顯著（P＞0.05）；在低溫保存5 d后，第二組與第一組和第三組間精子活率均有極顯著差異（P＜0.01），而第一組和第三組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。綜合以上結(jié)果，分析可知第二組精子低溫保存效果優(yōu)于第一組和第三組。

表1 稀釋液不同過(guò)濾方式對(duì)驢精子低溫保存活率的影響

2.2 不同濃度VC對(duì)驢精子低溫保存活率的影響

由表2可見，添加3種不同濃度VC的稀釋液，在低溫保存4、6 d后3組間精子的活率均無(wú)顯著差異（P＞0.05）；在低溫保存 2 d時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加100 μg/100 mL VC的稀釋液精子活率最高，與添加200和300 μg/100 mL VC的稀釋液組間的精子活率存在顯著性差異（P＜0.05），但添加 200和300 μg/100 mL VC的稀釋液組間的精子活率無(wú)顯著差異（P＞0.05）；進(jìn)一步分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低溫保存8 d后與低溫保存2 d后的試驗(yàn)結(jié)果截然相反，添加200和300 μg/ 100 mL VC的稀釋液組間無(wú)顯著差異（P＞0.05），但與添加100 μg/100 mL VC的稀釋液組的精子活率均存在顯著差異（P＜0.05）。結(jié)合以上結(jié)果分析認(rèn)為，添加200和300 μg/ 100 mL VC的稀釋液比較適合驢精子的低溫保存。

表2 不同濃度VC對(duì)驢精子低溫保存活率的影響

2.3 不同濃度VE對(duì)驢精子低溫保存活率的影響

由表3可見，在低溫保存2 d后，添加5% VE稀釋液中的精子活率極顯著高于添加濃度為 10%VE的稀釋液（P＜0.01），顯著高于添加濃度為15%VE的稀釋液（P＜0.05）；在低溫保存4和6 d后，3組精子間的活率均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；在低溫保存8 d后，添加15% VE的稀釋液保存的精子活率最低，且與其他兩組相比有顯著性差異（P＜0.05）；在低溫保存10 d后，添加5% VE的稀釋液中精子活率最高，與添加濃度為 10% 和15% VE的稀釋液組間的精子活率存在極顯著差異（P＜0.01）；綜上分析可知，當(dāng)稀釋液中VE的濃度為5%時(shí)最適合驢精子的低溫保存。

表3 不同濃度VE對(duì)驢精子低溫保存活率的影響

2.4 不同濃度氧化石墨烯對(duì)驢精子低溫保存活率的影響

由表4可見，在低溫保存2 d后，添加30%氧化石墨烯稀釋液與添加 25%氧化石墨烯稀釋液中的精子活率存在極顯著性差異（P＜0.01），添加30%氧化石墨烯稀釋液與添加 20%氧化石墨烯稀釋液中的精子活率存在顯著性差異（P＜0.05），添加20%氧化石墨烯稀釋液與添加 25%氧化石墨烯稀釋液中的精子活率無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；在低溫保存4和6 d后，3組稀釋液保存的精子活率均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；在低溫保存8 d后，3組不同濃度稀釋液中的精子活率均有顯著性差異（P＜0.05），添加 30%氧化石墨烯稀釋液中的精子活率高于其他2組。綜上分析可知，當(dāng)稀釋液中氧化石墨烯的濃度為 30%時(shí)，較適合驢精子的低溫保存。

表4 不同濃度氧化石墨烯對(duì)驢精子低溫保存活率的影響

3 討論

稀釋液的無(wú)菌程度可影響精子的保存時(shí)間。通常情況下，在進(jìn)行精子保存時(shí)，只對(duì)配制基礎(chǔ)液的水作無(wú)菌處理，而對(duì)配制好的基礎(chǔ)液及基礎(chǔ)液中添加的卵黃都不做進(jìn)一步的無(wú)菌處理，基于此，本研究針對(duì)基礎(chǔ)液及添加的卵黃進(jìn)行不同方式的過(guò)濾處理，盡量達(dá)到無(wú)菌的要求，進(jìn)一步篩選出可以延長(zhǎng)精子保存時(shí)間的過(guò)濾方式。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)過(guò)濾基礎(chǔ)液后再添加卵黃對(duì)驢精子保存的效果優(yōu)于單獨(dú)過(guò)濾卵黃后再添加到基礎(chǔ)液中的保存效果，同時(shí)也優(yōu)于卵黃添加后再進(jìn)行過(guò)濾的保存效果。本研究結(jié)果表明，單獨(dú)過(guò)濾基礎(chǔ)液可以提升基礎(chǔ)液的無(wú)菌程度，使驢精子的保存效果更好，但過(guò)濾卵黃后驢精子保存效果較差。分析原因，可能是因?yàn)槁腰S過(guò)濾后破壞或減少了卵黃中有利于精子保存的物質(zhì)。已有報(bào)道表明，卵黃中對(duì)精子起保護(hù)作用的主要是卵磷脂，含卵黃的精液保存液可以獲得比較理想的保存效果[6]。Rota等研究發(fā)現(xiàn)，添加2%的卵黃對(duì)驢精子進(jìn)行凍存，解凍后精子的活力會(huì)增強(qiáng)[7]。這些報(bào)道證實(shí)了卵黃對(duì)精子保存的重要性。

VC作為常見的抗氧化劑，已有將VC應(yīng)用在精液保存中的報(bào)道。趙憲林等研究發(fā)現(xiàn) VC可提高精子低溫保存后的活率及頂體完整率，并且可以降低低溫保存對(duì)精子的危害[8]。姚桂東等研究也發(fā)現(xiàn)，VC有緩解熱應(yīng)激的功效[9]，在低溫保存時(shí)會(huì)有緩慢降溫的操作，稀釋液中添加 VC可以減弱溫度突然降低時(shí)對(duì)精子的損傷。本次試驗(yàn)也證實(shí)添加 VC后，驢精子的存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，在第八天時(shí)精子活率在0.40以上。

VE是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化劑，對(duì)細(xì)胞膜、線粒體或網(wǎng)狀組織的磷脂有著特殊的親和性，可以親和在膜的特定部位，預(yù)防或阻止誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，使之無(wú)法生成過(guò)氧化脂質(zhì)的老化因子，從而起到保護(hù)精子膜免受氧化損傷的作用，有效減輕精子細(xì)胞受到的氧化應(yīng)激損傷程度，保護(hù)精子的正常性能[10-12]。張樹山研究也證實(shí)VE可提高精液凍存后的活率和頂體完整率[13]，本試驗(yàn)通過(guò)在稀釋液中添加不同濃度 VE對(duì)驢精子進(jìn)行低溫保存，發(fā)現(xiàn) VE的添加確實(shí)可以延長(zhǎng)驢精子的存活時(shí)間，其中VE添加濃度為5%時(shí)保存效果最好，保存第十天時(shí)精子平均活率仍然接近0.30。

氧化石墨烯是石墨烯的衍生物，表面有很多羧基，可以很好地和大量帶有正電荷的物質(zhì)基團(tuán)結(jié)合，比石墨烯的親水性更強(qiáng)，氧化程度更高，被廣泛應(yīng)用于生物藥學(xué)方面[14]。陳利萍等[15]研究也發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯具有抗氧化的作用。中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所王健君首次將氧化石墨烯作為抗氧化劑應(yīng)用于低溫凍存馬精子，并發(fā)現(xiàn)具有很好的保存效果，馬精子的活率從24.3%提高到71.3%。迄今為止，氧化石墨烯在哺乳動(dòng)物精子保存方面的研究鮮見報(bào)道。本次試驗(yàn)通過(guò)在稀釋液中添加不同濃度的氧化石墨烯對(duì)驢精子的低溫保存效果進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，添加氧化石墨烯的稀釋液濃度為 30%時(shí)最適合精子的低溫保存，在保存第八天時(shí)精子平均活率仍然接近0.30。