李 娟，晏和熙，李紅梅，呂麗瓊，曾曉鋒，代解杰

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，昆明 650500； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，實(shí)驗(yàn)樹鼩標(biāo)準(zhǔn)化與應(yīng)用研究云南省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，昆明 650118； 3.昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，昆明 650500)

眾所周知，HIV感染和毒品濫用是當(dāng)今世界上嚴(yán)重兩大的社會(huì)和公共衛(wèi)生問題，目前臨床使用的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(cART)雖然改善了HIV感染者的健康狀況，但是不能改善HIV相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知障礙(HAND)的癥狀，因此，HAND仍然是HIV感染者面臨的主要問題之一[1]，而毒品的濫用增加了HAND的風(fēng)險(xiǎn)。METH即甲基苯丙胺(Mmethamphetamine, METH)也稱為“冰毒”，會(huì)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的正常發(fā)揮。甲基苯丙胺濫用常常伴隨HIV病毒的感染，而且甲基苯丙胺可以影響HIV病毒的復(fù)制和發(fā)病機(jī)制[2]，這些HIV感染者也表現(xiàn)出更大的神經(jīng)損傷和更高的認(rèn)知能力下降。

HIV-1Tat蛋白是一種病毒蛋白，可以通過誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡、自噬以及神經(jīng)突觸的改變，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，是HAND的主要致病因子之一[3-4]。而METH能夠刺激多巴胺神經(jīng)元產(chǎn)生活性氧分子(ROS)從而導(dǎo)致谷氨酸代謝異常[5]，因而產(chǎn)生神經(jīng)毒性。之前我們報(bào)道，METH和HIV-1Tat蛋白可以顯著增加神經(jīng)細(xì)胞凋亡和自噬的風(fēng)險(xiǎn)，兩者具有協(xié)同作用[6-7]，然而這種協(xié)同作用的分子機(jī)制還不清楚。

細(xì)胞死亡可以是偶然死亡，也可以是程序化死亡，都是為了維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。程序性細(xì)胞死亡依賴于特定的信號(hào)通路，導(dǎo)致裂解或非裂解形態(tài)，有凋亡(apoptosis)和自噬(autophagy)兩種形式。自噬意即細(xì)胞的自我吞噬，是通過降解和回收細(xì)胞成分來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，需要超過30多種自噬相關(guān)蛋白(ATG)來進(jìn)行調(diào)節(jié)這個(gè)過程[8]。樹鼩(Tupaia Belangeri)雖然是一種小型哺乳動(dòng)物，但是因?yàn)樗c人類的親緣關(guān)系相近，一些研究人員甚至將樹鼩歸類為一種獨(dú)立的哺乳動(dòng)物分類群[9]，而且樹鼩大腦較發(fā)達(dá)，因此很多研究者將樹鼩作為研究人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動(dòng)物模型。

之前我們已經(jīng)報(bào)道METH和HIV-1Tat蛋白能夠協(xié)同誘導(dǎo)樹鼩中腦神經(jīng)元自噬，而ATG5/7蛋白參與了兩者誘導(dǎo)的自噬，METH和HIV-1Tat蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激可能是引起自噬的基本原因[7]。據(jù)研究應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬初期可能會(huì)起到保護(hù)細(xì)胞的作用，但應(yīng)激狀態(tài)持續(xù)，細(xì)胞無法適應(yīng)這種應(yīng)激，則會(huì)引起細(xì)胞凋亡[10]。ATG5和ATG7作為兩種重要的自噬相關(guān)蛋白參與了METH和HIV-Tat蛋白誘導(dǎo)的自噬，對(duì)于維持細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境有一定的作用，然而氧化應(yīng)激持續(xù)進(jìn)行時(shí)，細(xì)胞是如何調(diào)節(jié)自噬并不完全被了解。而本研究則進(jìn)一步證實(shí)METH和HIV-1Tat蛋白通過增加ATG5/7基因的表達(dá)上調(diào)ATG5/7蛋白，進(jìn)而調(diào)控兩者誘導(dǎo)的神經(jīng)元自噬，探討自噬的潛在機(jī)制，揭示吸毒人員引起的艾滋病腦病的發(fā)病機(jī)制，對(duì)于尋找合適的藥物治療靶點(diǎn)有一定的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

中緬樹鼩滇西亞種(Tree Shrew, Tupaia Belangeri Chinesis)(新生3 d內(nèi))10只，普通級(jí)，雌雄各半，體重9.1～ 16.5 g，平均(13.1±1.2) g，選取身體虛弱，母樹鼩不給予哺乳、出生3 d內(nèi)的乳樹鼩，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)[SCXK(滇)K2018-0002]，使用許可證號(hào)[SYXK(滇)K2018-0002]。同時(shí)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了本研究(DWSP2017053)，實(shí)驗(yàn)過程中按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則，所有樹鼩給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

LC3B rabbit Ab(2775s)，Beclin-1 rabbit Ab(3738s)，Anti-rabbit IgG-HRP(7074s)，Anti-mouse IgG-HRP(7076s)購于Cell Signaling Technology公司。ATG5 rabbit Ab(ab108327)，ATG7 rabbit Ab(ab133528)購于abcam公司。Anti-β-Actin Mouse Ab(A1978)購于Sigma公司；胎牛血清(1739464)，B27 supplement(50X)(17504-044)，Pen Strep(15140-122)，0.25% Trypsin-EDTA(25200-056)，Neurobasal-a 培養(yǎng)基(10888-022)購于Gibco公司；DMEM/F12 培養(yǎng)基(SH30023.01)購于Hyclone公司；Western Blot 相關(guān)試劑購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；HIV-Tat蛋白Clade-B(HIV-129-c)購于PROSPEC公司，甲基苯丙胺(化學(xué)對(duì)照品，純度>99%，Methylamphetamine)(171212-200603)購于中國藥品生物制品檢定所；RNAzol RNA提取試劑(RN190)購于MRC公司，RT-PCR一步法RT-PCR試劑盒SYBR Green染料法(1708892)購于BIO-RAD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樹鼩中腦神經(jīng)元分離、培養(yǎng)

樹鼩中腦神經(jīng)元分離、培養(yǎng)方法見參考文獻(xiàn)[7]。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)、合成

從NCBI數(shù)據(jù)庫中查找ATG5和ATG7的序列，設(shè)計(jì)qRT-PCR檢測(cè)引物, ATG5引物序列正向：5’- GCCATCAATCGGAAACTCAT-3’，反向：5’-CACAGGACGGAACAGCTTCT-3’，ATG7引物序列正向：5’-GCCCTGTGTCTTCCAGAGAG-5’，反向：5’- AGTGCCGTGACTCCTTCTGT-3’；同時(shí)以GADPH作為內(nèi)參基因，GAPDH引物序列正向：5’-CAT GGC ACC GTC AAG GCT GAG AA-3’，反向：5’-CAG TGG ACT CCA CGA CGT ACT CA-3’，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.3 RNA提取以及熒光定量RT-PCR

采用TRIzol 法提取樹鼩中腦神經(jīng)元中的mRNA，并對(duì)其進(jìn)行濃度和純度的測(cè)定。使用一步法SYBR Green熒光PCR進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算分析。

1.3.4 Western blot

用Western和IP裂解液提取蛋白，經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白濃度。取25 μg蛋白，經(jīng)SDS-PAGE蛋白分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h，隨后加入一抗(LC3、Beclin-1、ATG5、ATG7，稀釋比例均為1∶1000，β-actin 稀釋比例為1∶2000)，4℃孵育過夜，用1×PBST 清洗干凈后，放入二抗中室溫孵育2 h，用ECL顯色液顯色，利用Image J軟件分析灰度值，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析使用SPSS 19.0和GraphPad Prism 6.00軟件，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，結(jié)果以P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HIV-1Tat蛋白和/或METH誘導(dǎo)的Beclin-1、 LC3B、ATG5/7蛋白使用Bliss獨(dú)立模型(Bliss independence model)計(jì)算兩者是否具有協(xié)同效應(yīng)，效應(yīng)值< 1為協(xié)同(synergistic)=1 為疊加(additive)，> 1為拮抗(antagonistic)[11]。

2 結(jié)果

2.1 METH和HIV-1Tat蛋白協(xié)同誘導(dǎo)樹鼩中腦神經(jīng)元自噬

根據(jù)之前研究結(jié)果[7]本文用HIV-1Tat蛋白(100 nmol/L)單獨(dú) /聯(lián)合 METH(0.5 mmol/L)作用細(xì)胞24 h，檢測(cè)細(xì)胞中自噬蛋白Beclin-1和 LC3B蛋白的表達(dá)水平(圖1)。 METH和HIV-1Tat蛋白均可以提高細(xì)胞中Beclin-1和 LC3B蛋白的表達(dá)，與對(duì)照組相比，HIV-1Tat蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞Beclin-1和LC3B蛋白的表達(dá)分別上升了2.2倍(P<0.05)和 1.8倍(P<0.001)；METH誘導(dǎo)細(xì)胞Beclin-1和LC3B蛋白表達(dá)分別上升了3.4 倍(P<0.05)和 2.3倍(P<0.01)。 METH和HIV-1Tat蛋白聯(lián)合作用細(xì)胞后，細(xì)胞中Beclin-1和LC3B蛋白明顯升高，高于其余組，有顯著性差異(P<0.001)。METH和HIV-1Tat蛋白兩者聯(lián)合誘導(dǎo)細(xì)胞Beclin-1和LC3B蛋白的效應(yīng)值分別是0.77和0.76，具有協(xié)同效應(yīng)。

2.2 ATG5和ATG7參與了兩者誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬

本文檢測(cè)了細(xì)胞中自噬蛋白ATG5/7的表達(dá)水平，如圖2所示：給予細(xì)胞METH和HIV-1Tat蛋白治療后，細(xì)胞中ATG5/7蛋白表達(dá)量升高。HIV-1Tat蛋白單獨(dú)作用細(xì)胞后，細(xì)胞中ATG5/7蛋白表達(dá)比對(duì)照組分別上調(diào)了1.1倍(P<0.05)和1.0倍(P<0.01)，METH作用細(xì)胞后，細(xì)胞中ATG5/7蛋白表達(dá)比對(duì)照組上調(diào)了1.2倍(P<0.05)和1.0倍(P<0.01)，而兩者同時(shí)作用細(xì)胞后，細(xì)胞中ATG5/7蛋白表達(dá)量明顯上升，作用效應(yīng)分別是0.84(ATG5)和0.64(ATG7)，具有協(xié)同效應(yīng)。而PCR結(jié)果顯示(圖3)，單獨(dú)給予HIV-1Tat蛋白治療后，ATG5/7基因的表達(dá)量升高，分別是對(duì)照組的99倍(P<0.05)和129倍(P<0.01)；單獨(dú)應(yīng)用METH治療后ATG5/7基因的表達(dá)量也升高，分別是對(duì)照組的114倍(P<0.01)和128倍(P<0.01)；HIV-1Tat蛋白和METH兩者聯(lián)合明顯上調(diào)ATG5/7的表達(dá)量，與單獨(dú)藥物組和對(duì)照組比，差異有顯著性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注： A：WB結(jié)果；B： Beclin-1蛋白灰度值與β-action灰度值比值；C： LC3B蛋白灰度值與β-action灰度值比值?；叶戎禍y(cè)定用Image J軟件，數(shù)據(jù)分析及作圖使用Graphpad Prism軟件。與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與M+T組相比，# P<0.05，###P<0.001。圖1 METH和HIV-1Tat蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞后Beclin-1和LC3B蛋白表達(dá)Note. A， The data were analyzed using western blotting. B， The ratio of Beclin-1/β-action. C， The ratio of LC3B/β-action. The data were quantified by Image J software, and displayed using a scatterplot with bars showing the means and individual data points of each column by Graphpad Prism software. Representative blot images are shown.Compared with control.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. Compared with M+T. #P < 0.05,### P<0.001.Figure 1 Cells were exposed to HIV-1Tat protein and/or METH for 24 h and the protein levels of Beclin-1 and LC3B were analyzed by Western blot.

注: A：WB結(jié)果；B：ATG5蛋白灰度值與β-action灰度值比值；C：ATG7蛋白灰度值與β-action灰度值比值?；叶戎禍y(cè)定用Image J軟件，數(shù)據(jù)分析及作圖使用Graphpad Prism軟件。與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與M+T組相比，# P<0.05，###P<0.001。圖2 METH和HIV-1Tat蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞ATG5和ATG7蛋白表達(dá)Note. A, The data were analyzed using western blotting. B, The ratio of ATG5/β-action. C, The ratio of ATG7/β-action. The data were quantified by Image J software, and displayed using a scatterplot with bars showing the means and individual data points of each column by Graphpad Prism software. Representative blot images are shown.Compared with control.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. Compared with M+T,#P<0.05,##P<0.01.Figure 2 Cells were exposed to HIV-1Tat protein and/or METH for 24 h and the protein levels of ATG5 and ATG7 were analyzed by Western blot

注:與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與M+T組相比，#P<0.05，##P<0.01。圖3 METH和HIV-1Tat蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞ATG5和ATG7基因表達(dá)Note. A, The expression levels of mRNA ATG5. B, The expression levels of mRNA ATG7. The data were calculated and analyzed by 2-ΔΔCT method, and displayed using a scatterplot with bars showing the means and individual data points of each column by Graphpad Prism software.Compared with control,*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001. Compared with M+T,# P<0.05, ##P<0.01. Figure 3 Cells were exposed to HIV-1Tat protein and/or METH for 24 h and the expression levels of mRNA ATG5 and ATG7

3 討論

HIV感染者濫用METH增加了HAND發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)研究，METH通過下降神經(jīng)突觸前和突觸后蛋白降低HIV-1Tat轉(zhuǎn)基因(Tat-Tg)小鼠的工作記憶和空間記憶，并且服用METH的Tat-Tg小鼠在空間記憶方面具有明顯的缺陷[12]。METH和HIV-1Tat能協(xié)同增強(qiáng)大鼠和SH-SY5Y細(xì)胞(人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而損傷大鼠的血腦屏障，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬，增加神經(jīng)毒性[13-14]。

哺乳動(dòng)物的自噬可以在缺氧、饑餓、病毒侵入等應(yīng)激情況下增強(qiáng)，有利于細(xì)胞的存活，但是過度自噬則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在酵母和哺乳動(dòng)物中，有兩種泛素樣(ubiquitin-like, UBL)蛋白的共軛系統(tǒng)利于噬菌體擴(kuò)大延伸[15]，其中一個(gè)系統(tǒng)是ATG12-ATG5-ATG16復(fù)合體。在酵母中，ATG5依賴E1激酶而激活，而ATG7作為一種獨(dú)特的E1酶，激活A(yù)TG12并將其轉(zhuǎn)化為不同的E2酶[16]。研究發(fā)現(xiàn)ATG5/7依賴性自噬在嗎啡成癮以及神經(jīng)元樹突調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[17]。Zheng等[18]通過Ad-ATG5/7重組腺病毒轉(zhuǎn)染小鼠軟骨細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)ATG5/7蛋白可以通過PERK信號(hào)通路促進(jìn)自噬。Yang等[19]認(rèn)為METH通過AKT/mTOR信號(hào)通路調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞自噬，而天麻素能夠減輕其誘導(dǎo)的自噬，從而起到保護(hù)作用。在本研究中，METH和HIV-1Tat蛋白協(xié)同可以顯著上調(diào)ATG5/7基因的表達(dá)水平，從而調(diào)控蛋白表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞自噬，增加細(xì)胞毒性。

本研究的結(jié)果揭示METH和HIV-1Tat蛋白通過上調(diào)ATG5/7基因的表達(dá)，協(xié)同誘導(dǎo)樹鼩中腦神經(jīng)元自噬，從而為了解HIV感染的METH吸毒患者神經(jīng)認(rèn)知障礙的分子機(jī)制提供了新的見解和理論依據(jù)。同時(shí)樹鼩的原代中腦神經(jīng)元可以作為研究HIV-1Tat蛋白和METH自噬的一個(gè)模型，為進(jìn)一步的研究提供一個(gè)新的方向。