郭 平，許敏華，張晶晶，金小寶，李小波，馬 艷

(廣東藥科大學(xué) 生物活性藥物研究重點實驗室，廣州 510006)

原發(fā)性肝癌是目前常見的惡性腫瘤之一[1-2]。建立自發(fā)轉(zhuǎn)移且便于觀察的人肝癌裸鼠模型是研究人肝癌的發(fā)展規(guī)律的基礎(chǔ)。復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所建立的高轉(zhuǎn)移人肝癌細胞系MHCC97H、HCCLM3以及高轉(zhuǎn)移人肝細胞癌裸鼠模型等為肝癌治療及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)研究提供了有效的手段，但這些模型不能連續(xù)、直觀地觀察原位腫瘤及肺和腹腔轉(zhuǎn)移灶，定量也不夠準確[3-4]。Yang等建立一種可用熒光蛋白監(jiān)視的人肝細胞癌裸鼠模型，可通過活體熒光成像，無創(chuàng)診斷和監(jiān)測小鼠體內(nèi)腫瘤，但生物體內(nèi)有些物質(zhì)在受到激發(fā)光后也產(chǎn)生熒光，造成假陽性[5-6]。后有學(xué)者構(gòu)建穩(wěn)定表達熒光素酶基因Luc人肝癌細胞株建立裸鼠原位模型，可以體外實時監(jiān)測活體動物體內(nèi)肝臟腫瘤的生長情況，并能靈敏可靠地用于抗腫瘤治療效果的評價，但未探討腫瘤轉(zhuǎn)移情況[7-11]。

本研究采用肝內(nèi)細胞懸液移植法和腫瘤組織塊移植法建立Luc-GFP標記的高轉(zhuǎn)移性人肝癌細胞裸鼠原位肝癌模型，通過非侵襲性的生物發(fā)光成像技術(shù)和激發(fā)熒光成像技術(shù)，在活體水平觀察兩種方法建立的裸鼠原位肝癌模型腫瘤生長和轉(zhuǎn)移情況，可監(jiān)控腫瘤的生長、評價治療效果以及腫瘤的轉(zhuǎn)移。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級 BALB/c裸小鼠24只，6～8周齡，雄性，體重18～22 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心[SCXK(粵)2016-0002]。實驗地點為廣東藥科大學(xué)實驗動物中心[SYXK(粵)2016-0125]小鼠飼養(yǎng)在SPF條件下，動物實驗程序批準號:IACUC-201805036，使用3R原則對待實驗動物。

1.2 主要試劑與儀器

MEM培養(yǎng)基、胰酶消化液和澳洲胎牛血清(FBS)均購自Gibco公司，熒光素酶底物-D-熒光素鉀鹽購自上海翊圣生物科技有限公司，pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro和psiCHECK-2載體由廣州賽哲生物股份有限公司饋贈。人肝癌細胞株(HCCLM3)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢)，由本實驗室保存。手術(shù)器械：手術(shù)剪、眼科彎鑷、直鑷，持針鉗、縫合針(4×10)、7-0縫合線均購自廣州速研究生物科技有限公司。主要儀器:熒光倒置相差顯微鏡CKX41FS購自日本Olympus公司，ATP熒光檢測儀Systemsure plus購自美國Hygiena公司，化學(xué)發(fā)光圖片分析系統(tǒng)Tanon5200購自上海天能公司，實時熒光定量PCR儀CFXTM購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 PCR擴增Luc基因

根據(jù)載體上Luc基因序列和慢病毒表達載體上多克隆位點設(shè)計2條特異性引物P1、P2，以載體為模版，引物P1、P2擴增Luc基因序列。

1.3.2 構(gòu)建pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro慢病毒重組表達載體

對PCR擴增的Luc基因產(chǎn)物進行雙酶切，參照文獻[12]，獲得目的基因Luc，連接到相同酶切的慢病毒表達載體，構(gòu)建重組表達載體pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro，經(jīng)篩選、酶切鑒定后送去測序。

1.3.3 Luc-GFP標記的人肝癌細胞HCCLM3-Luc-GFP的構(gòu)建及鑒定

人肝癌細胞株HCCLM3培養(yǎng)于含10% FBS的MEM培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期細胞接種，過夜后轉(zhuǎn)染，加入總體積300 μL，含包裝有重組表達載體病毒液及聚凝胺的培養(yǎng)基，5 h后補加入300 μL新鮮培養(yǎng)基以稀釋聚凝胺，1 d后更換為600μL含病毒液的培養(yǎng)基，3d后觀察細胞熒光發(fā)光情況。

向轉(zhuǎn)染后的人肝癌細胞每2d更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基進行細胞篩選并觀察細胞形態(tài)及熒光發(fā)光情況，調(diào)整細胞密度為8×105 cell/ mL，進行倍比稀釋獲得4個梯度細胞數(shù)。分別將倍比稀釋的細胞懸液各取200 μL并加入相同濃度的熒光素酶底物，觀察細胞熒光發(fā)光情況。

1.3.4 裸鼠原位肝癌模型的構(gòu)建

(1)細胞懸液注射法：細胞懸液注射法：取對數(shù)生長期的HCCLM3-Luc-GFP細胞，胰酶消化調(diào)整細胞密度為5×107 cell/ mL，將裸小鼠戊巴比妥溶液麻醉，沿左肋緣下方開腹，暴露出肝臟左葉，使用無菌微量進樣器分別將10 μL、20 μL細胞懸液緩慢注射入肝臟，將肝臟輕送回腹腔，縫合腹壁關(guān)腹，每天定時觀察裸小鼠的情況。

(2)腫瘤組織塊植入法：皮下移植瘤的建立：將處于對數(shù)生長期的HCCLM3- Luc -GFP細胞，胰酶消化調(diào)整細胞密度為2×107 cell/mL，取100 μL細胞懸液接種于裸鼠右肢腋下。待皮下瘤有明顯生長，無菌條件下分離皮下腫瘤塊，在無菌生理鹽水中切成 1 mm×1 mm×1 mm備用。瘤組織離體后30 min內(nèi)植入裸鼠肝臟。

(3)肝原位腫瘤組織種植：將裸小鼠戊巴比妥腹腔注射麻醉。沿左肋緣下方開腹，暴露出肝臟左葉，用尖頭眼科鑷沿肝臟包膜刺一隧道，植入上述切好的腫瘤組織塊，將肝臟輕送回腹腔，縫合腹壁關(guān)腹，每天定時觀察裸小鼠的情況。

1.3.5 活體成像觀察荷瘤裸鼠腫瘤生長情況

在裸小鼠原位肝癌植入后第1、2、3、4和 5周 ，按荷瘤裸鼠體重，腹腔注射相應(yīng)體積的戊巴比妥麻醉劑及熒光素酶混懸，分別進行生物發(fā)光和綠色熒光下成像，檢測荷瘤裸鼠腫瘤進展情況，根據(jù)發(fā)光的強弱比較兩種方法構(gòu)建的裸鼠原位肝癌模型以及不同發(fā)光技術(shù)的差異。

1.3.6 病理解剖觀察荷瘤裸鼠腫瘤形態(tài)及肺轉(zhuǎn)移情況

第7周成像結(jié)束后，戊巴比妥麻醉裸鼠，打開腹腔和胸腔，觀察肝臟腫瘤組織的大體形態(tài)、生長浸潤情況以及遠處轉(zhuǎn)移情況。取肺，用Bouin's液固定2 d后，無水乙醇浸泡洗脫12 h，觀察肺轉(zhuǎn)移灶。蘇木素-伊紅(HE)染色，鏡下觀察肝臟腫瘤和肺轉(zhuǎn)移灶的病理情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增 Luc基因

如圖1所示，有清晰的特異性目的條帶，大小在1.6 kb～1.8 kb 之間，與理論值相符。

2.2 重組表達載體的鑒定

雙酶切鑒定，得到2個片段(見圖2)，Luc基因在1.6 kb～1.8 kb之間，慢病毒重組表達載體片段在7.0 kb～10.0 kb之間，酶切結(jié)果與預(yù)期相符。測序結(jié)果目的基因Luc無突變，重組表達載體構(gòu)建成功。

注：M：Marker；1～4：P1、P2為引物擴增的Luc基因片段。圖1 PCR擴增Luc基因電泳圖Note. M, Marker. 1-4, amplified Luc gene fragment.Figure 1 PCR amplification of Luc gene electrophoresis

注: M1：Marker；M2： Marker；1～4：慢病毒重組表達載體、單酶切XbaⅠ、單酶切BamHⅠ、雙酶切XbaⅠ和BamH 。圖2 重組表達載體酶切鑒定圖Note. M1,Marker.M2,Marker.1,Lentiviral recombinant expression vector without digestion 2,pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro plasmid digested by XbaⅠ. 3,pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro plasmid digested by BamHⅠ. 4,pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro plasmid digested by XbaⅠ and BamH.Figure 2 Identification of recombinant expression vector by enzyme digestion

2.3 pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro轉(zhuǎn)染肝癌細胞后熒光鑒定

慢病毒轉(zhuǎn)染人肝癌細胞后3 d，在倒置熒光顯微鏡白光下觀察，在白光條件下轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染的細胞形態(tài)沒有明顯差異，在激發(fā)光條件下觀察，相比較于未轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后的人肝癌細胞有明顯綠色熒光且均勻的分布于整個細胞(見圖3)。

2.4 陽性克隆細胞株熒光素酶活性分析

將嘌呤霉素抗性篩選后的HCCLM3-Luc-GFP，梯度稀釋后加入相同濃度熒光素酶底物，進行熒光素酶活性檢測。結(jié)果顯示(見表1)，轉(zhuǎn)染組熒光相比較于未轉(zhuǎn)染組熒光值明顯提高，并且隨著細胞密度數(shù)量的增加熒光值也會增加。

2.5 細胞懸液注射法構(gòu)建裸鼠肝癌模型的活體成像觀察

HCCLM3-Luc-GFP細胞在裸鼠肝內(nèi)接種(見圖4)后的第1周即可通過活體成像系統(tǒng)檢測到生物發(fā)光信號，隨著時間的延長，熒光信號逐漸增強，在接種后第5 周熒光信號達到最強，細胞接種量為10 μL第3 周有遠處轉(zhuǎn)移、細胞接種量為20 μL第1 周有遠處轉(zhuǎn)移(見圖5)。

表1 細胞熒光素酶活性測定

注：未轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)染比較，*P<0.05。

Note. Compared with no-transfection,*P< 0.05.

圖4 肝癌細胞懸液法原位移植瘤的手術(shù)過程Figure 4 Surgical procedure of establishing liver cancer by liver cancer cell suspension method

注：A：Luc生物發(fā)光檢測；B：GFP綠色熒光檢測。圖5 細胞懸液接種法的活體成像Note. A, Luc bioluminescence detection；B, GFP green fluorescence detection.Figure 5 In vivo imaging of cell suspension inoculation

2.6 腫瘤組織塊植入法構(gòu)建裸鼠肝癌模型的活體成像觀察

HCCLM3-Luc-GFP細胞注射到裸鼠腋下皮下，可見明顯皮丘，約10 d左右見瘤體生長，待瘤體直徑至6 mm時，取腫瘤組織進行肝原位種植(見圖6)。應(yīng)用Tanon 5200 MμLti 動物活體成像系統(tǒng)檢測荷瘤裸鼠腫瘤動態(tài)變化，接種后的第2 周于種植部位可見生物發(fā)光信號隨著時間的延長即腫瘤的生長而逐漸增強，然而GFP標記在肝原位發(fā)光不明顯(見圖7)。

2.7 腫瘤組織實體觀察

肝原位腫瘤生長5周后，處死裸小鼠，解剖暴露肝，發(fā)現(xiàn)兩種方法肝上都有質(zhì)地較硬顏色灰白色的腫瘤組織，如圖8A所示：肝臟表面有多個病灶且體積小，腫瘤塊均勻分布于肝，圖8B所示肝臟表面病灶單一且體積大，幾乎覆蓋于整個肝，腫瘤聚集生長不能滲透于整個肝。肺組織顏色發(fā)現(xiàn)，黃色的肺組織中有白色腫瘤轉(zhuǎn)移灶見圖8C，圖9 HE染色結(jié)果顯示，肝臟原位腫瘤和肺轉(zhuǎn)移可見腫瘤結(jié)節(jié)。

3 討論

裸鼠原位肝癌模型一直以來都是肝癌研究領(lǐng)域的重要工具，對于肝癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移機制研究及抗肝癌新途徑的探索都具有重要的應(yīng)用價值[13-14]。目前，構(gòu)建裸鼠原位肝癌模型的方法主要有腫瘤組織塊植入法和細胞混懸液接種法[15-16]，但是這些方法都有各自的優(yōu)缺點。本文通過兩種不同的方法成功構(gòu)建肝原位模型，并且成瘤率均為100%，但組織塊接種法只在肝種植部位局部生長；而細胞懸液法則整葉肝都能成瘤，且有明顯的肝外轉(zhuǎn)移，可能細胞容易擴散，更能模擬出腫瘤生長的微環(huán)境。本課題組在模型構(gòu)建中，發(fā)現(xiàn)50 μL細胞體積大，肝容易破裂、部分細胞懸液溢出；建議盡量提高細胞濃度，減少注射體積，可減少肝損傷，避免腫瘤腹腔內(nèi)廣泛種植。

本文研究了細胞懸液注射法和腫瘤組織塊植入法兩種方法建立的高轉(zhuǎn)移性人肝癌細胞裸鼠原位肝癌模型腫瘤生長和轉(zhuǎn)移情況，比較了綠色熒光蛋白[17-18]和熒光素酶[19-20]在裸鼠原位肝癌模型中的活體成像效果的差異，本實驗選用了綠色熒光蛋白和熒光素酶作為報告基因，同時用于分子成像，綜合了兩者優(yōu)勢的同時彌補了彼此的不足，為以后研究者在選擇構(gòu)建便于活體觀察且高轉(zhuǎn)移的人肝癌裸鼠模型方面提供了幫助。

圖6 肝癌腫瘤組織塊法移植瘤的手術(shù)過程Figure 6 Surgical procedure of tumor tissue transplantation method for establishing liver cancer

注：A：Luc生物發(fā)光檢測；B：GFP綠色熒光檢測。圖7 腫瘤組織塊法的活體成像Note. A， Luc bioluminescence detection.B, GFP green fluorescence detection.Figure 7 In vivo imaging of tumor tissue transplantation method

注：A:細胞懸液法種植肝原位腫瘤; B:腫瘤組織塊法種植肝原位腫瘤;C:Bouin’s染色后的組織。圖8 腫瘤實體觀察Note. A, Establishment of liver cancer by liver cancer cell suspension. B, Establishment of liver cancer by tumor tissue transplantation. C, Bouin’s stained lung tissue.Figure 8 Observation of tumor entities

注：A肝臟原位腫瘤; B肝臟腫瘤的肺轉(zhuǎn)移。圖9 腫瘤HE染色Note. A，liver tumor in situ. B,pulmonary metastasis of liver tumors.Figure 9 Tumor HE staining