姜巖，周和平，張哲，劉紅兵，沈順祥

（重慶工商大學廢油資源化技術與裝備教育部工程研究中心，重慶400067）

石油勘探、開采技術不斷發(fā)展，促進了高緯度、高寒地區(qū)的原油開采，由此帶來的環(huán)境污染也日趨嚴重。據統(tǒng)計，美國平均每年發(fā)生99 次陸地管道泄漏事件，這些事故多發(fā)生在寒區(qū)，以阿拉斯加地區(qū)為例，1996—1999年有120萬加侖油液泄漏到凍土中[1]。俄羅斯情況更加嚴峻，雖然僅有9%的輸油管道處于凍土區(qū)，但其泄漏事故卻占總事故率的17%，特別是近年來，俄羅斯管道泄露的原油量竟高達30 萬桶。高寒地區(qū)輸油管線易受損，且難于維護，是導致原油泄漏的主要原因。在我國，以青藏高原的格爾木-拉薩原油輸油管線為代表，從建成至今已發(fā)生了30多次原油泄漏事故[2]。相較于常溫地區(qū)，寒區(qū)的氣溫較低，生物多樣性差，這些都導致寒區(qū)生態(tài)系統(tǒng)比較脆弱，原油污染會對微生物代謝活性造成較大的抑制作用，生態(tài)恢復需要更長時間。

不僅在高寒或高緯度地區(qū)，在諸多的實地生物修復中，北方地區(qū)氣溫處于理想溫度環(huán)境中的時間往往僅有幾個月，修復周期經歷的低溫環(huán)境更長。在低溫期，細胞代謝受到抑制，生物修復系統(tǒng)的運轉受到嚴重影響，因而在實地修復中經常被忽視，缺乏必要的針對性研究和有效的工程控制手段。事實上，可以將這一時期分為兩個階段：15～25℃時，細胞活力雖然明顯下降，但是對于多數土著微生物而言，仍保持了較高的生理生化特性，這一時期應該給予高度重視，實施針對性受控修復；在低于15℃左右時，優(yōu)勢土著微生物的群落結構將發(fā)生顯著變化，中溫微生物的代謝活力基本受到抑制，取而代之的嗜冷菌和耐冷菌在生物修復中逐漸發(fā)揮越來越大的作用。另外值得思考的是，在常規(guī)的修復工程中，中低溫期一般處于生物修復的中后期，即在旺盛修復期之后，此時，污染場地殘留的營養(yǎng)鹽等修復因子可以滿足代謝能力明顯下降的土著微生物，這樣可以在有效控制成本的基礎上，提高修復效率。當然，這是要建立在針對性受控研究基礎上，而這種受控則主要圍繞低溫土著微生物的生理特性開展。

在國內，遼寧大學和吉林大學對這方面做了較多研究，趙全[3]從遼寧撫順石油二廠曝氣池中分離、篩選得到25株耐低溫石油烴降解菌，在10～15℃、pH為6～9的優(yōu)化條件下，對2000mg/L柴油的降解效率高達71%。國外對低溫降解菌的研究起步較早，除開展菌種選育工作外，對石油烴代謝途徑和降解菌適冷機制的研究也較為全面。Whyte 等[4]從北極土壤中分離出兩株假單胞菌，在5～25℃條件下均能降解C5～C12的烷烴、甲苯和萘，且具有alk和nah的代謝途徑。利用單一培養(yǎng)菌株，便于開展降解特性、工藝條件、代謝機制等更為廣闊的研究，而對混合培養(yǎng)菌株的關注，則更多集中在提高修復效率等工藝方面。Yang等[5]將青藏高原分離的細菌在20℃條件下進行混合培養(yǎng)，研究其對原油污染土壤的低溫修復，結果表明諾卡式菌和紅球菌混合培養(yǎng)相較于單一菌株的修復效果提高了一倍，除油率高達100%。為了追求修復效率，細胞固定化技術也被嘗試應用到生物修復研究中。鞏春娟[6]利用不同載體固定化耐低溫多環(huán)芳烴降解菌，發(fā)現在10℃，投菌量為10%～15%時，以玉米芯為載體的固定化混合菌，對含30mg/kg菲、芘和芭的土壤進行60天的生物修復，污染物去除率達到了64.38%?？梢?，利用多種菌株混合降解或是利用固定化細胞技術都可以不同程度地提高生物修復效率。

本文針對實地修復中經常被忽視的低溫期，通過討論低溫微生物的研究現狀，分析石油烴低溫降解機制及細胞適冷機制，從而指導低溫期生物修復，縮短修復周期，提高修復效率。

1 低溫降解菌研究現狀

在生物修復進入低溫期后，耐冷菌的優(yōu)勢體現出來，它們廣泛分布在溫帶及亞溫帶的江河、湖底靜水層以及高原、戈壁等晝夜溫差較大的地區(qū)。這類菌可以在20℃以上的溫度環(huán)境中生長并降解石油烴，這一特性對于生物修復至關重要。不過，這也使在這一時期的生物修復更為復雜，究竟是耐冷菌成為優(yōu)勢土著微生物，還是中溫菌仍保留了更強的活力對修復產生更大貢獻，亦或是二者兼而有之，還有待針對不同的污染場地進行深入研究，進而用于指導過渡期生物修復手段的實施。隨著生物修復轉入更為寒冷的低溫期，中溫微生物的代謝活性基本被抑制，此時，嗜冷菌逐漸活躍起來，這類微生物主要分布在南北極、深海、高原以及常年積雪的高山[7]，其最適宜生長溫度在15℃以下，即便在凍土環(huán)境中也能實現代謝，在高寒和高緯度污染區(qū)塊的生物修復中發(fā)揮了主要作用。

在低溫菌的石油烴降解特性及修復研究中，海洋石油污染現象一直較為嚴重，因而海洋低溫石油烴降解菌得到了更多的研究?，F已發(fā)現的海洋低溫石油烴降解菌包括：鞘氨醇單胞菌屬、海桿菌屬、海單胞菌屬、鹽單胞菌屬、嗜冷桿菌屬、科爾韋爾氏菌屬、油螺旋菌屬、不動桿菌屬、希瓦氏菌屬、假交替單胞菌屬、假單胞菌屬、噬細胞菌屬、節(jié)細菌屬和紅球菌屬等[8-10]。這些菌屬大多從靠近南北兩極海域或是冬季海洋水域中分離得到，其中海底沉積物和表層水體分離出的優(yōu)勢菌株更具代表性，尤以假單孢菌屬和紅球菌屬的研究報道較多，其中的部分成果已經應用到實地生物修復實驗中，取得了良好的修復效果。相比于水體，土壤中富含礦物質、有機物、無機物等微生物生長所需的各種營養(yǎng)物質，更有助于各類土著微生物的生長和代謝，因此土壤中分離出的低溫石油烴降解菌的種類更加廣泛。表1 總結了部分典型的陸生低溫石油烴降解菌，可以看出，在南北兩極、高山和高原地區(qū)發(fā)現了大量的低溫石油烴降解菌，這些微生物以革蘭氏陰性細菌為主，真菌和酵母菌的報道較少。對于這部分菌的研究多在4～20℃，其中10℃和15℃最為集中。此外，進一步研究發(fā)現，陸生低溫石油烴降解菌與來自海洋的微生物也有相似之處，以假單胞菌屬和紅球菌屬研究居多。國外關于低溫菌的研究起步較早，在降解機制和適冷機制方面研究較多，而國內關于這方面的報道不多，在今后應該得到足夠重視。

2 石油烴低溫生物降解（圖1）

2.1 烷烴降解

圖1 石油烴低溫降解途徑

表1 典型低溫石油烴降解菌

烷烴的結構相較于苯及其同系物和芳烴來說相對簡單，降解也更容易，對其降解機制的研究相對較多，也更加具體和全面。細胞攝取是細胞分解代謝烷烴的第一步，這方面的報道較多，歸納起來細胞主要通過黏附、乳化和增溶三種作用攝取烷烴，并且這三種作用與蠟脂、糖脂、表面活性劑、脂肪酸，乃至細胞的嗜冷機制密切相關，Whyte、Barabas 等[30-31]分別報道了這些機制。當溫度降低時，低溫菌細胞的黏附性和乳化活性增加而增溶活性降低。因此，在細胞對烷烴的攝取中，小分子水溶性烷烴可通過直接運輸進入細胞，而中鏈烷烴和長鏈烷烴則可能通過微器官黏著烴類液滴或利用表面活性劑被微生物攝取[32]。細胞在低溫條件下攝取烷烴后，進入生物修復最為核心的環(huán)節(jié)，即分解代謝。圖1為石油烴低溫降解途徑，微生物通過脫氫作用、羥化作用和過氧化作用逐步氧化烷烴，生成相應的醇、醛和酸，后經β-氧化成乙酰輔酶A 或進入三羧酸循環(huán)，最終分解為水和二氧化碳并釋放能量。對于環(huán)烷烴，分子結構中不具備末端甲基，而是含有亞甲基，它的生物降解遵循了類似鏈烷烴的次末端氧化機制，這對于環(huán)烷烴是一種積極而有利的代謝方式?？傊?，烷烴的降解主要體現在不同的碳末端加氧機制，常見的烷烴加氧機制可以概括為以下4種。

（1）單末端單加氧途徑

單末端單加氧途徑主要基于烷烴單加氧酶的活力，經活化后可以氧化位于直鏈末端的甲基基團，使其脫去兩個氫原子，生成相應的伯醇[式(1)]。Li等[33]發(fā)現了一種長鏈烷烴單加氧酶LadA，利用末端氧化途徑可以將長度在C36以內的長鏈烷烴轉化為芽孢桿菌中相應的伯醇，再繼續(xù)在醇醛脫氫酶的作用下氧化成相應的脂肪酸及醛；而脂肪酸在脂肪酸輔酶A連接酶的作用下轉變成脂肪酸輔酶A，然后經過β-氧化途徑生成乙酰輔酶A，最終進入三羧酸循環(huán)，生成水和二氧化碳?，F有研究表明，這種單末端單加氧機制是細胞利用烷烴最為常見的一種代謝途徑。

（2）次末端單加氧途徑

早在1998年，Whyte等[34]發(fā)現，在利用從安大略湖沉積物中分離出的一株耐低溫紅球菌開展生物降解研究中，在中間代謝產物中檢測出仲醇，這是將底物分子的倒數第二個亞甲基氧化的結果，從而證實了該菌株對十六烷和十二烷的生物降解過程遵循了次末端氧化機制。這種氧化機制也是利用單加氧酶作用于次末端亞甲基，而保留末端甲基基團，從而生成相應的仲醇，再被氧化生成酮和脂類；脂類中的脂鍵裂解后，生成伯醇和脂肪酸，而伯醇可以繼續(xù)氧化成相應的醛，最后形成脂肪酸[式(2)]。Morikawa等[35]發(fā)現這一代謝途徑也存在于諾卡氏菌屬中。

（3）雙末端單加氧途徑

雙末端單加氧途徑主要發(fā)生在難以進入β-氧化途徑進行代謝的烷烴中，部分細菌選擇了ω-氧化途徑對其進行降解，如式(3)，這種機制是在烷烴的雙末端先后氧化甲基基團，形成一元醇的過渡體，最后生成二羥基羧酸產物，更利于氧化反應的進行。這一途徑在Youri 等[36]的最新研究中被證實，來自大腸桿菌的烷烴單加氧酶AlkB 可選擇性的先后氧化正構鏈烷烴的兩個末端。

（4）單末端雙加氧途徑

單末端雙加氧途徑的相關報道很少，這一代謝機制在形式上與單末端單加氧途徑貌似相似，都是氧化形成羧酸，再進入β-氧化途徑，但是，其中間過程存在本質差異。單末端雙加氧途徑是利用了雙加氧酶，而不是上述3種途徑中的單加氧酶，因此代謝過程不形成伯醇等物質，而是如式(4)所示將烷烴直接氧化成羧酸。這一機制被發(fā)現存在于不動桿菌的細胞代謝中，Yasuyoshi等[37]發(fā)現不動桿菌在氧化長鏈烷烴時，正構烷烴通過非常規(guī)氧化轉化為酸的途徑中，先生成烷基氫過氧化物，繼而直接氧化成脂肪酸；并且證實在降解過程中，只需要分子氧（O2）的輔助，不需要NAD(P)H等輔酶的參與。

在烷烴的生物降解中，細胞受到低溫的影響而調節(jié)代謝機制以適應特定環(huán)境。單末端單加氧途徑是微生物最為常見的代謝途徑，但對于單末端雙加氧途徑的認知最少，是唯一被發(fā)現采用了雙加氧酶的代謝機制；另一個特點是，在低溫環(huán)境中無法利用β-氧化途徑的微生物，細胞有能力自身調節(jié)利用ω-氧化機制實現烷烴的降解?？傮w而言，在低溫環(huán)境中，細胞相對更易利用烷烴實現代謝，維持自身生長和生理生化特性。除烷烴外，芳香烴作為重要的石油烴其代謝機制也得到了廣泛研究[38-40]，它們的代謝機制有相似之處，降解基因一般都位于細胞的大型分解代謝質粒上，尤其是假單胞菌的OCT、NAH 和TOL 質粒報道較多[4]；但由于分子結構差異較大，其代謝機制存在較大差異。

2.2 苯及其同系物的降解

作為主要石油烴組分的苯系物往往更難降解，由于相關研究較多，其代謝機制已基本達成共識。Zhang 等[16]和Rosa 等[21]分別報道了針對甲苯和苯酚的低溫降解菌（表1）。由于分子中具有苯環(huán)結構，這類物質的代謝途徑也與烷烴顯著不同。由圖2可以看出，這類物質的代謝關鍵步驟之一是依賴脫氫酶及氧化還原酶的作用，在形成二醇中間體后，轉變?yōu)猷彵蕉蛹把苌?，再裂解開環(huán)后進入三羧酸循環(huán)，最終形成乙酰輔酶A和琥珀酸。低溫環(huán)境中的微生物對苯及其同系物進行降解后，會將原來具有毒性的污染物轉化為無毒的代謝產物，最終降解為二氧化碳和水，并合成新細胞[41]。

圖2 苯及其同系物的降解途徑

2.3 多環(huán)芳烴的降解

由于多環(huán)芳烴存在于各類型的油污染場地中，因此其環(huán)境危害及生物可降解性受到高度關注。而且多環(huán)芳烴是公認的一類難降解石油烴，本文作者課題組[42]發(fā)現即使在適宜的環(huán)境條件下，其生物降解率也較低。一旦溫度低于30℃時，盡管仍存在低溫降解特性，但生物降解效率顯著下降。

圖3 多環(huán)芳烴的降解途徑

多環(huán)芳烴的降解通常是通過加氧酶對其進行定位氧化反應。在微生物代謝過程中，真菌和細菌的方式略有不同。真菌通過單加氧酶生成芳烴氧化物，再失氧形成酚類。Gabriel等[43]通過實驗優(yōu)化發(fā)現微皮傘菌在單加氧酶的作用下，對多環(huán)芳烴表現出很強的降解能力。細菌對多環(huán)芳烴的代謝則是通過雙加氧酶啟動的，雙加氧酶介導芳環(huán)羥基化成為順式-二氫二醇，通過脫氫酶再芳構化為二醇中間體，繼而在多組分雙加氧酶（由還原酶、鐵氧還蛋白和鐵硫蛋白組成）的作用下轉化為三羧酸循環(huán)中間體，最終生成二氧化碳和水[44]。本文作者課題組[45-46]在對約氏不動桿菌的研究中發(fā)現，該菌降解PAHs的途徑為水楊酸途徑，PAHs在水楊酸羥化酶和鄰苯二酚2,3-雙加氧酶的作用下進入三羧酸循環(huán)生成二氧化碳和水。

綜上，烷烴、苯類化合物、多環(huán)芳烴具有不同的低溫降解途徑。石油烴結構的差異決定了不同的細胞降解機制。不飽和的直鏈烷烴比飽和的多支鏈烷烴容易降解；支鏈越多的烷烴，可降解性越差，尤其是季碳原子在碳鏈末端時更難于被細胞利用；多環(huán)芳烴類物質降解過程復雜、難度最大，微生物菌屬的不同也遵循了不同的代謝機制，加氧羥化和裂解開環(huán)是細胞代謝過程中的限速步驟。此外，也可以從石油烴分子量的大小探討細胞的生物降解特性。碳原子數決定了石油烴的形態(tài)，如氣態(tài)的甲烷、液態(tài)的乙烷和固態(tài)的瀝青等，根據碳原子數評估石油烴的生物降解特性也有據可循，小分子更難被細胞利用，如C1～C4的石油烴只能被一些特殊的菌株所降解；而C5～C6的石油烴在濃度較高時幾乎不能降解，只有在低濃度環(huán)境中才存在緩慢的生物降解作用；C10～C12的石油烴因其環(huán)境毒性低、底物抑制作用弱，比很多小分子石油烴更易被細胞利用。石油烴能被多數的石油烴降解微生物降解，其差別在于降解率和降解速度；碳原子數在22 以上的石油烴，常溫下是固體且水溶性極差，一般不能被微生物利用。對很多石油烴降解菌而言，其代謝機制在常溫和低溫環(huán)境下差別不大，低溫菌能夠在低溫環(huán)境下利用石油烴實現生理生化反應是因其獨有的適冷機制。

3 低溫石油烴降解菌的適冷機制

溫度是限制生物修復的一個重要因素，當環(huán)境溫度較低時，細胞膜流動緩慢，同時酶的催化活性也會降低，導致細胞內物質轉運和代謝速率會明顯降低，甚至影響到核酸分子結構的穩(wěn)定性，從而使基因的表達受到抑制；如果溫度降低到細胞質的冰點，細胞中的液體會形成冰晶體而對細胞結構造成無法修復的損害。這些問題常常制約著低溫環(huán)境中微生物的生命活動，但長期處于低溫環(huán)境中的微生物在自然選擇的作用下，逐漸形成了一套獨特的適冷機制。

3.1 調節(jié)脂肪酸的組成

細胞膜是微生物進行營養(yǎng)物質交換及保持細胞內離子濃度平衡的重要結構。當溫度降低時，細胞膜的流動性減弱，細胞正常的新陳代謝受到嚴重影響。在低溫環(huán)境中，存在于脂質雙分子層中的脂肪酸將在低溫脅迫下發(fā)生改變，其不飽和脂肪酸的比例增加是調整細胞膜流動性最常見的調節(jié)方式。Merja 和Simo[47]研究了溫度在10～40℃時，枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌細胞脂肪酸含量的變化情況，發(fā)現溫度降低會導致不飽和脂肪酸含量增加；此外，這兩個菌株中低熔點脂肪酸的含量均有所提高，這表明不飽和脂肪酸的含量變化與微生物的適冷機制有密切關系。進一步的結果在近年被證實，Stanislava[48]通過研究南極黃桿菌膜脂肪酸及其對寒冷脅迫的適應反應，證實該菌較同菌屬的其他中溫和嗜熱菌會產生更多的不飽和脂肪酸，并且發(fā)現低溫微生物的細胞膜主要由支鏈脂肪酸和不飽和脂肪酸構成，從而降低了細胞膜內脂類的熔點，使得在低溫環(huán)境中細胞膜仍能維持液態(tài)和流動態(tài)。由此可見，不飽和脂肪酸對于微生物的適冷機制有重要作用。

除了增加不飽和脂肪酸這種較為常見的調節(jié)方式外，還存在著另外4種調節(jié)方式：減小大分子脂肪酸和環(huán)狀脂肪酸的數量，增加支鏈分支和順式異構脂肪酸的含量。這些調節(jié)方式破壞了磷脂雙分子層的填充順序并降低了填充密度，從而使液相轉變?yōu)槟z相的溫度降低，即使在低溫環(huán)境下也保持了細胞膜的流動性[49]。此外，增加脂類物質含量和細胞膜面積，也有利于細胞在低溫環(huán)境下對營養(yǎng)物質的吸收。脂肪酸的調節(jié)機制對于細胞保持流動性，降低細胞內容物冰點，維持低溫活性發(fā)揮著重要作用。

3.2 低溫促進蛋白的表達

蛋白質對于微生物的適冷機制非常重要，在低溫環(huán)境下，微生物會通過自身調節(jié)來增加蛋白質的含量。Marle 和Gancel[50]將嗜水氣單胞菌在5～30℃進行冷沖擊以確定其適應性反應，通過雙向電泳分析發(fā)現了三種變化，除了很少數的蛋白質表達不足、很多蛋白質表達過度外，還有許多新蛋白質產生。由此可見，低溫促進了細胞內各種蛋白質基因的表達，從而提高其在低溫環(huán)境下的適應性。關于低溫誘導蛋白質表達已有較多研究。Jones 等[51]發(fā)現當培養(yǎng)溫度從37℃驟降至10℃后，大腸桿菌細胞內的冷誘導蛋白表達量最高增加了約10 倍，并且在細胞中發(fā)現了9 種冷休克蛋白，其中Csp A 是主要的冷休克蛋白，占所有冷休克蛋白的10%，Csp A、Csp B及Csp G均為由低溫誘導。這表明低溫環(huán)境可能會影響細胞核糖體對不同蛋白質的翻譯效果，進而生成適應低溫環(huán)境的蛋白。Corien 等[52]在16℃、4℃和-4℃三種溫度條件下，利用嗜冷桿菌對生長過程中蛋白質的豐度模式進行研究，結果表明在冰點以下的生長過程中，細胞的能量生產、蛋白質合成和轉運受到特定的壓力，同時膜轉運蛋白上調，表明細胞通過細胞膜上轉運蛋白的增加來抵消降低的擴散速率和低溫運輸。相比之下，許多中溫菌在較低溫度下無法合成蛋白質，一方面是其核糖體無法適應低溫環(huán)境，影響翻譯過程，另一方面，由于細胞膜在低溫下營養(yǎng)物質無法交換而導致細胞繁殖受阻。因此，微生物在低溫環(huán)境下的適應能力，與核糖體翻譯機制的適應性以及保持完好膜結構的能力有關。

3.3 特殊蛋白的合成

低溫不僅可以促進蛋白質的表達，還可以誘導某些特殊蛋白的合成，從而對微生物的適冷機制做出貢獻。現已發(fā)現，當溫度下降時，微生物體內可能產生一類特殊的蛋白，這類蛋白源于耐冷細菌的自身調節(jié)機制，通過產生冷休克蛋白來應對環(huán)境溫度的變化，故此被稱作冷激蛋白。溫度變化幅度決定了冷激蛋白的生成，這是一種適應外界溫度急劇下降的特殊形式的基因表達，以促進細胞適應低溫環(huán)境。對此一般認為，在低溫環(huán)境中，冷休克蛋白作為RNA 的分子伴侶可以與mRNA 穩(wěn)定結合，促進其翻譯。Zhang 等[53]發(fā)現冷休克蛋白動態(tài)調整mRNA 的二級結構，以全面調節(jié)蛋白質的表達水平，在此過程中，冷休克蛋白將自己的表達調整為細胞需求，實現整體翻譯的動態(tài)控制。除了冷休克蛋白，近年來人們發(fā)現在低溫環(huán)境中微生物還能合成冷適應蛋白，這類蛋白的不同之處在于其可以抑制冰的形成。最新研究發(fā)現，PAMC20917 的基因組編碼產生冷休克蛋白以外，還產生了一種冰結合蛋白，可抑制冰的產生，使細菌適應寒冷的環(huán)境[54]。冷適應蛋白的發(fā)現，提出了一種全新的適冷機制，即通過抑制冰的形成來提高細胞的低溫適應能力。近期，Brininger 等[55]更是發(fā)現冷適應蛋白質可以通過增加空腔的方式來減少冰的形成，同時空腔數量的增加促進了水分子的進入，繼而提高了酶的活力。不同的微生物細胞在應對溫度變化時，可能合成特異性蛋白，以產生不同的適冷機制。

3.4 酶分子獨特的適應性

低溫環(huán)境下酶的活力，是研究細胞適冷機制無法回避的基礎問題。隨著溫度降低，酶活力總體呈下降趨勢，但由適冷微生物產生的大多數酶能夠保持相對較高的酶活水平。Wi 等[56]從北冰洋分離到一株芽孢桿菌，從中提取出脂肪酶BpL5，并在大腸桿菌模式菌株中成功實現了重組，該酶在5℃時仍保持了在優(yōu)化條件下（pH=9.0、20℃）85%的酶活水平。到目前為止，大多數低溫微生物分泌的酶被證實在中低溫環(huán)境下保持了較高的活性，與嗜溫和嗜熱同源酶相比，冷適應酶結構相對穩(wěn)定、能適應更低的溫度環(huán)境。Kim 等[57]對來自北極地區(qū)的Aquaspirillium arcticum菌中的蘋果酸脫氫酶Aa MDH在結晶分離后進行分析，證實該酶在4～10℃時催化效率是同源嗜中溫和嗜熱MDH 的2～3 倍，比較三者的結構發(fā)現，活性位點殘基相對柔性的增加、底物與輔因子表面電荷分布的良好，以及亞基間離子對相互作用的減少，可能是Aa MDH在低溫下保持高效催化活性的主要因素。此外，適冷酶還可以通過減少鹽橋、疏水基團及芳香烴反應等，提高酶分子空間結構的可塑性，實現快速改變構象以保持高的催化活力，繼而高效地實施底物代謝。低溫脅迫下酶的這種特異性，使細胞能夠在低溫環(huán)境中保持正常的新陳代謝[58]。

目前，國內外關于低溫菌適冷機制的認知主要體現在上述四個方面。細胞通過調節(jié)脂肪酸含量、蛋白的表達及分泌冷適應酶等機制來耐受低溫環(huán)境?，F有研究證實，石油烴的代謝機制在低溫環(huán)境與中溫環(huán)境下差別并不大，但獨特的適冷機制是低溫微生物能夠實現低溫代謝的根本原因，這對于探索低溫期生物修復將起到決定性作用。

4 結語

生物法修復污染場地技術已較為成熟，特別是石油烴污染場地的生物修復，一直是研究熱點。由于中溫好氧微生物的特點，長期以來關于該領域的相關研究主要聚焦在理想的溫度環(huán)境中，對于漫長的低溫期缺乏足夠的重視。當前，已有超過百余屬種的微生物被發(fā)現具有不同程度的低溫降解特性，其中以紅球菌屬和假單胞菌屬研究居多，它們廣泛分布在陸地和海洋中，對于去除環(huán)境中的石油烴發(fā)揮著重要作用。低溫菌對于石油烴的代謝遵循了不同的機制，鏈狀石油烴的生物降解主要依靠碳鏈末端或次末端不同的加氧機制，而苯和多環(huán)芳烴類等具有環(huán)狀結構的石油烴則遵循了不同的分子羥化和加氧機制以實現開環(huán)裂解。微生物對于各類型石油烴的低溫降解能力與細胞的適冷特性密切相關。微生物的適冷機制較復雜，且尚未完全認知。一般認為，溫度降低誘導細胞內不飽和脂肪酸的形成，有效降低了細胞膜內脂類化合物的熔點，從而使細胞膜能夠在低溫環(huán)境中始終保持流動態(tài)；蛋白的表達與合成也被認為是重要的適冷機制，轉運蛋白的表達量增加促進了營養(yǎng)物質在低溫環(huán)境下的跨膜轉運，而冷休克蛋白和冷適應蛋白的低溫合成則有效抑制了細胞內冰的形成，保持了細胞的生物活性；此外，一些研究認為，細胞的低溫降解特性還被認為與酶保持高效生理活性有關?？傮w而言，低溫期修復研究將成為生物修復技術發(fā)展的方向之一，深入闡釋低溫菌的代謝與適冷機制有利于指導低溫期生物修復手段的實施，經濟且有效地提高生物修復效率。