許 琦，趙 月，黃偉健，宋琳亮，康 生，劉 毅，和 君*，傅江南*

(1.暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心，廣州 510632； 2.西安富康空氣凈化設(shè)備工程有限公司 西安 710000)

傳遞窗作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障設(shè)施內(nèi)物品傳遞的通道上的一種重要?dú)⒕O(shè)備，主要用于潔凈區(qū)與非潔凈區(qū)、潔凈區(qū)與潔凈區(qū)之間物品的傳遞，以避免其受到環(huán)境的污染。常用的傳遞窗是利用紫外線(波長(zhǎng)在225～275 nm，峰值253.7 nm)照射，產(chǎn)生能量傳遞和積累而達(dá)到破壞微生物核酸的目的[1]。紫外傳遞窗殺菌效果與紫外線的輸出能量、燈的類型、光的強(qiáng)度和使用時(shí)間有關(guān)。一旦紫外燈管老化，它將喪失30%～50%的光照強(qiáng)度，殺菌能力大打折扣[2]。為此，我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB19258《紫外線殺菌燈》指出紫外燈殺菌最佳時(shí)間為30 min[3-4]。但在實(shí)際應(yīng)用中，尤其是在人流、物流量大的科研中心或動(dòng)物中心，使用30 min的照射時(shí)間，將很大程度上限制屏障環(huán)境的進(jìn)出效率，影響工作效率。針對(duì)紫外燈傳遞窗滅菌效果受多種因素影響且耗時(shí)長(zhǎng)的問題，本研究關(guān)注一種新型高通量氙光傳遞窗，它利用脈沖氙燈極化發(fā)光的原理，通過產(chǎn)生強(qiáng)烈的脈沖紫外光線，可快速對(duì)物品表面和空氣中的各類微生物進(jìn)行滅活[5]。本研究針對(duì)細(xì)菌繁殖體(金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌)[6-8]、細(xì)菌休眠體(枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢體)[9]、真菌(白色念珠菌)[10]這3種微生物形態(tài)的5種標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)傳遞窗不同時(shí)間點(diǎn)的照射，通過與傳統(tǒng)紫外傳遞窗的殺菌效果進(jìn)行對(duì)比分析，從而得到殺菌效果的評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種：金黃色葡萄球菌(簡(jiǎn)稱金葡，ATCC6538)、綠膿桿菌(簡(jiǎn)稱綠膿，ATCC15442)、大腸桿菌(簡(jiǎn)稱大腸，ATCC8099)、白色念珠菌(簡(jiǎn)稱白念，ATCC10231)均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物有限公司；枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢菌片(簡(jiǎn)稱枯草ATCC9372)購(gòu)自北京鑫四環(huán)消毒技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

腦心浸液培養(yǎng)基BHI(海博生物技術(shù)有限公司)；營(yíng)養(yǎng)瓊脂胰蛋白胨大豆瓊脂TSA(海博生物技術(shù)有限公司)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA(環(huán)凱生物科技有限公司)；營(yíng)養(yǎng)瓊脂NA(環(huán)凱生物科技有限公司)；TSB(海博生物技術(shù)有限公司)；胰蛋白胨生理鹽水溶液(TPS)由本實(shí)驗(yàn)室制備。生物梅里埃公司DENSIMAT細(xì)菌濁度儀，MX-F渦旋儀，日本三洋MIR-262恒溫培養(yǎng)箱，傳統(tǒng)紫外傳遞窗(UVPB)，高90 cm×寬80 cm×長(zhǎng)60 cm，配置20 W紫外線消毒燈6支，每支燈管平均輻照度為75.01 μW/cm2。FX-XB-D800高通量氙光傳遞窗(XePB)，高90 cm×寬82 cm×長(zhǎng)88 cm(西安某公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液的制備

按照衛(wèi)生部法監(jiān)發(fā)[2002] 282 號(hào)[11]，復(fù)蘇菌種后，菌種培養(yǎng)至第四代(不同菌種的培養(yǎng)時(shí)間及溫度有所不同，詳見所購(gòu)菌種的微生物檢測(cè)凍干質(zhì)控菌種使用說明書)，挑取菌落接入5 mL TSB營(yíng)養(yǎng)肉湯中，渦旋儀渦旋震蕩20 s，制成菌懸液備用，枯草芽孢桿菌本身即為黑色變種芽孢菌片，直接洗脫制成芽孢懸液。為便于活菌計(jì)數(shù)，細(xì)菌濁度儀讀取菌懸液濃度：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌菌懸液濃度取0.7～1.4 Mcf(麥?zhǔn)蠞岫?；白色念珠菌菌懸液濃度取6.9 Mcf。

1.3.2 菌片的制備

滴片法，將滅菌后的10 mm×10 mm玻片平鋪于無菌平皿，逐片滴加10 μL菌液，自然風(fēng)干后制成菌片。

1.3.3 傳遞窗殺菌檢測(cè)

將菌片平置于無菌平皿中，蓋上編號(hào)，平板放置數(shù)量參考醫(yī)藥工業(yè)潔凈室區(qū)沉降菌的測(cè)試方法中的相關(guān)規(guī)定[12]，傳遞窗內(nèi)中線左右各三分之一處分別放入1皿，高通量氙光傳遞窗照射時(shí)間設(shè)定1 min、3 min、5 min；傳統(tǒng)紫外傳遞窗設(shè)定照射時(shí)間設(shè)定5 min、30 min進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 洗脫培養(yǎng)

照射后將菌片加入5 mL TPS中渦旋洗脫，取1 mL洗脫液于無菌培養(yǎng)皿，同時(shí)每皿倒入50℃，15 mL配置好的TSA培養(yǎng)基，白色念珠菌需倒入PDA培養(yǎng)基，凝固后，按各菌種適宜的培養(yǎng)條件分別進(jìn)行培養(yǎng)。為防止菌落數(shù)過多不便于活菌計(jì)數(shù)，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌陽性菌片洗脫液需按照10-4與10-5比例稀釋后倒板；白色念珠菌陽性菌片洗脫液10-3與10-4稀釋后倒板；枯草芽孢桿菌陽性菌片洗脫液10-1與10-2稀釋后倒板。

1.3.5 活菌計(jì)數(shù)

陽性平板菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即得到每毫升洗脫液中細(xì)菌數(shù)量(N0)。實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，平皿長(zhǎng)菌數(shù)為對(duì)應(yīng)樣每毫升洗脫液中細(xì)菌數(shù)∶

殺菌率=(N0-NX)/N0×100%

式中：N0為每毫升洗脫液中細(xì)菌數(shù)量，NX為照射后每毫升菌片洗脫液中活菌個(gè)數(shù)。每組重復(fù)3次，取平均殺菌率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌繁殖體的抑菌率

紫外傳遞窗燈管為6根環(huán)繞式，其到菌片的直線距離分別為30 cm、52 cm和60 cm，均在表面消毒的有效范圍內(nèi)[13]，因此本研究不單列不同的距離對(duì)殺菌效果的影響。此外，為對(duì)傳遞窗殺菌效率進(jìn)行比較，高通量氙光傳遞窗的建議工作時(shí)長(zhǎng)1 min、3 min、5 min，特選紫外傳遞窗的時(shí)長(zhǎng)為5 min及最佳工作時(shí)長(zhǎng)30 min進(jìn)行比較。高通量氙光傳遞窗照射1～5 min對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及綠膿桿菌的平均殺菌率均可達(dá)99.99%以上。紫外傳遞窗照射5 min對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌無明顯殺滅效果；照射30 min對(duì)金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌方可達(dá)到高通量氙光傳遞窗照射1 min的殺菌率；照射30 min對(duì)大腸桿菌殺滅率達(dá)99.91%。

具體數(shù)據(jù)見表1、圖1、圖2。

2.2 照射對(duì)細(xì)菌休眠體的殺滅情況

高通量氙光傳遞窗照射1 min對(duì)枯草芽孢桿菌的殺菌率達(dá)99.96%，照射3 min、5 min可達(dá)100.00%。紫外傳遞窗照射5 min對(duì)枯草芽孢桿菌的殺滅率僅為45.20%，照射30 min殺菌率大于99.99%具體數(shù)據(jù)見表2、圖3。

2.3 照射對(duì)真菌的殺滅情況

高通量氙光傳遞窗照射1 min、3 min對(duì)白色念珠菌的平均殺菌率達(dá)99.97%，照射5 min殺菌率可達(dá)100.00%。紫外傳遞窗照射5 min對(duì)白色念珠菌無明顯殺滅效果，照射30 min殺菌率達(dá)100.00%。具體數(shù)據(jù)見表3、圖4。

表1 高通量氙光傳遞窗與紫外傳遞窗對(duì)3種細(xì)菌繁殖體的殺滅情況

注：獨(dú)立重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，測(cè)試樣品n=6，陽性菌株n=4。

Note. Repeat 3 experiments independently. Testing samplen=6, Positive strainn=4.

注：A：金黃色葡萄球菌；B：大腸桿菌；C：綠膿桿菌；陽性對(duì)照：陽性洗脫液稀釋后鋪板，培養(yǎng)48 h。圖1 紫外傳遞窗和高通量氙光傳遞窗在不同照射時(shí)間點(diǎn)對(duì)金葡、大腸、綠膿的懸液涂布照射結(jié)果Note. A, Staphylococcus aureus. B, Escherichia coli. C, Pseudomonas aeruginosa. Positive control, The positive eluent was cultured 48 h after dilution.Figure 1 Result of radiation of High-throughput Xenon Ray Pass Box and ultraviolet Pass Box on Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa at different time points

注：A、B、C：高通量氙光傳遞窗(XePB)照射1 min、3 min、5 min,紫外傳遞窗(UVPB)照射30 min后金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌菌片洗脫液的含菌數(shù)。**P<0.01；****P<0.0001。圖2 紫外傳遞窗和高通量氙光傳遞窗在不同照射時(shí)間點(diǎn)對(duì)金葡、大腸、綠膿的差異分析Note. A,B,C, The number of bacteria in the eluent of staphylococcus aureus, escherichia coli and pseudomonas aeruginosa after 1, 3 and 5 min of high-throughput xenon light pass box irradiation and 30 min of uv light pass box irradiationFigure 2 Difference analysis of High-throughput Xenon Ray Pass Box and ultraviolet Pass Box on Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa at different time points

表2 高通量氙光傳遞窗與傳統(tǒng)紫外傳遞窗對(duì)枯草芽孢桿菌的殺滅情況

注：獨(dú)立重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，測(cè)試樣品n=6，陽性菌株n=4。

Note. Repeat 3 experiments independently. Testing samplen=6, Positive strainn=4.

注：A：懸液涂布照射結(jié)果；陽性對(duì)照：陽性洗脫液稀釋后鋪板，培養(yǎng)72 h；B：差異分析。圖3 紫外傳遞窗和高通量氙光傳遞窗在不同照射時(shí)間點(diǎn)對(duì)枯草芽孢的殺滅情況Note. A, Result of radiation. Positive control, The positive eluent was cultured 72 h after dilution.B, Difference analysis.Figure 3 Result of radiation of High-throughput Xenon Ray Pass Box and ultraviolet Pass Box on Bacillus subtilis at different time points.

真菌Fungus高通量氙氣傳遞窗XePB紫外傳遞窗UVPB照射時(shí)間Exposure time 菌落數(shù) Colony forming units殺菌率 Sterilizingrate照射時(shí)間Exposure time 菌落數(shù) Colony forming units殺菌率 Sterilizing rate菌株濃度(CFU/mL)白色念珠菌Candida albicans1 min0.67±0.823 min0.67±0.525 min0 99.97%100% 5 min>300-30 min0100%3×103

注：獨(dú)立重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，測(cè)試樣品n=6，陽性菌株n=4。

Note. Repeat 3 experiments independently. Testing samplen=6, Positive strainn=4.

3 討論

潔凈環(huán)境是確保無菌產(chǎn)品生產(chǎn)的重要影響因素[14]，傳遞窗作為屏障設(shè)施內(nèi)的一種常用的輔助設(shè)備，能最大限度的降低潔凈區(qū)的污染[5]，對(duì)解決各種生物安全問題起到不可忽視的重要作用。紫外燈消毒殺菌是物體表面消毒的常用方法，此法經(jīng)濟(jì)、實(shí)惠、方便。但其最佳消毒時(shí)間一般為30 min，如果大量實(shí)驗(yàn)人員要進(jìn)入潔凈區(qū)，往往需要等待較長(zhǎng)時(shí)間，有時(shí)甚至個(gè)別實(shí)驗(yàn)人員在未徹底殺菌后就將傳遞窗內(nèi)的物品傳入潔凈區(qū)，增加了潔凈區(qū)病原微生物感染的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境造成威脅。本文通過對(duì)紫外傳遞窗和高通量氙光傳遞窗對(duì)5種病原的不同照射時(shí)間對(duì)殺滅效果的影響進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探討不同類型傳遞窗的殺菌效果。

本文選取的5種菌株分別是金黃色葡萄球菌，它是細(xì)菌繁殖體中化膿菌的代表[6]；綠膿桿菌，是醫(yī)院感染中最常分離的細(xì)菌繁殖體的代表[7]；大腸桿菌，是細(xì)菌繁殖體中腸道菌的代表[8]；白色念珠菌，是空氣中真菌的代表[9]；枯草芽孢桿菌，是黑色變種芽孢為細(xì)菌休眠體的代表[10]，這5種菌是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的常見菌，也是《消毒產(chǎn)品消毒效果檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)范》里規(guī)定檢測(cè)滅菌效果的必備菌株，綠膿桿菌與金黃色葡萄球菌更是CL級(jí)以上動(dòng)物的常見污染菌[15]。紫外傳遞窗照射5 min對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌無明顯殺滅效果，對(duì)綠膿桿菌的殺滅率僅為45.20%，不同菌種間的差異大，對(duì)紫外光敏感度高的菌體短時(shí)間內(nèi)被殺滅率較高[16]，照射30 min對(duì)5種菌殺菌率達(dá)99.91%以上。高通量氙光傳遞窗1 min能對(duì)5種菌造成 99.85% 以上的殺菌率，5 min殺菌率可達(dá) 100%，效果明顯好于傳統(tǒng)的紫外傳遞窗，且具有高效的特點(diǎn)。在人員流動(dòng)性大、物品傳遞頻繁的動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生存環(huán)境條件穩(wěn)定與否將會(huì)直接決定著動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的質(zhì)量[17]，高通量氙光傳遞窗不僅為物品傳遞和人員進(jìn)出節(jié)省了時(shí)間，降低了潔凈區(qū)的感染風(fēng)險(xiǎn)。此外，采用的氙氣為惰性氣體，不含汞，不污染環(huán)境。脈沖氙燈的壽命約為500 h[5]、激光光束質(zhì)量好、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)(壽命期內(nèi)其光譜能量分布幾乎不變[18-20])，需注意的是高通量氙光燈工作的頻閃階段應(yīng)避免直視傳遞窗[18]。

高通量氙光傳遞窗利用高壓氙氣短時(shí)間內(nèi) (10～100 ms) 產(chǎn)生紫外線脈沖的原理，較傳統(tǒng)紫外傳遞窗汞原子激發(fā)釋放紫外光，通過各方面對(duì)比，其高效的殺菌能力，有望替代紫外傳遞窗，可更好的保障屏障環(huán)境、隔離污染，實(shí)現(xiàn)潔凈區(qū)的高效運(yùn)作。