葉財發(fā)，蔡躍輝，曾棋平，曹毅祥，陳錦珊 （中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇九醫(yī)院制劑科/廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院制劑科，福建 漳州 363000）

復(fù)方首烏藤合劑是我院研制的特色制劑，主要由首烏藤、合歡皮、菟絲子、五味子、續(xù)斷、蔓荊子、川芎、煅牡蠣八味藥材配制而成，方中首烏藤為君藥，合歡皮為臣藥，菟絲子、五味子、續(xù)斷為佐藥，川芎、蔓荊子、煅牡蠣為使藥，諸藥合用，具有養(yǎng)心安神解郁、滋陰養(yǎng)肝、行血活氣之功效，臨床應(yīng)用于神經(jīng)衰弱性失眠、眩暈及腦外傷引起的頭痛、頭暈等癥[1]。目前，該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中主要控制其總黃酮、二苯乙烯苷含量[2]，未包含多糖含量控制，相關(guān)研究表明，多糖具有預(yù)防、改善、治療失眠的作用，且滋陰養(yǎng)肝效果明顯[3-6]。因此，探究復(fù)方首烏藤合劑總多糖含量及多糖組成很有必要，本文在前期研究的基礎(chǔ)上 對該制劑粗多糖的組成及總多糖含量進(jìn)行了分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與儀器

1.1 材料

復(fù)方首烏藤合劑為本院自制（規(guī)格：40 ml，批號：201906132，201906133，201906211，20190624）；D-甘 露 糖 (批 號：140651-201504，質(zhì) 量 分 數(shù)99.4%)、D-鹽酸氨基葡萄糖(批號：140649-201606，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%)、半乳糖(批號：160226-201506，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%)、D-葡萄糖(批號：110833-201707，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%)、D-半乳糖醛酸(批號：111646-201702，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.1%)，L-阿拉伯糖(批號：111506-200202，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、三氟乙酸（TFA）均購自中國食品藥品檢定研究院；氫氧化鈉、鹽酸、甲醇、三氯甲烷、正丁醇、濃硫酸、苯酚、無水乙醇均為分析純;水為本院自制純化水。

1.2 儀器

紫外可見分光光度計（UNIC UV-2102 PCS，日本島津）；Agilent 1200 高效液相色譜系統(tǒng)(DAD 檢測器，美國Agilent 公司)；電子分析天平(AUX220，日本島津)；磁力加熱攪拌器(KQY78-1，金壇市科析儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH 系列，金壇市科析儀器有限公司)；電動離心機(LD5-2A，北京醫(yī)用離心機廠)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(101A-1E，上海實驗儀器有限公司)；超聲清洗器(KQ-500B，昆山市超聲儀器有限公司)；真空干燥箱(DZF-6050，上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)。

2 方法

2.1 提取多糖組分

精密吸取25 ml 復(fù)方首烏藤合劑，加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿：正丁醇=5：1）20 ml，在磁力攪拌器上攪拌30 min，離心20 min(50 Hz，4000 r/min)，回收上清液，去除蛋白質(zhì)及有機溶劑；乙醇沉淀：向上清液中加入3 倍體積的95%的乙醇，保持乙醇濃度在70%以上，靜置過夜。離心15 min，收集沉淀物，80 ℃真空干燥3 h，得到相應(yīng)批號的復(fù)方首烏藤合劑多糖粉末。

2.2 總多糖含量的測定[7-8]

2.2.1 對照品溶液配制

精密稱取105 ℃干燥至恒重的D-無水葡萄糖0.1 g，置于100 ml 容量瓶中，加水定容至刻度，備用。

2.2.2 供試品溶液配制

精密稱取復(fù)方首烏藤合劑多糖粉末0.1 g，置于250 ml 容量瓶中，加水定容至刻度，得供試品原液；再精密吸取3 ml 供試品原液至10 ml 容量瓶中，加水定容，即為供試品溶液。

2.2.3 最大吸收波長測定

精密吸取對照品儲備液6.0 ml，置于100 ml 量瓶中，加水定容至刻度，即得對照品溶液。精密吸取對照品溶液1.0 ml，置于10 ml 量瓶中，加入4%的苯酚溶液1.0 ml，振蕩搖勻，然后加入7 ml 濃硫酸，立即搖勻，100 ℃水浴15 min，然后冰浴15 min，冷卻至室溫。以相應(yīng)試劑為空白，在400～550 nm 范圍內(nèi)掃描光譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照品溶液在486nm 處有最大吸收，故選擇486 nm。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性關(guān)系考察

精密吸取葡萄糖對照品儲備液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，分別置10 ml 量瓶中，用水定容至刻度。然后各精密吸取1.0 ml，分別置于10 ml 量瓶中，加入4%的苯酚溶液1.0 ml，振蕩搖勻，然后加入7 ml 濃硫酸，立即搖勻，100 ℃水浴15 min，然后冰浴15 min，冷卻至室溫，在486 nm 波長處測定吸光度(Y)。以Y 為縱坐標(biāo)，濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y= 0.007X +0.0105，r = 0.9982。

2.3.2 精密度試驗

精密量取“2.2.1”項下的對照品溶液1.0 ml，按“2.3.1”項下方法測定吸光度，連續(xù)測定6 次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算多糖含量，求RSD。結(jié)果得到RSD 為0.24% (n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗

精密量取供試品溶液（批號：20190624）1.0 ml，置10 ml 量瓶中，按“2.3.1”項下方法測定吸光度。在顯色后0、10、20、40、60、80、100、120 min 分別測定吸光度，求RSD。結(jié)果得到RSD 為3.54% (n=7)，表明該制劑多糖提取液在顯色后120 min 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗

取復(fù)方首烏藤合劑（批號：20190624）6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下方法測定吸光度，計算多糖含量。結(jié)果測得6 份供試品溶液中多糖的平均含量為18.23 mg/ml，RSD為0.33%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗

精密量取已知濃度為61 μg/ml 的供試品溶液（批號：20190624）6 份，每份0.5 ml，各加入0.5 ml濃度為63 μg/ml 的葡萄糖對照品溶液，按“2.3.1”項下方法操作，于486 nm 波長處測定吸光度，計算加樣回收率。結(jié)果顯示該方法的平均加樣回收率為100.45%,RSD 為1.57% （見表1）。

表 1 復(fù)方首烏藤合劑加樣回收率試驗結(jié)果（n=6)

2.4 總多糖含量測定

按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下方法測定吸光度，計算多糖含量。用外標(biāo)法計算總多糖含量(以葡萄糖計)，結(jié)果見表2。

表 2 復(fù)方首烏藤合劑含量測定結(jié)果（n=3）

2.5 單糖分析

2.5.1 對照品溶液的制備

稱取各單糖對照品： D-甘露糖、D-鹽酸氨基葡萄糖、D-半乳糖醛酸、D-無水葡萄糖、半乳糖、L-阿拉伯糖等各約10 mg，精密稱定，分別置于5 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.5.2 供試品溶液的制備

取多糖粉末（批號：20190624）150 mg，精密稱定，置于10 ml 具塞試管中，加水 3 ml，再加TFA3 ml，封管于110 ℃烘箱中水解1 h，取出，放冷，水浴蒸干，用甲醇1 ml 溶解，蒸干，重復(fù)處理 3 次以除去殘留的 TFA，殘渣加水溶解[9]，轉(zhuǎn)移至 5 ml 量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得。

2.5.3 柱前衍生方法

取上述 6 種單糖對照品溶液各50 μl 置于同一10 ml EP 管中，供試品溶液1.0 ml 置于10 ml EP 管中，分別加入 1.0 ml 0.5 mol/L 的PMP/甲醇溶液和1.0 ml 0.3 mol/L 的氫氧化鈉溶液，混合均勻，70 ℃水浴50 min，取出后冷卻至室溫，分別加入1.0 ml 0.3 mol/L 的鹽酸溶液中和，再加入2 ml 氯仿萃取，取上清液，重復(fù)處理 3 次，除去未反應(yīng)的PMP，0.22 μm 濾膜濾過[9]，即得。

2.5.4 色譜條件

色譜柱：Agilent Exted-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈(A) - 0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖液(pH =6.8)(B)等度洗脫(A：B=16：84)；流速：1.0 ml/min；檢測波長250 nm；進(jìn)樣量：20 μl。

2.5.5 結(jié)果

精密吸取適量“2.5.2”項下供試品溶液及“2.5.1”項下對照品溶液，按照“2.5.3”項下衍生方法進(jìn)行衍生，按照“2.5.4”項下色譜條件進(jìn)樣，分別得到供試品溶液色譜圖(圖1），從復(fù)方首烏藤合劑多糖中識別出甘露糖、鹽酸氨基葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等6 種單糖。

根據(jù)5 次各單糖的峰面積比測定結(jié)果進(jìn)行計算，甘露糖：鹽酸氨基葡萄糖：半乳糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖=9.10：0.26：1.00：3.02：4.14：2.12，可見甘露糖的峰面積占比接近50%，提示甘露糖可能是復(fù)方首烏藤合劑發(fā)揮特殊藥效的原因之一。

圖 1 復(fù)方首烏藤合劑多糖色譜圖

3 討論

3.1 苯酚-硫酸法的樣品處理

采用苯酚-硫酸法預(yù)實驗時，發(fā)現(xiàn)供試品和對照品溶液如無水浴和冰浴處理，可能造成供試品過熱且結(jié)果不穩(wěn)定；若冰浴后無冷卻至室溫操作，吸光度結(jié)果偏小，故本實驗選擇先水浴，再冰浴，冷卻至室溫來避免以上情況出現(xiàn)。

3.2 單糖組分洗脫方法的選擇

在考察流動相時，發(fā)現(xiàn)乙腈比例大于25%時，各個色譜峰之間的分離度達(dá)不到要求；另外，如采用梯度洗脫方法，色譜峰6（半乳糖）與7（阿拉伯糖）之間分離度達(dá)不到要求，故選擇等度洗脫。綜合考慮，選擇0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)等度洗脫作為本實驗流動相。

3.3 制劑中總多糖含量及單糖組分的探討

復(fù)方首烏藤合劑是由首烏藤、合歡皮、菟絲子、五味子、續(xù)斷、蔓荊子、川芎、煅牡蠣八味藥材配制而成的中藥復(fù)方制劑，甘露糖的峰面積占比接近50%。根據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，首烏藤中單糖成分以阿拉伯糖及半乳糖為主[10]；合歡皮多糖較高，但未對單糖組分進(jìn)行分析[11]；菟絲子多糖的主要組成是甘露糖，且含量最高[12]；五味子以葡萄糖為主，甘露糖含量低[13]；蔓荊子多糖含量較低[14]；川芎多糖以葡萄糖及半乳糖為主[15]。綜上可知，甘露糖可能主要來源于菟絲子，葡萄糖可能主要來源于五味子、川芎，阿拉伯糖可能主要來源于首烏藤。

4 結(jié)論

綜上所述，采用苯酚硫酸法結(jié)合紫外分光光度法可以較為準(zhǔn)確測定復(fù)方首烏藤合劑總多糖含量，柱前衍生化法結(jié)合高效液相色譜適用于分析該制劑多糖水解產(chǎn)物中的單糖組分，上述方法可為復(fù)方首烏藤合劑多糖質(zhì)量控制提供參考。