郭雪麗，劉澤民，王紅寶，劉一飛，溫永亮

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032）

豬肉是我國(guó)人民生活中不可缺少的食品，隨著人們生活水平的提高，人們對(duì)豬肉已不再是量的需求，對(duì)豬肉的品質(zhì)也有了較高的要求。影響豬肉品質(zhì)的因素包括遺傳因素和非遺傳因素，遺傳因素是決定豬肉品質(zhì)的根本。目前已發(fā)現(xiàn)20多個(gè)影響豬肉品質(zhì)的相關(guān)基因，主要包括氟烷（Hal）基因、鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST）基因、脂蛋白脂肪酶（LPL）基因、豬心型脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP）基因、MyoD基因等[1-2]。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[3-4]，豬心型脂肪酸結(jié)合蛋白（HFABP）基因是影響豬肉品質(zhì)的主要候選基因，脂蛋白脂肪酶（LPL）是影響動(dòng)物機(jī)體組織脂肪沉積過(guò)程的關(guān)鍵酶，豬肌肉的生長(zhǎng)過(guò)程中蛋白質(zhì)的更新有鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST）基因參與，MyoD基因能夠控制豬肉肌纖維的發(fā)育。

長(zhǎng)期以來(lái)，抗生素、化學(xué)藥品等的毒副作用以及耐藥性嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，尤其是藥物殘留問(wèn)題，威脅著人類的健康，已成為一個(gè)全社會(huì)關(guān)注的問(wèn)題。植物源性飼料添加劑的毒副作用小，無(wú)耐藥性，不會(huì)在畜產(chǎn)品中產(chǎn)生有害殘留，是植物源性飼料添加劑的一個(gè)獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，這一優(yōu)勢(shì)順應(yīng)了時(shí)代潮流，滿足了人們回歸自然、追求綠色食品的愿望。總的來(lái)說(shuō)，植物源性飼料添加劑具有來(lái)源天然性、功能多樣性、安全可靠性、經(jīng)濟(jì)環(huán)保性等特點(diǎn)。合理組配的植物源性飼料添加劑常常具有多種功能，這些性能與作用是化學(xué)物質(zhì)不可比擬的。

本研究于2019年6月至12月在山西省大同縣春源生態(tài)養(yǎng)殖專業(yè)合作社進(jìn)行，通過(guò)植物源性飼料添加劑組方飼喂山西地方品種試驗(yàn)豬，利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)試驗(yàn)豬的脂肪酸結(jié)合蛋白（HFABP）、鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST）、脂蛋白脂肪酶（LPL）、肌細(xì)胞生長(zhǎng)素（MyoG）、糖激酶同工酶基因（HK）、ATP合成酶（ATP5B）、磷酸果糖激酶（PFK）7個(gè)肉質(zhì)相關(guān)基因進(jìn)行了測(cè)定，對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行了分析研究，以探討植物源性飼料添加劑對(duì)豬肉品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 試驗(yàn)豬 晉陽(yáng)白豬、山西黑豬各36頭，共72頭。體重約15 kg左右，由大同縣春源生態(tài)養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供。

1.1.2 試劑

（1）植物源性飼料添加劑組方Ⅰ：主要由黃芪、黨參、白術(shù)等按一定比例混合制成；植物源性飼料添加劑組方Ⅱ：主要由白術(shù)、黨參、蘇子、陳皮、神曲等按一定比例混合制成。植物源性飼料添加劑原料購(gòu)自河北省安國(guó)市祁瑞中藥材有限責(zé)任公司，并由該公司將原料制成超微粉劑，粉劑粒度300目以上。

（2）Trizol提取試劑盒；4S Red Plus核酸染色劑；瓊脂糖。氯仿：異戊醇（24∶1）；無(wú)水乙醇；DEPC H2O。由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

（3）第一鏈cDNA合成試劑盒（RevertAid Premium Reverse Transcriptase，Thermo Scientific EP0733）。由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.1.3 儀器 SW-CJ-1D潔凈工作臺(tái)（江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠）；HC-2518R高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳儀器有限公司）；DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；H6-1微型電泳槽（上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠）；FR980凝膠成像系統(tǒng)（上海復(fù)日科技有限公司）；TU-1901紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀（BIO 公司）；移液器（范圍 100～1 000 μL，20～200 μL，0.5～10 μL； 加拿大 BBI 公司）；LightCycler480 Software Setup（Roche羅氏）。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)豬飼養(yǎng)及采樣方法 選擇體重?zé)o顯著差異的山西黑豬、晉陽(yáng)白豬各36頭，每個(gè)品種豬均分為4個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3頭試驗(yàn)豬。4個(gè)處理分別為植物源性飼料添加劑Ⅰ組、植物源性飼料添加劑Ⅱ組、抗生素組、對(duì)照組。植物源性飼料添加劑Ⅰ組在基礎(chǔ)飼糧中加入1%的植物源性飼料添加劑組方Ⅰ；植物源性飼料添加劑Ⅱ組在基礎(chǔ)飼糧中加入1%的植物源性飼料添加劑組方Ⅱ；抗生素組在基礎(chǔ)飼糧中添加金霉素，添加量50 g/t；對(duì)照組只飼喂基礎(chǔ)飼糧。各組預(yù)試期均15 d，正式試驗(yàn)期均120 d。

達(dá)到試驗(yàn)天數(shù)后，每組選3頭豬禁食12 h，自由飲水，然后屠宰。屠宰時(shí)取背最長(zhǎng)肌胸段（第8肋骨至第1腰椎處），所取樣品用錫紙包好，裝入凍存管，標(biāo)號(hào)后立即放入液氮，送實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，詳見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.3 RNA抽提及檢測(cè) DNAseI編號(hào)是B300065-0001；洗液DW的編號(hào)是B900042-1000；Buffer RDD是用來(lái)配DNA酶的，編號(hào)是B900042-1000。DNA酶的配制：DNA 酶 30 μL，加 RDD 40 μL，加 DEPC水 10 μL；DW 洗液的配制：DW∶無(wú)水乙醇=9∶1。

樣品準(zhǔn)備：將樣品剪碎后直接在Trizol中研磨，15～25 mg樣品組織加入0.5 mL Trizol，用勻漿器勻漿處理。將勻漿液室溫放置5～10 min，使得核蛋白與核酸完全分離。加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩30 s，室溫放置3 min。12 000 r/min 4℃離心10 min。吸取上層水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入1/2倍體積無(wú)水乙醇，混勻。將吸附柱放入收集管中，用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加至吸附柱中，靜置 2 min，12 000 r/min離心3 min，倒掉收集管中廢液。

將吸附柱放回收集管中，加入500 μL rpe Solu－tion，靜置 2 min，10 000 r/min 離心 30 s，倒掉收集管中廢液，并重復(fù)該步驟1次。將吸附柱放回收集管中，10 000 r/min離心2 min。將吸附柱放入干凈的1.5 mL離心管中，在吸附膜中央加入30 mL DEPC-treated ddH2O，靜置 5 min，12 000 r/min 離心 2 min，將所得到的RNA溶液置于-70℃保存或用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄 按照第一鏈cDNA合成試劑盒（RevertAid Premium Reverse Transcriptase，Thermo ScientificTMEP0733）的要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。在冰浴的nuclease-free PCR管中加入以下試劑：Random Primer p（dN）6（100 pmol）1 μL，dNTP Mix（0.5 mM final concentration）1.0 μL，Rnase-free ddH2O 定容至14.5 μL。輕輕混勻后離心3～5 s，反應(yīng)混合物在65℃溫浴5 min后，冰浴2 min，然后離心3～5 s。將試管冰浴，再加入下列試劑：5*RT Buffer 4.0 μL，Thermo Scientific RiboLock RNase Inhibitor（20 U）0.5 μL， RevertAid Premium Reverse Transcriptase（200 U）1.0 μL，輕輕混勻后離心 3～5 s。 在 PCR 儀上按照下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：1）25℃孵育10 min；2）cDNA 合成 50 ℃ 30 min；3）終止反應(yīng) 85 ℃5 min，處理后，置于冰上放置。將上述溶液-20℃保存。

1.2.5 熒光定量PCR檢測(cè) 將cDNA樣品稀釋8倍作為模板上機(jī)檢測(cè)。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件見(jiàn)表2和表 3。 20 μL 反應(yīng)體系：SybrGreen qPCR Master Mix（2◇）10 μL；10 μmol/L 的上游引物和下游引物各 0.4 μL；DNA 模板 2 μL；ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性7 s，57℃變性10 s，變性72℃變性15 s，45個(gè)循環(huán)。將加好樣品的96/384孔板放在LightCycler480 Software Setup（Roche羅氏）中進(jìn)行反應(yīng)。

表2 反應(yīng)混合液

表3 PCR循環(huán)條件

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2013記錄并整理，采用 2-（△△Ct）法計(jì)算反轉(zhuǎn)錄結(jié)果。 運(yùn)用 IBM SPSS Statistics 22程序?qū)φ砗玫臄?shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和鄧肯氏多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

試驗(yàn)豬肉質(zhì)相關(guān)基因熒光定量PCR測(cè)定分析結(jié)果見(jiàn)下表4。

表4 豬肉質(zhì)相關(guān)基因熒光定量PCR分析結(jié)果

通過(guò)以上對(duì)試驗(yàn)豬肉質(zhì)相關(guān)基因熒光定量PCR測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)分析可知，使用植物源性飼料添加劑的試驗(yàn)豬，其各相關(guān)基因的表達(dá)量均極顯著高于對(duì)照組（P<0.01），并極顯著高于抗生素組。植物源性飼料Ⅱ組又極顯著高于植物源性飼料Ⅰ組（P<0.01）。山西黑豬植物源性飼料Ⅱ組中H-FABP基因、LPL基因表達(dá)量顯著高于晉陽(yáng)白豬（P<0.05），其余各基因均為晉陽(yáng)白豬高于山西黑豬。

3 討論

本研究說(shuō)明，植物源性飼料添加劑對(duì)豬肉品質(zhì)的改善有著較好的促進(jìn)作用，抗生素的不當(dāng)應(yīng)用會(huì)影響豬肉品質(zhì)。從本研究的整體來(lái)看，植物源性飼料Ⅱ組，即白術(shù)、黨參、蘇子、陳皮、神曲等按一定比例的配制提升豬肉品質(zhì)效果更強(qiáng)，對(duì)晉陽(yáng)白豬的肉質(zhì)提升效果更好。

本研究主要對(duì)豬肉品質(zhì)相關(guān)基因H-FABP、CAST、LPL、MyoG、HK、ATP5B、PFK 進(jìn)行了測(cè)定。H-FABP屬脂肪酸結(jié)合蛋白（Fat acid binding proteins,FABPs）的家族之一，主要存在于骨骼肌、心肌、泌乳的乳腺及脂肪酸中[5-6]，參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的運(yùn)輸，與豬肉的肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)。豬肉的品質(zhì)與肌內(nèi)脂肪（Intramuscular fat,IMF）密切相關(guān)[7]，近年來(lái)研究認(rèn)為H-FABP是與豬肉品質(zhì)研究的主要候選基因[3-4]。CAST是一種內(nèi)源性專一抑制鈣蛋白酶活性的蛋白，主要參與機(jī)體的成長(zhǎng)和代謝過(guò)程[8]，其基因的產(chǎn)物參與豬肌肉生長(zhǎng)過(guò)程中蛋白質(zhì)的更新[9]；是影響肌肉生長(zhǎng)和宰后肉嫩化的一個(gè)重要因素，屠宰后可抑制鈣蛋白酶的活性，降低蛋白質(zhì)水解[10]。肉的嫩度是肉品質(zhì)的一個(gè)重要方面。研究發(fā)現(xiàn)，鈣蛋白酶系統(tǒng)在肉的嫩化，改善肉質(zhì)中起著重要的作用[11]。LPL的主要作用是能促進(jìn)沉積動(dòng)物組織中的脂肪，將動(dòng)物血液中的低密度脂蛋白以及乳糜微粒攜帶的甘油三酯分解成甘油和脂肪酸，提供脂肪組織合成甘油三酯的原料。在動(dòng)物的脂肪代謝中起著關(guān)鍵性作用[12]。MyoG主要通過(guò)調(diào)節(jié)肌肉分化階段特異性蛋白的表達(dá)來(lái)參與肌細(xì)胞決定和分化，在肌肉分化過(guò)程中起關(guān)鍵作用，也是影響豬肉品質(zhì)的一個(gè)重要基因[13-17]。HK、ATP5B、PFK對(duì)豬肉品質(zhì)的改善均有一定的輔助作用[18-19]。