相德才，張 斌，劉邵娜，楊仁燦，趙彥光

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南 昆明 650224；2.云南省種豬性能測定站，云南 昆明 650224；3.云南省種豬質(zhì)量檢驗(yàn)測試中心，云南 昆明 650224）

天然抗性相關(guān)巨噬蛋白基因（Natural resistance associated macrophage protein,Nramp1）由于其相對保守序列結(jié)構(gòu)，對不同類型病原菌具有多效性，是研究免疫疾病的候選基因之一。1998年，Sun將豬Nramp1定位于第15號染色體的q23～26區(qū)域[1]。包含15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子，外顯子分別編碼8～12個(gè)轉(zhuǎn)膜區(qū)域，全長序列大約15 kb，cDNA序列為1 617 bp，編碼539個(gè)氨基酸[2]。Nramp1基因主要在脾臟、大腦和肺臟等網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞器官的巨噬細(xì)胞中表達(dá)，用于抵抗外來病原微生物[3]。晏學(xué)明[4]在地方豬種的Nramp1基因的外顯子1至外顯子3之間發(fā)現(xiàn)了3個(gè)等位基因和4種基因型，并在藏豬的4個(gè)群體間發(fā)現(xiàn)了基因位點(diǎn)的遺傳分化差異。

迪慶藏豬主要生活在云南省迪慶藏族自治州境內(nèi)，主要以放牧方式進(jìn)行飼養(yǎng)，對不良的生活環(huán)境具有良好的抵抗力且具有良好的肉品質(zhì)，迪慶藏豬的這些特點(diǎn)是現(xiàn)有規(guī)?；B(yǎng)殖中引進(jìn)豬種所不具備的。本研究以迪慶藏豬為研究對象，利用測序技術(shù)對Nramp1基因內(nèi)含子2和外顯子2進(jìn)行SNP篩選，并對SNP位點(diǎn)進(jìn)行遺傳分析，為迪慶藏豬免疫疾病研究和抗病分子育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究隨機(jī)挑選57頭10月齡迪慶藏豬為試驗(yàn)材料，于2018年10月在迪慶藏族自治州迪慶藏豬保種場，采集其耳組織置于裝有75%酒精的離心管中，-20℃保存。利用組織基因組DNA提取試劑盒提取耳組織基因組DNA，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA濃度。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank提供的豬Nramp1基因序列（NC_010457.5）， 用Primer Premier 5.0與 Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)引物序列1對，引物序列為F：5'-TCATGA CAGGTGAGTAGCCC-3'，R：5'-CTTGGCCAGAGAGA TCCCAT-3'，擴(kuò)增片段長度為735 bp，送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.3 PCR擴(kuò)增和測序

PCR擴(kuò)增體系總體積為25 μL，包含Mix 12.5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各 1 μL，基因組 DNA模板（約 50 ng）2 μL，8.5 μL ddH2O。 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 7 min；4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，而后送至中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司進(jìn)行測序。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用genestar軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比對，并用Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果和測序結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測，結(jié)果見圖1，由圖1可見，擴(kuò)增產(chǎn)物片段的特異性較好，大小約為735 bp，表明PCR擴(kuò)增獲得了想要的目的片段。

經(jīng)過對測序結(jié)果的分析，由圖2可知迪慶藏豬在Nramp1基因內(nèi)含子2上存在6個(gè)SNP位點(diǎn)，分別是G841A、G892T、G1069A、G1085A、G1189A和T1347C；在外顯子2上存在1個(gè)SNP，是A1377G。

2.2 基因頻率和基因型頻率分析和遺傳特性分析

對各SNPs進(jìn)行了基因頻率、基因型頻率、多態(tài)信息含量、純合度、雜合度計(jì)算（表1）。結(jié)果顯示，各位點(diǎn)在迪慶藏豬豬群中均處于Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。群體遺傳分析顯示，本研究發(fā)現(xiàn)的SNPs多態(tài)信息含量處于低度多態(tài)和中度多態(tài)，G892T和 A1377G位點(diǎn)最高（0.357 5），G1189A位點(diǎn)最低（0.090 5）；雜合度均小于0.5，G892T和A1377G位點(diǎn)最高（0.466），G1189A位點(diǎn)最低（0.095）。

由圖3可知，其中snp2與snp5、snp6和snp7，snp4與snp5，snp5與snp6和snp7之間的D′值接近1，說明這些位點(diǎn)間發(fā)生重組的可能性很小；snp1與snp6之間D′值接近0，說明兩位點(diǎn)間連鎖平衡的可能性很??；而D′值接近中間值的則無法比較兩位點(diǎn)連鎖平衡的差別。

表1 不同SNP位點(diǎn)基因頻率、基因型頻率、多態(tài)信息含量、純合度、雜合度

單倍型分析結(jié)果如圖4，常見單倍型有6種，累計(jì)頻率為77.73%，其中單倍型1的頻率為39.98%，單倍型2的頻率為14.93%，單倍型3的頻率為7.89%。

3 討論

趙生國等[5]在Nramp1基因在外顯子2上檢測到2個(gè)等位基因（A和T）和3種基因型（AA、AT和TT）。本研究在迪慶藏豬Nramp1基因第2內(nèi)含子和第2外顯子一共發(fā)現(xiàn)7個(gè)SNPs，雖然本研究發(fā)現(xiàn)的非編碼區(qū)突變位點(diǎn)并參與編碼功能，但非編碼區(qū)的突變對編碼功能也有一定的作用，所以本研究發(fā)現(xiàn)的非編碼區(qū)突變位點(diǎn)是否會影響迪慶藏豬Nramp1基因的表達(dá)和功能還需進(jìn)行下一步的深入研究。

Nramp1基因作為控制動(dòng)物抗病力性狀的主效基因之一，在網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞器官中的表達(dá)已被證實(shí)與沙門氏菌以及多種胞內(nèi)寄生病原菌的抵抗作用有關(guān)[6]。通過本研究了解了迪慶藏豬Nramp1基因的變異情況及群體遺傳特征，為下一步開展基因的遺傳育種奠定了理論基礎(chǔ)。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，各SNPs均處于平衡，說明人工選擇壓較小，有利于發(fā)展下一步的抗病育種工作。

多態(tài)信息含量（PIC）和雜合度（He）是衡量等位基因多態(tài)性，基因突變變異程度高低的指標(biāo)，也是群體內(nèi)遺傳變異大小的評定指標(biāo)，數(shù)值越高，遺傳變異越大。本研究發(fā)現(xiàn)所有的SNPs的多態(tài)信息含量和雜合度均小于0.5，說明群體內(nèi)基因型遺傳變異較小，選擇潛力也比較小，為下一步研究Nramp1基因SNPs的基因型對沙門氏菌及多種胞內(nèi)病原微生物的抵抗作用提供重要依據(jù)。