張青嫻，徐引弟，王治方，朱文豪，許 峰，王克領(lǐng)

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實驗室，河南 鄭州 450002）

豬鏈球菌是世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)重要的細(xì)菌性疾病之一，2型豬鏈球菌（Streptococcus suis serotype2,S.suis2）是一種人畜共患病原體，可引發(fā)仔豬和人類的敗血癥、腦膜炎[1-3]。目前認(rèn)為豬鏈球菌毒力因子主要有莢膜多糖（Capsular polysaccharide,cps）、溶血素（suilysin,sly）、溶菌酶釋放蛋白（muramidase-released protein,mrp）、胞外因子（extracelluar protein factor,ef）、谷氨酸脫氫酶（Glutamate dehydrogenase,gdh）、纖連結(jié)合蛋白（ibronectin-binding proteins,fbns）以及黏附素（adhesin）等[1-3]。其中，gdh位于豬鏈球菌菌體細(xì)胞壁上，是一種新近發(fā)現(xiàn)的極其保守的種特異性抗原成分[3]，對細(xì)菌的致病性具有重要意義，不同血清型之間編碼gdh的氨基酸序列同源性高達(dá)99%～100%。豬鏈球菌的臨床菌株通常具有莢膜多糖（capsular polysaccharide,cps），cps是2型豬鏈球菌感染宿主的重要毒力因子，是傳統(tǒng)上用于血清分型的基礎(chǔ)。根據(jù)莢膜抗原的差異，豬鏈球菌被分為35種血清型（1型至34型和1/2型）[4-7]。大多數(shù)國家患病豬中分離出的菌株主要屬于2型血清型，其次是 3、4、5、7、8 和 1/2 型[8-10]。某些歐洲國家分離到較多的血清型9豬鏈球菌[10-11]。其中血清型2菌株的致病力最強(qiáng)，在人類中具有高度毒性。

2019年5月河南某豬場發(fā)生一起疑似豬鏈球菌疫情，斷奶仔豬發(fā)生呼吸困難、腦膜炎及關(guān)節(jié)炎等癥狀，發(fā)病率約6%，部分病豬后期衰竭死亡。收集臨床病料經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)、PCR鑒定和cps2J基因序列分析，確定分離到一株2型豬鏈球菌，命名為HNTY1。本試驗研究了2型豬鏈球菌的流行病學(xué)特點(diǎn)和遺傳進(jìn)化關(guān)系，為更好地防控本病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料與試驗動物

試驗于2019年5—10月在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所傳染病研究室進(jìn)行。病料來源于2019年5月河南省某規(guī)?；i場具有疑似豬鏈球菌癥狀的斷奶仔豬群，無菌采集瀕死豬的腦脊液、肺臟、肝臟、心血和關(guān)節(jié)液等病料。

1.2 主要試劑

革蘭氏染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（tryptic soy agar,TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（tryptic soybroth,TSB）購自Difco公司。新生牛血清購自鄭州益康生物工程有限公司；微量生化試管購自杭州濱河微生物試劑有限公司；2×Taq Master Mix、DL 2 000 DNA Marker等PCR試劑購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 細(xì)菌分離純化

將無菌采集的組織病料接種于TSA平皿（含5%新生牛血清）中，置于37℃溫箱培養(yǎng)18～24 h，挑取TSA平皿上可疑的單個鏈球菌菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，選取疑似鏈球菌的單菌落純化培養(yǎng)后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR分型

根據(jù)參考文獻(xiàn)[12-14]設(shè)計豬鏈球菌保守基因gdh和莢膜多糖基因cps2J的特異性引物（表1），由上海生工生物工程有限公司合成。設(shè)立滅菌去離子水為空白對照。將純化菌株接種于含5%新生牛血清的TSA平皿，37℃恒溫培養(yǎng)18 h后，挑取單菌落于100 μL滅菌超純水中，旋渦混勻，100℃煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液提取DNA作為PCR 模板備用。 PCR 體系如下：13 μL 2×Taq PCR master mix、上下游引物各 1 μL、2 μL 模板、8 μL 超純水。反應(yīng)條件：94℃變性5 min后，94℃45 s、55℃45 s、72℃ 30 s進(jìn)行35個循環(huán)，72℃延伸10 min后，4℃保存。將PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，取陽性產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測序。測序結(jié)果經(jīng)ClustalW算法與NCBI網(wǎng)站2型豬鏈球菌參考序列（表2）進(jìn)行同源性分析，并在MEGA6.0軟件使用Neighbor-Joining Method繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，Bootstrap數(shù)為1 000。

表1 豬鏈球菌PCR分型引物序列及相關(guān)信息

表2 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹的參考菌株

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌形態(tài)

經(jīng)24 h培養(yǎng)后，在含5%新生牛血清的TSA平皿上長出直徑 0.2～0.8 mm、圓形、光滑、濕潤、邊緣整齊、半透明、灰白色略帶藍(lán)色熒光的小菌落，革蘭氏染色為陽性圓形、卵圓形菌，呈單個、成對或短鏈狀（圖1）。將該菌株命名為HNTY1。

2.2 PCR鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，擴(kuò)增片段與預(yù)期設(shè)計大小一致，gdh基因和cps2J基因分別在689 bp和537 bp處擴(kuò)增出陽性條帶，均呈陽性；PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與GenBank上gdh基因和cps2J基因參考菌株的序列同源性超過99.0%，證明分離株為血清2型豬鏈球菌（圖2、圖3）。

2.3 cps2J基因序列分析

HNTY1株cps2J基因序列測定結(jié)果如下：AAAGAAGCCTATTGTATAAATACTTAAATATATGC AATTTCTTTGGAAGCGATTCATCTCCATTTTTGAAC ATTAATAAGCTATAATAAATAATATGCCACTGTAG CGTCTCTTTAAAAACAGAAAATTCATATTGTCCAC CAAATATTTTAACAAACAAATCAAAAGTTTTTTCTT CTAAATTTTCTAATTGAATAAAAA CATCTTTTTTAA ACGTATTTGTAGTACTTTGTATACCTCTTCTAGCAA AATAAAGATTTCTGTTTACATAGCTGACTTTTTTTA TATTCTTTAAATAATTTAGATTAAATAATAAGTCCT CTCCTAACCACTGTTCAGTGTCAAAACCTTTGTTTA TATATATATTCTTATAAAGTTTGCAACAAGGGCTAT TAAAGATACCGCTCATATAATGATTTGGAAAATTT TCATTTCCTAAGTCTCGCACCTCTTTTATCTCTTCCAA ATCAATTTGACACTTTtGCAGCTCAGATTCTTGATA ATTTCCATCAAAAGTAGCAAGTAACCCTCCGAC AA。

通過分子生物學(xué)軟件DNAStar和MEGA6.0，將HNTY1株與另外20株國內(nèi)外2型豬鏈球菌菌株進(jìn)行序列對比和同源性分析，并繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖4）。結(jié)果顯示，與多數(shù)參考菌株相比，HNTY1株在7 bp處缺失一個T核苷酸，即缺失了天冬酰胺（Asparagine，N 或 Asn）；532 bp處缺失一個C核苷酸，即缺失了脯氨酸（Proline，P或Pro）。 HNTY1 株與上海株（SH29、Guoguang）同源性分別為99.41%和99.82%；與中國其他地區(qū)分離株（LSM102、ZYS8、05HAS68、T15、ZY05719、1827702、A7、SS12、HBLY-1、SC19） 同源性 99.4%～99.6%；與日本株（P1/7、S735、2651）同源性 99.6%；與加拿大株（90-1330、NSUI060）同源性 99.6%；與越南株BM407同源性100%；與荷蘭株10同源性98.0%。

3 討論

2型豬鏈球菌為高致病性人畜共患病，近年來給養(yǎng)豬業(yè)帶來較大經(jīng)濟(jì)損失。豬鏈球菌的gdh基因非常保守，在豬鏈球菌的35個血清型中均存在該基因，建立gdh基因與cps2J基因的二重PCR方法，能顯著提高臨床2型豬鏈球菌鑒別的準(zhǔn)確性[15-18]。本研究所分離的HNTY1株cps2J基因及其氨基酸序列分析表明，該分離株為2型豬鏈球菌，與GenBank收錄的國內(nèi)外大多數(shù)分離株同源性達(dá)98%以上，表明cps2J基因極度保守，不同時空豬鏈球菌2型無顯著差異，說明這些菌株很可能具有相同起源；與NCBI收錄的大多數(shù)參考株相比，HNTY1株在7 bp和532 bp處分別缺失了核苷酸T、C，即分別缺失了天冬氨酸（Asn）和脯氨酸（Pro）；與上海株guoguang相比，在461 bp處由C→T，是否2型豬鏈球菌出現(xiàn)了新的流行趨勢，有待進(jìn)一步研究。HNTY1株與人源豬鏈球菌分離株LSM102同源性達(dá)99.6%，提示2型豬鏈球菌對公共衛(wèi)生有一定威脅性。

本試驗所建立的2型豬鏈球菌的PCR鑒定方法及遺傳進(jìn)化分析，可用于豬鏈球菌病的流行病學(xué)調(diào)查與檢測，為進(jìn)一步研究2型豬鏈球菌病的流行病學(xué)和防控本病提供科學(xué)依據(jù)。