裴苗苗, 盧 敏, 毛 華

裴苗苗, 盧敏, 毛華, 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院消化內(nèi)科 廣東省廣州市510282

核心提要： 血清miR-888-5p在HCC患者血清中高表達(dá),有助于HCC及AFP陰性HCC患者進(jìn)行早期診斷, 其表達(dá)水平與HCC肺轉(zhuǎn)移相關(guān), 可提示預(yù)后.miR-888-5p具有成為HCC早期診斷、臨床決策指導(dǎo)以及評(píng)估預(yù)后的一種血清學(xué)分子指標(biāo)的潛力.

0 引言

肝癌是全球極為好發(fā)的高致死性消化系統(tǒng)異質(zhì)性腫瘤, 2017年國(guó)家癌癥中心[1]發(fā)布數(shù)據(jù)表明, 我國(guó)HCC的發(fā)病率高達(dá)28.17/10萬(wàn), 為第三大常見(jiàn)腫瘤, 死亡率為24.70/10萬(wàn), 低于肺癌, 居癌癥相關(guān)死因的第二位.肝癌可分為肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌、肝細(xì)胞-膽管細(xì)胞混合性癌和纖維板層樣肝癌, 其中HCC占90%[2].由于缺少靈敏且特異度高的篩查及早期診斷方法, 超多半數(shù)的HCC患者在初次確診時(shí)已處于中晚期, 預(yù)后不佳.miRNA是基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的重要調(diào)控因子, 可在HCC發(fā)生早期即穩(wěn)定表達(dá)于外周循環(huán), 參與調(diào)控HCC細(xì)胞增殖和分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移[3,4].研究證實(shí)miR-888-5p為致癌miRNA, 廣泛參與調(diào)節(jié)HCC的發(fā)生及進(jìn)展[5,6].目前尚無(wú)HCC與血清miR-888-5p的相關(guān)報(bào)道, 本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)法檢測(cè)HCC、慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B,CHB)、肝硬化(liver cirrhosis, LC)患者以及健康人群血清中miR-888-5p的表達(dá)水平, 觀察不同人群之間其表達(dá)量是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異, 探討其表達(dá)水平與HCC患者臨床特征之間的關(guān)系, 尋求一種無(wú)創(chuàng)、便捷、可重復(fù)性高的血清學(xué)診斷及預(yù)后相關(guān)分子生物指標(biāo).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)： (1)HCC患者： ①影像學(xué)或肝穿活檢病理初次確診的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相關(guān)HCC患者; ②未接受手術(shù)、放化療、靶向藥物治療等腫瘤相關(guān)治療; ③無(wú)肺、心、腦、腎等重要臟器功能不全; ④無(wú)同時(shí)合并其他部位惡性腫瘤; ⑤無(wú)重大精神疾患者; (2)LC患者： ①腹部B超、CT等證實(shí)的HBV相關(guān)LC者; ②無(wú)惡性腫瘤病史; ③無(wú)肺、心、腦、腎等重要臟器功能不全; (3)CHB患者： ①乙肝兩對(duì)半、腹部B超等診斷明確者; ②無(wú)惡性腫瘤病史; ③無(wú)肺、心、腦、腎等器官功能不全; (4)健康對(duì)照組： ①無(wú)其他系統(tǒng)癌癥病史; ②無(wú)肺、心、腦、腎等重要臟器功能不全; ③無(wú)重大精神疾患者.本實(shí)驗(yàn)符合國(guó)家醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn), 經(jīng)我院倫理審查委員會(huì)審查并批準(zhǔn), 所有待檢者于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前已知情同意并簽字.

1.1.2 一般材料： 血清/血漿miRNA提取試劑盒(美杰生物科技有限公司, 廣州); PrimeScript RT reagent Kit(perfect Real Time)試劑盒(瑞真生物技術(shù)有限公司, 廣州); TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus); qPCR試劑Ⅱ(瑞真生物技術(shù)有限公司, 廣州); 莖環(huán)法miRNA qRT-PCR引物(銳博生物科技有限公司, 廣州); 以秀麗隱線蟲(chóng)miR-39-3p作為外參, 由上海生生物工程有限公司合成(序列： UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG).

1.1.3 臨床樣本的收集與處理： 選取2019-04/2019-11南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院消化內(nèi)科、腫瘤科及肝膽科住院首次確診的HCC患者共68例, CHB46例, LC43例及同期健康體檢者40例.受試者的一般資料見(jiàn)表1, 各組年齡及性別構(gòu)成比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05).受試者禁食8 h后用靜脈采血專(zhuān)用真空試管采集5 mL外周靜脈血, 室溫下3000 r/min離心15 min后分離血清, 然后將血清在4 ℃,17000g離心10 min, 吸取上清液作為檢測(cè)樣品,將其分裝至1.5 mL無(wú)酶管, 保存至-80 ℃冰箱備用.

1.2 方法

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)miR-888-5p表達(dá)水平： 應(yīng)用BIORAD qRT-PCR儀, 按照試劑盒說(shuō)明書(shū), 反應(yīng)體系20 μL：cDNA 4 μL, SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL, PCR Forward Primer (10 μmol/L) 0.8 μL, PCR Reverse Primer 0.8 μL (10 μmol/L), Rnase-Free Water 4.4 μL.qRT-PCR反應(yīng)條件(兩步法)： 預(yù)變性95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s, 共40個(gè)循環(huán); 溶解曲線： 95 ℃ 1 min, 65 ℃ 5 s, 95 ℃ 5 min; 實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔, 取其平均值, 記錄循環(huán)熒光閾值(cyclic threshold, CT).miR-888-5p組間相對(duì)表達(dá)量以2-△△CT表示, △△CT = mean(實(shí)驗(yàn)組目的基因CT值-實(shí)驗(yàn)組外參CT值)-mean(對(duì)照組目的基因CT值-對(duì)照組內(nèi)參基因CT值)[7].

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理基于預(yù)實(shí)驗(yàn), 采用公式n= Ψ2(∑(Si2)/K)/[∑(Xi均-X均)2/(K-1)]計(jì)算得出每組實(shí)驗(yàn)對(duì)象至少40例.運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件, 計(jì)量資料以P50[P25, P75]表示, 計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)及率表示, 組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn),P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線評(píng)估診斷效能.

2 結(jié)果

2.1 miR-888-5p的qRT-PCR結(jié)果 采用2-△△CT法計(jì)算血清miR-888-5p相對(duì)表達(dá)量, HCC患者血清miR-888-5p最高表達(dá)量為62.90, 最低為0.34; LC患者中表達(dá)量最高為26.08, 最低為0.11; CHB患者miR-888-5p最高表達(dá)量為52.52, 最低為0.02; 健康對(duì)照最高表達(dá)量為27.95, 最低則為0.03.HCC組血清miR-888-5p表達(dá)量明顯高于LC組、CHB組及健康對(duì)照組(P＜0.01), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 而LC、CHB及健康對(duì)照組三組之間比較, 無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(圖1).

2.2 血清miR-888-5p、AFP及其聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HCC診斷價(jià)值 血清miR-888-5p對(duì)于診斷HCC的ROC曲線下面積(area under curve, AUC)為0.737(95%CI： 0.643-0.817; 敏感性： 79.41%, 特異性： 62.50%), AFP的AUC為0.819(95%CI： 0.734-0.887; 敏感性： 73.53%,特異性：97.50%), 聯(lián)合兩者檢測(cè)AUC為0.907(95%CI： 0.835-0.954; 敏感性： 91.18%, 特異性： 72.50%).miR-888-5p診斷HCC具有較高的AUC及敏感性, 與AFP聯(lián)合檢測(cè)AUC及敏感性均得以提高, 可獲得更高診斷價(jià)值(圖2、表2).

2.3 miR-888-5p對(duì)于AFP陰性HCC患者的診斷價(jià)值 以AFP20 μg/L為界將68例HCC患者分為AFP陽(yáng)性及AFP陰性HCC兩組.對(duì)22例AFP陰性患者繪制ROC曲線所得AUC為0.793(95%CI： 0.671-0.885; 敏感性： 90.90%, 特異性： 62.50%), miR-888-5p對(duì)AFP陰性HCC患者具備良好的診斷效能(圖3).

2.4 HCC患者血清miR-888-5p的表達(dá)和臨床特征之間的關(guān)系 HCC血清miR-888-5p的表達(dá)水平與患者的性別、年齡、AFP、LC、Child分級(jí)、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、門(mén)靜脈癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分級(jí)及巴塞羅那分期均無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05), 而與肺轉(zhuǎn)移相關(guān)(P= 0.01)(表3).

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道[8], 中國(guó)聚集著全球55%的肝癌病例, 每年平均約有38.3萬(wàn)人死于肝癌, 肝癌死亡病例占全球肝癌死亡總?cè)藬?shù)的51%.由于HCC具有高度異質(zhì)性、進(jìn)展迅速、侵襲度高、易轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為及早期臨床癥狀隱匿、現(xiàn)有篩查診斷方法敏感性與特異性不足, 多數(shù)患者失去早期手術(shù)根治良機(jī), 手術(shù)切除率僅為10%-20%左右, 高達(dá)70%的患者于手術(shù)后5年內(nèi)復(fù)發(fā), 其中2/3復(fù)發(fā)于術(shù)后2年內(nèi), 5年總體生存率僅為7%-10%[9].早在20世紀(jì)末, WHO提出了癌癥的“3個(gè)1/3”相關(guān)策略, 目前看來(lái), 優(yōu)化HCC篩查方法提高HCC早期檢出率, 是改善預(yù)后, 降低死亡率最有效、最根本的策略.

表1 研究對(duì)象的一般資料

表2 血清miR-888-5p、甲胎蛋白及兩者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)肝細(xì)胞癌的診斷價(jià)值比較

圖1 各組血清樣品中miR-888-5p相對(duì)表達(dá)水平散點(diǎn)圖.肝細(xì)胞癌與肝硬化及健康對(duì)照組相比, aP ＜0.001; 肝細(xì)胞癌與慢性乙型病毒性肝炎相比, bP ＜0.01.HCC: 肝細(xì)胞癌; CHB: 慢性乙型病毒性肝炎; LC: 肝硬化.

圖2 受試者工作特征曲線顯示血清miR-888-5p、甲胎蛋白及兩者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)肝細(xì)胞癌的診斷價(jià)值.AUC: 曲線下面積; AFP: 甲胎蛋白; combine: 聯(lián)合檢測(cè)甲胎蛋白與miR-888-5p.

miRNA為真核細(xì)胞內(nèi)高度保守長(zhǎng)度約為21-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA, 通過(guò)與靶基因的3’端非翻譯區(qū)進(jìn)行完全性或不完全互補(bǔ)結(jié)合, 引起靶mRNA降解或者抑制翻譯, 靶基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平改變, 廣泛調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動(dòng), 其表達(dá)失調(diào)與惡性腫瘤等多種疾病密切相關(guān)[10,11].據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[12], miRNA可在HCC進(jìn)程中扮演著抑癌基因和癌基因的重要角色.Murakami等[13]首次報(bào)道了miRNA在HCC中的異常表達(dá)模式, 認(rèn)為miRNA表達(dá)異常是HCC發(fā)生、進(jìn)展的共同生物學(xué)征.愈來(lái)愈多的研究證實(shí)[14-17], 循環(huán)miRNA可長(zhǎng)期穩(wěn)定存在, 不被內(nèi)源性RNA酶降解, 亦能耐受極端酸堿環(huán)境及溫度, 以上特性為我們的研究奠定了實(shí)驗(yàn)可行性的基礎(chǔ).

1) 舒適度。中國(guó)船級(jí)社(China Classification Society, CCS)在國(guó)際海事組織(International Maritime Organization, IMO)SOLAS修正案決議的基礎(chǔ)上制定了“舒適度附加標(biāo)志”的細(xì)則，包括COMF(NOISE N)噪聲舒適性附加標(biāo)志和COMF(VIB N)振動(dòng)舒適性附加標(biāo)志,N為舒適度等級(jí)1，2，3，其中：1表示舒適度最高等級(jí)；3表示可接受舒適度等級(jí)。由此可看出，船級(jí)社在隨著航運(yùn)發(fā)展的變革,逐步將客滾船舒適度要求標(biāo)準(zhǔn)化、具體化、規(guī)范化。

miR-888-5p是miR-888基因家族成員之一[18], 在HCC中發(fā)揮致癌作用.本研究采用qRT-PCR法檢測(cè), 相對(duì)定量法分析血清中miR-888-5p表達(dá)水平, 結(jié)果表明HCC患者血清中miR-888-5p表達(dá)量較CHB、LC及對(duì)照組顯著升高(P＜0.05).進(jìn)一步繪制ROC曲線分析發(fā)現(xiàn), 血清miR-888-5p診斷HCC的AUC為0.7379(敏感性為79.41%, 特異性為62.50%), AFP的AUC則為0.819(敏感性73.53%、特異度97.50%); 而聯(lián)合兩者檢測(cè)AUC高達(dá)0.907, 靈敏度高達(dá)91.18%, 特異性為72.50%.miR-888-5p對(duì)HCC診斷的靈敏度較AFP高, 而AFP則具有較高特異性, 聯(lián)合檢測(cè)兩者的診斷效能及敏感性更高, 更具臨床診斷價(jià)值.以AFP = 20 μg/L為分界, 將68例HCC分為AFP陽(yáng)性組(46例)及AFP陰性(22例)兩組, 分析miR-888-5p對(duì)于AFP陰性HCC患者的診斷價(jià)值, 所得AUC為0.793, 敏感性90.90%, 特異性62.50%, 可見(jiàn)miR-888-5p對(duì)AFP陰性HCC患者具有較高的敏感性及診斷效能, 且miR-888-5p表達(dá)水平與AFP無(wú)明顯相關(guān)性(P= 0.08), 其有望成為AFP陰性HCC患者補(bǔ)充診斷的分子指標(biāo), 但仍需后續(xù)多中心、大樣本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步加以驗(yàn)證.

表3 血清miR-888-5p與肝細(xì)胞癌臨床特征之間的關(guān)系

圖3 miR-888-5p對(duì)甲胎蛋白陰性肝細(xì)胞癌患者的受試者工作特征曲線.AFP: 甲胎蛋白; HCC: 肝細(xì)胞癌; AUC: 曲線下面積.

miR-888-5p在人類(lèi)常見(jiàn)多種腫瘤中發(fā)揮類(lèi)似原癌基因的生物學(xué)作用[19-21].在HCC中, 其可上調(diào)癌細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)水平, 抑制p53抑癌基因的表達(dá),促進(jìn)癌細(xì)胞遷移和侵襲[5].Li等[6]研究提示miR-888-5p可通過(guò)靶向抑制Smad4, 促進(jìn)HCC細(xì)胞遷移和侵襲, 新發(fā)現(xiàn)的miR-888/Smad4軸為研究HCC的進(jìn)展提供了新思路, 并提供了一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn).我們通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)HCC患者血清miR-888-5p的表達(dá)水平與患者的性別、年齡、AFP、LC、Child分級(jí)、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、門(mén)靜脈癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分級(jí)及巴塞羅那分期無(wú)明顯相關(guān)(P＞0.05), 而與肺部轉(zhuǎn)移相關(guān)(P= 0.01), 說(shuō)明miR-888-5p可能參與調(diào)控HCC浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等生物分子機(jī)制, 且血清miR-888-5P不受患者性別年齡等因素干擾, 能夠客觀提示HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況.我國(guó)學(xué)者黃湘俊等[22]研究結(jié)果顯示miR-888-5p在HCC組織中表達(dá)高于癌旁組織, 且HCC分期分級(jí)越高, 其相應(yīng)的表達(dá)水平越高, 說(shuō)明其與HCC患者高度侵襲能力密不可分, miR-888-5p高表達(dá)可能是HCC浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的重要步驟.然而該實(shí)驗(yàn)標(biāo)本為手術(shù)切除所得, 組織標(biāo)本取材復(fù)雜、有創(chuàng)、耗時(shí)、費(fèi)力, 我們通過(guò)探究HCC患者血清miR-888-5p水平得出了一致的結(jié)論, 提示血清miR-888-5p有望替代組織細(xì)胞學(xué)miRNA的檢測(cè), 成為一種新型、無(wú)損、可重復(fù)性高、可全面實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的HCC預(yù)后相關(guān)腫瘤分子標(biāo)志物, 用于指導(dǎo)后續(xù)臨床工作.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化系統(tǒng)高度異質(zhì)惡性實(shí)體瘤, 臨床癥狀不典型、進(jìn)展快、易轉(zhuǎn)移, 現(xiàn)有血清學(xué)篩查手段缺乏靈敏度及特異性, 早期診斷率低下, 導(dǎo)致高死亡率, 預(yù)后極差的嚴(yán)峻局面.miRNA是一類(lèi)廣泛調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的調(diào)控因子, 其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、不轉(zhuǎn)錄、不被加工后修飾, 具有時(shí)序性、組織細(xì)胞特異性, 并可于腫瘤發(fā)病早期穩(wěn)定表達(dá)于外周循環(huán), 可幫助鑒別腫瘤起源組織, 且與腫瘤臨床病理類(lèi)型相關(guān).近年來(lái), 相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-888-5p在原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)組織及細(xì)胞中高表達(dá), 發(fā)揮致癌作用, 然而HCC患者血清中miR-888-5p表達(dá)水平及其作為HCC循環(huán)腫瘤分子標(biāo)志物的價(jià)值仍未被探討.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

目前國(guó)內(nèi)外研究大多聚焦于miR-888-5p與HCC組織細(xì)胞的基礎(chǔ)研究, 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)HCC患者、慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者、肝硬化(liver cirrhosis, LC)患者及健康人四組受試者血清中miR-888-5p表達(dá)水平, 評(píng)價(jià)其用于HCC早期診斷、病情評(píng)估及預(yù)后判斷的臨床應(yīng)用價(jià)值.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

本研究通過(guò)收集臨床血清學(xué)樣品, 檢測(cè)血清miR-888-5p表達(dá)水平, 比較HCC患者與對(duì)照組之間其表達(dá)水平是否存在差異, 進(jìn)一步繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線評(píng)價(jià)血清miR-888-5p對(duì)于HCC診斷的價(jià)值, 并分析了血清miR-888-5p與HCC患者臨床病理特征之間的關(guān)系, 旨在驗(yàn)證血清miR-888-5p可否成為一種靈敏、特異、無(wú)損且實(shí)用價(jià)值高的循環(huán)腫瘤分子標(biāo)志物.

實(shí)驗(yàn)方法

按照納入排除標(biāo)準(zhǔn)收集68例HCC患者、46例CHB患者、43例LC患者以及40例同期健康體檢者, qRT-PCR相對(duì)定量法檢測(cè)血清中miR-888-5p表達(dá)量, 2-△△CT法計(jì)算組間miR-888-5p相對(duì)表達(dá)水平, 組間數(shù)據(jù)差異性比較采用秩和檢驗(yàn), ROC曲線評(píng)估m(xù)iR-888-5p用于診斷HCC的價(jià)值, 同時(shí)分析miR-888-5p與HCC臨床特征之間的關(guān)系.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本研究發(fā)現(xiàn)HCC患者血清miR-888-5p顯著高表達(dá), miR-888-5p對(duì)于診斷HCC具有良好的診斷價(jià)值, 且對(duì)甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)陰性HCC患者具有輔助診斷價(jià)值, 聯(lián)合檢測(cè)miR-888-5p與AFP診斷價(jià)值更高.此外miR-888-5p與HCC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān), 但仍需后續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)miR-888-5p水平, 長(zhǎng)期隨訪以證實(shí)miR-888-5p與預(yù)后之間的關(guān)系.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本研究首次檢測(cè)了HCC患者血清miR-888-5p表達(dá)水平,miR-888-5p對(duì)于HCC患者及AFP陰性HCC患者具有臨床診斷價(jià)值, 且可提示預(yù)后, 有望成為HCC腫瘤特異性循環(huán)分子標(biāo)志物.

展望前景

由于本研究為單中心研究, 樣本量有限, 數(shù)據(jù)來(lái)源單一,未檢測(cè)HCC治療前后血清miR-888-5p的動(dòng)態(tài)變化, 以及同時(shí)期HCC患者組織及細(xì)胞中miR-888-5p表達(dá)水平; 未根據(jù)HCC相關(guān)病因詳細(xì)分組分析血清miR-888-5p對(duì)不同病因所致HCC的臨床應(yīng)用價(jià)值, 因此仍需日后進(jìn)行多中心、大樣本、更深入的研究.