張思琪，周景文，張國強，陳堅

1 江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122

2 江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122

對香豆酸 (p-Coumaric acid，p-CA) 作為植物類苯丙素途徑的上游代謝產物，是類苯丙素、木質酚素、黃酮類和芪類化合物的共同前體[1-2]。研究表明對香豆酸及其衍生物具有多種生物學活性，例如降低血脂、抗病毒抗氧化、預防癌癥和心血管疾病等[3-4]。因此，對香豆酸及其衍生物在醫(yī)藥、營養(yǎng)保健品、化妝品中得到廣泛應用[5-6]。與傳統(tǒng)的植物提取和化學合成相比，微生物合成對香豆酸等天然化合物因其具有生產成本低、轉化效率高等優(yōu)勢而得到廣泛關注[7]。其中，釀酒酵母適合代謝工程的改造和工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵，是生產高附加值植物特異性次生代謝產物的重要底盤細胞[5,8]。

目前，對香豆酸的生物合成可以通過苯丙氨酸脫氨羥化后合成或酪氨酸通過酪氨酸解氨酶(Tyrosine ammonia lyase，TAL) 催化生成。由于前者羥化過程所用的4-肉桂酸羥化酶 (Cinnamate 4-hydroxylase，C4H) 表達與活性不足，限制了對香豆酸的合成，酪氨酸裂解途徑成為對香豆酸生物合成研究的重要方向。酪氨酸是對香豆酸的合成前體，主要來源于莽草酸途徑，因此，釀酒酵母胞內莽草酸合成途徑的有效調控會影響對香豆酸的積累 (圖1)。有研究表明過表達轉酮醇酶(TKL1) 和核糖-5-磷酸酮醇異構酶 (RKI1)，可增加莽草酸途徑的必要前體赤蘚糖-4-磷酸 (E4P)，最終芳香族氨基酸提高兩倍以上[9-10]。丙酮酸激酶 (CDC19) 的T21E突變體可能可以減緩磷酸烯醇丙酮酸 (PEP) 向丙酮酸的轉化，并積累PEP作為莽草酸途徑的前體[8]。此外，通過過表達抗反饋基因3-脫氧-D-阿拉伯糖-庚糖酸-7-磷酸 (DAHP)合酶 (ARO3K222L、ARO4K229L) 和分支酸變位酶(ARO7G141S) 解除底物抑制作用[11]，過表達多功能酶基因 (ARO1) 和莽草酸激酶 (EcaroL) 強化代謝途徑和解除限速步驟[5]，敲除分支途徑上的鄰氨基苯甲酸合酶 (TRP2) 和預苯酸脫水酶 (PHA2)基因，阻止色氨酸和苯丙氨酸競爭氮通量，敲除苯丙酮酸和4-羥苯丙酮酸 (PPY和HPP) 脫羧酶(ARO10、PDC5和PDC6)，減少副產物苯乙醇的產生等策略[3]，均可有效提高對香豆酸的產量。

圖1 釀酒酵母中對香豆酸的生物合成途徑和相關轉運蛋白Fig.1 Biosynthetic pathway for p-Coumaric acid and amino acids,carbohydrate transporters in S.cerevisiae.FBP1:fructose-bisphosphatase; Ecfbp1:fructose-bisphosphatase from E.coli;PCK1:phosphoenolpyruvate carboxykinase;EcppsA:phosphoenolpyruvate synthase from E.coli;ENO1:phosphopyruvate hydratase; EcaroL:shikimate kinase from E.coli;ARO3 and ARO4:3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase; ARO1:pentafunctional arom protein;ARO7:chorismate mutase;FjTAL:tyrosine ammonia-lyase TAL from Flavobacterium johnsoniaeu;TAT1:amino acid transporter for valine,leucine,isoleucine,and tyrosine; TAT2:high affinity tryptophan and tyrosine permease;TPO1:polyamine transporter of the major facilitator superfamily; ALP1:arginine transporter. AGP3:polyamine transporter of the major facilitator superfamily; ADY2:acetate transporter; BAP2:high-affinity leucine permease;GAL2:galactose permease.

為獲得優(yōu)良的產對香豆酸工程菌株，本研究以釀酒酵母CEN PK2-1D為底盤細胞，首先通過敲除酪氨酸合成競爭路徑基因ARO10和PDC5，突變芳香族氨基酸合成調控基因ARO4K229L與ARO7G141S，解除芳香族氨基酸負反饋抑制并整合酪氨酸解氨酶FjTAL，構建了產對香豆酸酵母菌株C001。為進一步優(yōu)化對香豆酸產量，研究了8個不同氨基酸、多胺和糖類相關轉運基因敲除對對香豆酸合成的影響，并且過表達酵母和大腸糖異生途徑上的關鍵基因，強化前體的供應，最后利用酪氨酸解氨酶亞細胞定位的方法，進一步提高對香豆酸的產量，最終獲得工程菌株的對香豆酸產量可達593.04 mg/L。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

釀酒酵母CEN PK2-1D作為出發(fā)菌株。大腸桿菌Escherichia coli菌株JM109用于所有質粒的克隆。PCR引物及測序服務均由生工生物工程 (上海) 股份有限公司提供。所用菌株和引物詳見表1和表2。

表1 本研究所用的菌株Table 1 Strains used in this study

表2 本研究所用的引物Table 2 Primers used in this study

1.1.2 主要酶及相關試劑盒

一步克隆酶試劑盒購自南京Vazyme生物科技有限公司；DNA聚合酶、DNA Marker及pMD19-T Simple Vector購自TaKaRa公司；其他化學試劑均購自國藥 (分析純)。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%氯化鈉，篩選培養(yǎng)基添加100 μg/mL芐青霉素。

YPD培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖。

SC培養(yǎng)基：0.5%硫酸銨，0.174%酵母基礎氮源培養(yǎng)基 (YNB)，2%葡萄糖。根據(jù)酵母內載體攜帶的標簽添加50 mg/L缺失的氨基酸組分，固體培養(yǎng)基中都額外添加2%的瓊脂。

1.2 質粒與菌株構建

來源于黃桿菌的酪氨酸解氨酶基因 (FjTAL)為本實驗室前期保存，酵母啟動子、基因和終止子從CEN PK2-1D基因組上擴增，EcppsA、Ecfbp1、EcaroL基因從大腸桿菌基因組上擴增。使用Vazyme的一步克隆酶或Gibson多片段組裝酶構建質粒，通過PCR及測序驗證質粒是否構建成功。通過融合基因序列的上游和下游構建敲除框，利用CRISPR/Cas9技術敲入或者敲除目標基因，分別設計位于基因與同源臂序列上的引物，通過PCR驗證基因是否被成功敲除或敲入并測序驗證。

1.3 產對香豆酸酵母菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

挑選釀酒酵母單菌落接種到YPD或SC培養(yǎng)液中在30 ℃、220 r/min活化培養(yǎng)18–20 h。然后按2%接種量轉接到裝液量為25 mL的250 mL搖瓶中，30 ℃、220 r/min發(fā)酵72 h，初始葡萄糖濃度為20 g/L。按一定時間間隔取樣，每次取100 μL發(fā)酵液稀釋至OD600在0.2–0.8之間，用分光光度計檢測OD600處的吸光值。

1.4 亞細胞定位與分析

構建質粒pRS424-TEF1p-vtFjTAL，將酵母羧肽酶Y (PRC1) 錨定信號肽 (KAISLQRPLGLDKDVL)與FjTAL蛋白的N末端融合使其具有液泡定位功能[12]。在釀酒酵母菌株中分別表達FjTAL和vtFjTAL(vacuole-targetedFjTAL)，HPLC檢測對照菌株和表達vtFjTA1菌株發(fā)酵液中對香豆酸含量。

1.5 對香豆酸產量的測定

取500 μL發(fā)酵液于1.5 mL離心管中，加入等體積甲醇，振蕩混勻，12 000 r/min離心2 min，用1.5 mL注射器取上清，上清過孔徑0.2 μm的尼龍濾膜。使用HPLC (Thermo) 配備Hypersil ODS-2 (250 mm×4.6 mm，5 μm) 的C18柱與紫外檢測器檢測發(fā)酵液中對香豆酸的含量。對香豆酸檢測波長為290 nm，柱溫40 ℃，流動相流速1.0 mL/min，上樣量10 μL。洗脫所用的兩種流動相A相和B相分別為加入0.1% (V/V) 三氟乙酸(TFA) 的水和乙腈。流動相梯度洗脫程序為：B相組分從10% (0–0.1 min) 開始，之后B相組分從10%到40% (0.1–9.0 min) 線性增加，然后B相組分從40%增加到60% (9.0–15.0 min)，之后B相組分再從60%降到10% (15–18 min)，然后B相組分維持在10% (18.0–20.0 min)直至結束，對香豆酸滯留時間為9.8 min，通過與標準曲線擬合，對對香豆酸的濃度定量。

2 結果與分析

2.1 產對香豆酸重組酵母菌株的構建

莽草酸途徑中，ARO4和ARO7受芳香族氨基酸的反饋抑制，這會阻礙芳香族氨基酸的合成[11]。此外，丙苯酮酸 (PPY) 和4-羥基苯丙酮酸(4-HPP) 是生物合成芳香族氨基酸的重要前體物質，而ARO10和PDC5催化PPY和4-HPP生成相應的苯乙醛和4-羥基乙酸，影響了對香豆酸前體供應[13]。為獲得一株產對香豆酸的出發(fā)菌株，分別以GAL1、10p和GAL7p作為ARO4K229L、ARO7G141S和FjTAL的啟動子，通過CRISPR/Cas9基因編輯方法，將ARO4K229L和ARO7G141S整合到ARO10的位置上，解除酪氨酸負反饋抑制和阻斷旁路競爭途徑，將酪氨酸解氨酶FjTAL整合至PDC5的位置上。進一步敲除GAL80解除其對GAL系列啟動子的影響[14]，獲得產對香豆酸重組菌株C001 (圖2)。通過搖瓶發(fā)酵評價其產香豆酸性能，測定發(fā)酵液中芳香族氨基酸和對香豆酸產量。發(fā)酵結果表明發(fā)酵液中含有296.73 mg/L的對香豆酸，此外分別有22.55 mg/L、55.20 mg/L和56.29 mg/L的色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸積累(圖3)。

圖2 產對香豆酸重組菌株PCR驗證Fig.2 PCR validation of recombinant strain C001.(A) Integration of FjTAL at PDC5 site.(B) Integration of ARO4K229L and ARO7G141S at ARO10 site.(C) Knockout of GAL80.WT:wild type;M:DNA marker;1–2:strain C001.

圖3 C001菌株發(fā)酵72 h后色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和對香豆酸產量Fig.3 Yield of tryptophan(Trp),phenylalanine(Phe),tyrosine(Tyr) and p-CA for C001 strain at 72 h.

2.2 不同轉運蛋白對對香豆酸積累的影響

有研究表明，敲除TAT1、TPO1、ALP1、AGP3、ADY2、GAL2和BAP2等轉運相關基因，對香豆酸產量可提高20%–50%[15]。通過對蛋白功能比較發(fā)現(xiàn)，這些蛋白主要與氨基酸、多胺和糖類的轉運相關 (表3)，例如TAT1與TAT2均與芳香族氨基酸的轉運密切相關[16]。為進一步研究不同轉運蛋白對對香豆酸合成的影響，在C001的基礎上分別敲除TAT1、TAT2、TPO1、ALP1、AGP3、ADY2、GAL2和BAP2共8個基因，并評價其對菌體生長的影響。

結果表明敲除TAT1、TAT2、ALP1、TPO1和ADY2對香豆酸產量沒有明顯提高且對菌體生長影響較小 (圖4)。有研究報道缺失TAT1可以減少胞內酪氨酸外泄，增強底物的供應，從而提高對香豆酸產量[15]。本研究中缺失TAT1對香豆酸產量卻沒有提高，可能是因為C001對香豆酸產量較低，單敲除TAT1并沒有影響胞內酪氨酸前體的供應，不會顯著改變對香豆酸產量。進一步在TAT1缺失的基礎上敲除同樣具有酪氨酸轉運功能的TAT2，結果表明雙敲除菌株前24 h生長緩慢，推測雙敲除菌株C010在生長早期芳香族氨基酸攝取受限，導致前期生長緩慢，進而影響對香豆酸產量。此外，敲除AGP3、BAP2和GAL2后對香豆酸產量分別提高了8.98%、16.82%和46.14%。然而，在單敲除GAL2的C009菌株基礎上分別敲除AGP3(C011) 和BAP2(C012)，對香豆酸產量并未進一步提高。其中C011菌株生長受到影響，對香豆酸產量反而降低了7.76%。初步研究結果表明部分轉運蛋白的敲除可以有效提高對香豆酸產量，而不同轉運蛋白的協(xié)同作用還需進一步研究。

2.3 強化糖異生途徑積累PEP和E4P

莽草酸途徑是芳香族氨基酸合成的主要途徑，其中PEP和E4P是該途徑的關鍵前體 (圖1)。在釀酒酵母中，糖異生途徑合成PEP由PYC1和PCK1催化[17]，而在大腸桿菌中，EcppsA可將丙酮酸轉化為PEP[18]。釀酒酵母和大腸桿菌中，果糖-1,6-二磷酸 (FDP) 在果糖二磷酸酶FBP催化作用下轉化為果糖6磷酸 (F6P)，進而合成E4P[19]。為進一步提高前體PEP和E4P的供應，分別過表達PCK1、EcppsA、ENO1、FBP1、Ecfbp1并分析其對香豆酸積累的影響 (圖5)。結果表明單獨過表達ENO1、PCK1對香豆酸產量都沒有顯著提高，而在C015中過表達EcppsA后，對香豆酸產量提高到475.11 mg/L。在過表達EcppsA基礎上分別過表達ENO1、PCK1，改造后菌株C016和C017的對香豆酸產量并沒有進一步提升。以往也有類似研究表明在釀酒酵母中過表達PCK1時并沒有明顯增加PEP積累，可能是由于釀酒酵母胞內草酰乙酸濃度過低導致[20]。最后，分別利用低拷貝和高拷貝質粒過表達釀酒酵母和大腸桿菌來源的果糖雙磷酸酶基因，均對菌株生長有明顯抑制作用，可能是過表達果糖雙磷酸酶基因使胞內同時進行糖異生和糖酵解循環(huán)造成ATP浪費[21]，從而阻礙酵母正常生長。以上結果表明對糖異生途徑中不同基因的組合調控，有利于進一步強化對香豆酸前體供應。

表3 TAT1、TAT2、TPO1、ALP1、AGP3、ADY2、GAL2和BAP2基因的功能Table 3 Function of 8 genes including TAT1, TAT2,TPO1, ALP1, AGP3, ADY2, GAL2 and BAP2

圖4 轉運蛋白基因敲除對對香豆酸產量(A)及酵母生長(B)的影響Fig.4 Effect of transporter genes knockout on p-CA yield and yeast growth.(A) Effects of single and double knockouts of 8 genes on p-CA yield.(B) Effects of single and double knockout on strain growth at 24 h in fermentation.The OD600 of C001 was set as 1.

2.4 FjTAL蛋白亞細胞定位

圖5 糖異生和糖酵解途徑相關基因對對香豆酸產量和重組菌生長的影響Fig.5 Effects of gluconeogenesis and glycolysis pathways related genes on p-CA yield and growth.The OD600 of C009 was set as 1.

前期研究表明，F(xiàn)jTAL不能將發(fā)酵過程中積累的酪氨酸完全轉化為對香豆酸，導致部分前體芳香族氨基酸的積累。而FjTAL游離過表達可以提高酪氨酸的轉化效率，對香豆酸產量提高了4.64%，因此FjTAL催化效率不足是影響對香豆酸積累的限制因素。已有研究報道，酵母液泡會在氮源豐富時儲存50%的氨基酸，在氮源缺乏時，液泡中氨基酸排泄到細胞質中保證酵母生長[22]。為進一步促進酪氨酸有效轉化，利用羧肽酶Y的錨定肽將FjTAL定位到液泡，改造后菌株C026對香豆酸產量為593.04 mg/L，提高了23.31%(圖6A)。以上研究結果表明，相較于游離表達FjTAL，將FjTAL定位于液泡的策略是有效的，可能是由于液泡定位后的FjTAL能夠快速利用液泡中的酪氨酸，增加局部氨基酸底物濃度，提高催化效率，使得對香豆酸產量提高。

3 討論

對香豆酸及其衍生物在醫(yī)藥和保健品領域具有重要的應用前景，因此構建能夠高效合成對香豆酸的工程菌株具有重要意義。本研究中，通過表達莽草酸途徑上的抗反饋抑制基因ARO4K229L和ARO7G141S解除限速步驟，敲除ARO10和PDC5阻斷旁路競爭途徑和過表達FjTAL，獲得產對香豆酸工程菌株C001。在C001的基礎上，分別敲除TAT1、TAT2、TPO1、ALP1、AGP3、ADY2、GAL2和BAP2，篩選影響酵母合成對香豆酸的關鍵基因GAL2，GAL2敲除菌株C009對香豆酸產量提高了46.14%。有研究表明過表達莽草酸途徑相關基因能有效提高對香豆酸產量[23-24]，我們嘗試過表達了莽草酸途徑上的基因ARO1和EcaroL，但沒有明顯效果。為進一步強化PEP和E4P前體供應，過表達酵母和大腸桿菌糖異生途徑上的PCK1、EcppsA、ENO1、FBP1、Ecfbp1基因，研究發(fā)現(xiàn)只有過表達EcppsA基因可將對香豆酸產量提高至475.11 mg/L。由于FjTAL酪氨酸解氨酶是對香豆酸合成的關鍵酶，其催化性能不足，限制對香豆酸的有效積累[25]。利用亞細胞定位策略，將FjTAL過表達并錨定到酵母液泡上，提高液泡中酪氨酸利用率，對香豆酸產量提高至593.04 mg/L。綜上，通過代謝工程優(yōu)化產對香豆酸酵母工程菌株，對香豆酸產量較出發(fā)菌株提高了近一倍 (圖6B)，為接下來對香豆酸衍生物的高效生物合成研究奠定基礎。

圖6 FjTAL錨定到液泡和系統(tǒng)代謝工程改造優(yōu)化對對香豆酸產量的影響.(A: FjTAL游離表達和錨定到液泡對對香豆酸產量的影響；B:C001基礎上敲除及過表達不同基因對對香豆酸產量的影響)Fig.6 Effect of vacuole-targeted FjTAL enzyme and metabolic engineering optimization on p-CA yield.(A) Effects of free expression and vacuole-targeting FjTAL on p-CA yield.(B) p-CA quantification of the different engineered strains.