王繼國，謝有余，王華磊，魏東芝

華東理工大學(xué) 生物工程學(xué)院，上海 200237

據(jù)FDA數(shù)據(jù)庫分析，手性胺類化合物是小分子藥物合成中重要的分子模塊[1]。相比化學(xué)催化劑，合成手性胺的生物催化劑以光學(xué)純度高、環(huán)境污染小等優(yōu)勢[2-3]一直被作為研究熱點，如轉(zhuǎn)氨酶類[4-10]、單胺氧化酶類[11]、亞胺還原酶類[12-13]及胺脫氫酶類[14-15]等。其中ω-轉(zhuǎn)氨酶 (ω-TAs) 具有對映選擇性和區(qū)域選擇性高、底物譜較廣以及無需額外添加昂貴的輔酶的優(yōu)勢，成為工業(yè)上用于生產(chǎn)手性胺的重要工業(yè)酶之一[3,16-24]。

目前報道的野生ω-TAs中能直接用于制藥工業(yè)的為數(shù)不多，主要受限于酶的熱不穩(wěn)定及不利的反應(yīng)平衡[4-10]。異丙胺 (IPA) 被認為是ω-TAs工業(yè)應(yīng)用的理想氨基供體，其價格低廉利于供體過量，可以通過移除副產(chǎn)物丙酮來改變反應(yīng)平衡[3-4]。但能接受IPA供體的野生ω-TAs數(shù)量極少，極大限制了其作為理想氨基供體的工業(yè)應(yīng)用[25]。利用IPA供體有效地改變反應(yīng)平衡對ω-TAs提出了嚴格的要求[26]：(1) 能接受IPA為供體；(2) 最適反應(yīng)溫度在40–60 ℃之間，且保持較高的熱穩(wěn)定性；(3) 最適pH值在7.0以上；(4) 能轉(zhuǎn)化100–250 mmol/L以上的底物濃度[27]。

近年來基于新型氨基供體的高通量篩選方法被大量建立[5]，但是這些氨基供體因成本高及產(chǎn)物純化難等問題難以適應(yīng)工業(yè)用途，而目前尚無基于IPA供體的高通量篩選方法。所以適當(dāng)選擇合適的高通量篩選方法，配合兼容IPA供體的轉(zhuǎn)化率篩選流程有利于新型ω-TAs工業(yè)適應(yīng)性選擇。為了從土壤宏基因組中發(fā)現(xiàn)一種新型ω-TA，我們從目標底物篩選、序列來源篩選做了適應(yīng)工業(yè)的選擇；接著以鄰亞二甲苯二胺顯色法快速初篩酶活，再使用IPA供體的HPLC分析法進行轉(zhuǎn)化率篩選，最后采用1-苯乙胺 (1-PEA) 動力學(xué)分析法進行酶學(xué)篩選，從而篩選出了一種來源于柄桿菌屬的新型ω-轉(zhuǎn)氨酶ATA-W12，并成功用于光學(xué)純(S)-(+)-1-Boc-3-氨基哌啶的50 mL規(guī)模制備。

1 材料與方法

1.1 目標底物及氨基供體

1-Boc-3-哌啶酮 (98977-36-7)、1-Boc-3-吡咯烷酮 (101385-93-7) 作為目標底物，鄰亞二甲苯二胺二鹽酸鹽 (21294-14-4)、IPA (75-31-0) 和(S)-(-)-α-甲基芐胺 (2627-86-3，1-PEA)作為氨基供體。其中鄰亞二甲苯二胺二鹽酸鹽購自杰達維(上海) 醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，另外4種均購自上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司。其余化學(xué)試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 土壤宏基因組DNA提取及測序

土壤樣品按Fast DNA Spin Kit for Soil試劑盒(MP Biomedicals，USA) 提取土壤基因組DNA，交于上海派森諾生物科技股份有限公司用Hiseq 2000 (Illumina Inc，USA) 進行高通量測序。得到3.3 Gb的棉花地土壤宏基因組數(shù)據(jù)，由ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)及blastx(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 分析獲得21個ω-TAs基因全長序列 (具體數(shù)據(jù)作為附件，包括附表1和2，附圖1和2，可在網(wǎng)絡(luò)版中下載。見附表1)。

1.3 ω-TAs的克隆和表達

設(shè)計含雙酶切位點的21個候選ω-TAs基因的引物序列 (見附件附表2)，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。使用南京諾唯贊生物科技有限公司的2×TaqMaster Mix進行PCR擴增，循環(huán)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；35個循環(huán) (95 ℃變性15 s；60 ℃退火15 s；72 ℃延伸1.5 min)；最終72 ℃延伸5 min，4 ℃孵育。將擴增成功的產(chǎn)物使用FavorPrep? GEL/PCR purification kit(Favorgen，Taiwan) 進行DNA凝膠回收。

用FastDigest系列BamHⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ和XhoⅠ(Thermo，USA) 將PCR產(chǎn)物和pET-28a (+) 質(zhì)粒載體 (Merck，Germany) 酶切后使用Ligation high(TOYOBO，Janpan) 進行連接。重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Escherichia coliDH5α后通過菌落PCR及測序進行鑒定，鑒定成功后轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)表達宿主中。E.coliDH5α和E.coliBL21 (DE3) 購自天根生化科技 (北京) 有限公司。

鑒定成功的單克隆接種到含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基試管，在37 ℃、200 r/min搖床中過夜培養(yǎng)。按1%接種到含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)。當(dāng)OD600達到0.6–0.8時，加入0.1 mmol/L IPTG，在20 ℃、200 r/min條件下誘導(dǎo)表達。收集菌體經(jīng)2次洗滌后在100 mmol/L Tris-HCl緩沖液 (pH 8.0) 中超聲破碎，在4 ℃、8 000×g條件下離心15 min收集得到上清。上清及沉淀重懸液用SDS-PAGE分析蛋白表達狀況。

1.4 ω-TAs的活性篩選

按照Green AP的顯色方法[28]在白色96孔微孔板 (Nucn，Denmark) 建立了200 μL反應(yīng)體系，每個反應(yīng)混合液中包含30 mmol/L鄰亞二甲苯二胺二鹽酸鹽、20 mmol/L目標底物、0.1 mmol/L輔酶PLP及80 μL粗酶液，用100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0) 補足到200 μL。設(shè)置無酶和無底物對照，兩個復(fù)孔。在微孔板振蕩器 (杭州奧盛) 中37 ℃、500 r/min進行反應(yīng)。反應(yīng)持續(xù)到15 min和16 h后分別觀察顏色變化及拍照。

1.5 ω-TAs的底物轉(zhuǎn)化率測定

為了篩選能兼容IPA供體并對兩種目標底物高轉(zhuǎn)化率的ω-TAs，建立了1 mL反應(yīng)體系。反應(yīng)液包括30 mmol/L IPA、20 mmol/L目標底物、0.1 mmol/L輔酶PLP及 400 μL粗酶液，用100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 補足到1 mL。反應(yīng)在37 ℃、200 r/min搖床中進行。反應(yīng)持續(xù)16 h的產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取后進行HPLC分析。HPLC分析條件為：Zorbax XDB-C18色譜柱 (Agilent,USA)；流動相PBS︰MeOH=70︰30；流速0.8 mL/min；柱溫37 ℃；檢測波長210 nm。用不含酶對照的目標底物吸收峰面積為100%，用目標底物的峰面積除以對照體系的峰面積計算底物的轉(zhuǎn)化率。

1.6 ATA-W12的酶學(xué)性質(zhì)測定

采用常州天地人和生物科技有限公司的鎳柱試劑盒對ATA-W12轉(zhuǎn)氨酶進行純化，用SDS-PAGE進行蛋白鑒定及Bradford法進行蛋白定量。

按照Sch?tzle等報道的酶動力學(xué)分析法[29]，在紫外96孔酶標板中建立了200 μL反應(yīng)體系，用SPECTRAMAX190酶標儀 (Molecular Devices，USA) 在波長245 nm下進行測定。反應(yīng)液中包含2.5 mmol/L 1-PEA、2.5 mmol/L丙酮酸、0.25%二甲基亞砜及0.392 μg ATA-W12蛋白，用對應(yīng)的反應(yīng)緩沖液補足200 μL。

為了測定最適pH值我們配制了不同pH的緩沖液，包括100 mmol/L PBS的pH值調(diào)為6.0、7.0；100 mmol/L Tris-HCl的pH值調(diào)為8.0、8.5、9.0；100 mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉溶液pH值調(diào)為9.2、10.0、10.5。最適pH測定在37 ℃，5 min反應(yīng)測定吸收值，以最高吸收值為100%計算相對酶活力。

為了測定ATA-W12的最適溫度，我們使用最適pH的緩沖液，加入如上反應(yīng)體系。在4 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、65 ℃及70 ℃下反應(yīng)5 min后測定，以最高吸收值為100%計算相對酶活力。

為了測試ATA-W12熱穩(wěn)定性，將8臺加熱制冷金屬浴(杭州博日)設(shè)置溫度為4 ℃、10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃預(yù)熱，然后將ATA-W12稀釋后保溫，分別在0.5、1、3、12、24、43、68、168 h時間點采樣檢測，反應(yīng)緩沖液采用最適pH的緩沖液，40 ℃、5 min反應(yīng)后測定吸收值，以?20 ℃保存的ATA-W12作為對照為100%酶活計算相對酶活。以上所有實驗均以不加酶的反應(yīng)體系作為空白扣除吸收值，設(shè)置3個重復(fù)。

1.7 1-Boc-3-氨基哌啶的50 mL放大規(guī)模制備

采用50 mL放大規(guī)模制備(S)-(+)-1-Boc-3-氨基哌啶，反應(yīng)體系包括5 g ATA-W12濕菌體、500 mmol/L 1-Boc-3-哌啶酮、1.5 mol/L酸化IPA、2 mL二甲基亞砜、0.2 mmol/L PLP和100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)。

反應(yīng)在100 mL反應(yīng)瓶中進行，利用2 mol/L IPA水溶液流加控制pH值為8.5，溫度控制在40 ℃，攪拌速度為300 r/min。每小時取3個重復(fù)樣檢測反應(yīng)進程，通過HPLC分析檢測。轉(zhuǎn)化率測定采用ZORBAX Extend C18 (4.6 mm×250 mm×5 μm)，流動相為28%乙腈︰72% TFA溶液 (0.1%)，流速為0.8 mL/min，柱溫37 ℃，進樣量5 μL，210 nm紫外檢測。轉(zhuǎn)化率通過產(chǎn)物摩爾量除以添加底物摩爾量的比率來計算。取反應(yīng)后溶液100 μL加入500 μL的乙酸乙酯萃取2次，加入無水硫酸鈉干燥過夜，溶于異丙醇后用HPLC測ee值。ee值測定采用Chiralcel AD-H，流動相為90%的正己烷︰10%的乙醇，流速為1 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量5 μL，210 nm紫外檢測。反應(yīng)結(jié)束后用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取相，12 000 r/min離心10 min后取有機相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到(S)-(+)-1-Boc-3-氨基哌啶。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標底物的選擇

手性3-氨基哌啶及3-氨基吡咯烷是一種重要手性胺醫(yī)藥中間體，廣泛用于原料藥的合成，如妥舒沙星、克林沙星、頭孢霉菌素衍生物等，還作為治療肥胖、Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病、抗抑郁和精神分裂的原料藥的重要分子砌塊。但化學(xué)法合成路線復(fù)雜，拆分及氨基保護試劑成本太高，手性胺產(chǎn)物的光學(xué)活性差[30]。近10年來科學(xué)家一直在嘗試使用ω-TAs進行動力學(xué)拆分及不對稱合成來生產(chǎn)這兩種醫(yī)藥中間體，但限于ω-TAs性能都面臨著底物水平低、轉(zhuǎn)化率低及反應(yīng)時間過長等問題難以適應(yīng)工業(yè)用途[27,30-33]。所以針對這兩種手性胺醫(yī)藥中間體的生產(chǎn)篩選一種適應(yīng)于工業(yè)用途的ω-轉(zhuǎn)氨酶非常具有研究價值和應(yīng)用前景。

另外H?hne等[30]發(fā)現(xiàn)使用ω-TAs合成這兩種醫(yī)藥中間體時，采用Boc或Cbz保護雜環(huán)氮能有效地提高ω-TAs的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和ee值，所以本研究選擇1-Boc-3-哌啶酮和1-Boc-3-吡咯烷酮作為這兩種手性胺合成的目標底物。

2.2 序列來源的選擇

目前報道的野生轉(zhuǎn)氨酶很少能適應(yīng)工業(yè)應(yīng)用，這可能由于序列來源的工業(yè)導(dǎo)向性差。我們進行此研究時采集了深海污泥、棉花地土壤、酒廠窖泥及貴州紅壤4種環(huán)境樣品。對比這4種土壤來源，棉花地土壤長期以尿素及動物糞便肥料為主，其中含有豐富的氨類化合物及耐受高氨濃度的細菌菌群，選擇其宏基因組作為挖掘耐高氨濃度、適應(yīng)工業(yè)應(yīng)用的ω-TAs的最佳來源。我們對棉花地土壤基因組DNA進行了提取并進行了高通量測序，并獲得了21個ω-TAs基因全長序列(見附表1)。

2.3 ω-轉(zhuǎn)氨酶克隆篩選

從土壤宏基因組高通量測序所得到的ω-TAs基因的豐度和在工程菌中克隆表達情況有很大差異，所以我們設(shè)計了21個ω-TAs候選基因的引物(見附表2)，對這些基因進行克隆篩選。

最終我們從21個候選ω-TAs基因中成功擴增了11個ω-TAs基因。接著將這11個基因克隆到pET-28a(+)載體上進行菌落PCR并將構(gòu)建的質(zhì)粒測序進行確認 (圖1)，圖1酶的標號省略ATA-。結(jié)果顯示，6種ω-TAs 包括ATA-W5、7、8、11、12及19被成功克隆。對這6種ω-TAs進行了表達，制備了6種粗酶液 (菌體裂解液上清)，并用粗酶液 (圖2中a系列) 和沉淀 (圖2中b系列)分析了表達狀況，圖2酶編號省略ATA-W。

圖1 菌落PCR和測序確認6種ω-TAs成功克隆Fig.1 Six of ω-TAs were successfully cloned and confirmed by colony PCR and sequencing.

圖2 SDS-PAGE鑒定ω-轉(zhuǎn)氨酶表達Fig.2 Identification of ω-TAs by SDS-PAGE.a:clarified cell lysates b:insoluble fraction.

ATA-W11、19兩種蛋白以包涵體形式表達較多，而ATA-W5、7、8、12這4種ω-TAs主要為可溶性表達。雖然有兩種在上清中表達較少，為了對其上清酶活進行確認，也對其進行了酶活篩選實驗，進一步驗證6種粗酶液酶活性情況。

2.4 酶活力初步篩選

為了篩選對兩種目標底物有活性的酶，我們采用Green等報道的顯色方法[28]針對6種新酶粗酶液和13種ω-TAs原酶庫粗酶液進行了酶活篩選，結(jié)果如圖3所示。

圖3 19種ω-TAs粗酶液的酶活篩選Fig.3 Activity screening of 19 ω-TAs’ clarified cell lysates.

圖3中1–3列含20 mmol/L 1-Boc-3-吡咯烷酮，4–6列含20 mmol/L 1-Boc-3-哌啶酮，每列含兩個復(fù)孔。A行為無酶的對照組；含ATA-W5的B1/B2和含PSGA的B4/B5 作為無底物空白對照。C-H1/4分別包含ATA-W5、7、8、11、12、19共6種來自于宏基因組挖掘的新型ω-TAs。C-H2/5和C-H3/6分別為ATA-2、6、8、9、PSGA、BPSTM和ATA-12、13、14、15、16、17、18，共計13種為本研究組ω-TAs原酶庫。

反應(yīng)進行15 min后，含7種原酶庫ω-TAs孔出現(xiàn)了不同程度顏色加深，包括PSGA、ATA-2、8、9、13、15、18，說明反應(yīng)速度快。但由于B4/B5含PSGA的無底物對照顏色也變深，故無法說明顏色加深是否由于底物轉(zhuǎn)化造成。反應(yīng)經(jīng)過16 h之后，除以上含7種酶的孔形成明顯黑色沉淀外，含另外4種酶的孔，包括ATA-W12和ATA-12、14、17也形成了黑色沉淀，說明這4種酶反應(yīng)速率慢，但也具有較高的活性。

因含PSGA酶的無底物對照組有不依賴目標底物反應(yīng)的假陽性，因96孔板通量問題，原反應(yīng)只對ATA-W5和PSGA做了對照。為了進一步確認，我們對經(jīng)過16 h反應(yīng)能形成黑色沉淀的11種酶重新進行測定，如圖4所示，2/5列為含1-Boc-3-吡咯烷酮的反應(yīng)，3/6列為含1-Boc-3-哌啶酮的反應(yīng)，f5/6均為不含酶的對照。1/4為含酶不含底物的空白組。

經(jīng)16 h反應(yīng)后，含11種酶實驗組及對照組出現(xiàn)了黑色沉淀 (圖4)。圖4中不含酶空白組均未出現(xiàn)黑色沉淀，說明了這種假陽性的產(chǎn)生不是Green等所推測的由PLP造成的，可能是由于其推測的粗酶液本身含有天然酮類底物如丙酮酸產(chǎn)生的非特異反應(yīng)。

圖4 確認粗酶液中酮類及PLP雜質(zhì)的影響Fig.4 Confirming the influence of impurity ketone or PLP in the clarified cell lysates.

Green等報道的顯色篩選法[28]一直被作為一種正向篩選法來高通量篩選ω-TAs，但是實驗結(jié)果說明，可能由于粗酶液中太多丙酮酸等酮類雜質(zhì)造成該方法并不適合粗酶液的正向篩選。無論如何，黑色沉淀的形成說明ω-TAs一定具有很高的酶活力。所以該方法可作為一種“負向篩選法”來排除低活性的酶進行酶活力初篩。通過這種“負向”酶活初篩，我們篩選出共11種具有較高活性的ω-TAs，包括原酶ATA-2、8、9、12、13、14、15、17、18、PSGA和宏基因組挖掘的新酶ATA-W12。

2.5 兼容IPA的轉(zhuǎn)化率篩選

為了進一步確認這11種ω-TAs對IPA的兼容性及底物轉(zhuǎn)化能力，以30 mmol/L IPA和20 mmol/L目標底物 (1-Boc-3-哌啶酮及吡咯烷酮) 建立了1 mL密閉反應(yīng)，經(jīng)過37 ℃、16 h反應(yīng)后用HPLC法檢測底物轉(zhuǎn)化率。

圖5顯示了這種篩選的結(jié)果，除了ATA-12對1-Boc-3哌啶酮的反應(yīng)非常低之外，其他所有酶對兩種底物都在IPA供體下具有不同的轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化率超過50%的是ATA-2、9和ATA-W12。轉(zhuǎn)化率篩選結(jié)果和顯色對比讓我們感到意外的是，ATA-2、9在顯色篩選法中僅15 min就發(fā)生了顏色變化，說明酶的反應(yīng)速度很快；而ATA-W12反應(yīng)很慢，16 h反應(yīng)后卻比ATA-2、9轉(zhuǎn)化率高。這可能是由于ATA-W12比ATA-2、9在37 ℃下的熱穩(wěn)定性更高，一直在反應(yīng)中維持更高的活性。也說明了顯色篩選法只能作為一種不依賴于底物的初篩方法，為IPA供體下轉(zhuǎn)化率篩選法降低工作量。

圖5 兼容IPA的ω-TAs轉(zhuǎn)化率篩選Fig.5 Conversion screening of ω-TAs with IPA.

分析以ATA-2、9和ATA-W12三種ω-TAs的反應(yīng)產(chǎn)物測定的HPLC圖譜 (見附圖1)，ATA-W 12處于25.663 min產(chǎn)物峰的信號是最強的。再者為了真實體現(xiàn)11種ω-TAs在不采取副產(chǎn)物移除的情況下對兼容IPA下底物轉(zhuǎn)化效率，我們進行此1 mL反應(yīng)時采取了密閉管反應(yīng)體系。即使在這種密閉反應(yīng)體系下，ATA-W12 可以轉(zhuǎn)化67.42%的1-Boc-3-哌啶酮和85.84%的1-Boc-3-吡咯烷酮，這有利于減壓或微加熱去除副產(chǎn)物丙酮改變轉(zhuǎn)氨反應(yīng)平衡的策略實施。

2.6 ATA-W12的酶學(xué)篩選

根據(jù)宏基因組測序數(shù)據(jù)可知ATA-W12是一種來源于Caulobactersp.UNC358 MF Tsu5.1的轉(zhuǎn)氨酶，用Pfam蛋白家族數(shù)據(jù)庫分析可知屬于Ⅲ類TAs。目前為止，在野生轉(zhuǎn)氨酶[5]中，來源于Caulobactersp.的ω-TAs尚未見研究報道，所以我們對ATA-W12進行了酶學(xué)性質(zhì)研究。

如圖6所示，泳道1為純化的ATA-W12，分子量大約55 kDa左右，110 kDa左右較淡條帶為酶的二聚體形式；泳道2和3分別為菌體破碎液的沉淀部分及上清部分，說明了ATA-W12為可溶性表達。

圖6 ATA-W12的表達及純化Fig.6 Overexpression and purification of ATA-W12.Lane 1:purified ATA-W12 and its dimer;lane 2:precipitation fraction;lane 3:supernatant fraction.

為了得到ATA-W12的適宜反應(yīng)條件，我們測定了ATA-W12ω-轉(zhuǎn)氨酶的最適pH值、最適溫度和溫度依賴的熱穩(wěn)定性，結(jié)果見圖7。

圖7A顯示了ATA-W12最適pH值為8.5，符合了用IPA為供體時理想指標 (pH值大于7.0)。在pH 8.5的堿性環(huán)境下，氨基供體和手性胺產(chǎn)物的氨基被質(zhì)子化，從而減少減壓或加熱原位蒸餾時氨基供體和手性胺產(chǎn)物的損失。同時可以看出即使pH達到9.0，該酶依然保持90%左右的活性，pH 8.5–9.0的高活性范圍使得工業(yè)生產(chǎn)控制過程更為簡便。

圖7B顯示了ATA-W12最適溫度為50 ℃，且在40 ℃時仍有96%以上的酶活力，這種40–50 ℃的范圍也符合IPA供體原位蒸餾最佳范圍40–60 ℃之間。這種范圍既能實現(xiàn)有效產(chǎn)物移除，又能避免底物和目標產(chǎn)物的蒸餾損失。

圖7C顯示了ATA-W12溫度依賴的穩(wěn)定性，我們發(fā)現(xiàn)ATA-W12在40 ℃和50 ℃孵育12 h之內(nèi)酶活力依然保持在96%以上。所以當(dāng)反應(yīng)能控制在12 h內(nèi)完成時，該酶有40–50 ℃的溫控范圍，降低了工業(yè)生產(chǎn)對溫度控制設(shè)備的要求。但是在12 h以上時，50 ℃孵育的酶活力逐漸下降，而40 ℃孵育168 h后依然保持，所以結(jié)合最適溫度和熱穩(wěn)定性，ATA-W12的最適溫度控制在40 ℃較為合適。出乎意料的是，40 ℃孵育的酶活力與4–30 ℃之間孵育相比，隨著孵育時間的延長酶的活力反而緩緩上升，推測可能40 ℃情況下能讓該酶保持高活性構(gòu)象狀態(tài)。

圖7 1-PEA快速分析法鑒定ATA-W12酶學(xué)性質(zhì)Fig.7 Characterization of the ATA-W12 by a rapid assay using 1-PEA.

綜合以上三者的ATA-W12的酶學(xué)篩選結(jié)果，可得出ATA-W12在pH 8.5和溫度40 ℃條件下進行手性胺中間體放大合成的優(yōu)選適宜反應(yīng)條件。pH值范圍在8.5–9之間，若反應(yīng)在12 h之內(nèi)完成，溫度可在40–50 ℃之間進行調(diào)整。

2.7 ATA-W12的工業(yè)潛力驗證

為了驗證新型轉(zhuǎn)氨酶-ATA-W12工業(yè)適應(yīng)的潛力，我們采用酶學(xué)篩選確立的ATA-W12的初步反應(yīng)條件實現(xiàn)(S)-(+)-1-Boc-3-氨基哌啶的50 mL實驗室規(guī)模放大測試。為了方便制備，采用5 g未破碎ATA-W12濕菌體，因在pH 8.5、40 ℃及攪拌速度300 r/min的反應(yīng)條件下，ATA-W12很容易從濕菌體中裂解釋放實現(xiàn)催化。添加4%的二甲基亞砜，使得500 mmol/L 1-Boc-3-哌啶酮容易溶解且對ATA-W12酶活抑制影響不大。采用3倍底物濃度的IPA供體，過量底物濃度使得反應(yīng)利于向產(chǎn)物生成方向進行。因起始反應(yīng)速度快造成pH下降，采用2 mol/L異丙胺水溶液供體流加調(diào)節(jié)pH為8.5。經(jīng)過8 h反應(yīng)后，用HPLC法不能檢測到反應(yīng)底物，500 mmol/L 1-Boc-3氨基哌啶酮幾乎100%轉(zhuǎn)化為 (S)-(+)-1-Boc-3-氨基哌啶，產(chǎn)物純化后測試ee值>99.95% (見附圖2)，該項成果2016年申請了中國發(fā)明專利，并于2019年獲得發(fā)明授權(quán)[34]。

3 結(jié)論與展望

Green等[28]建立的ω-TAs高通量篩選法是基于易脫氨供體鄰亞二甲苯二胺，可廣泛接受各類ω-TAs和酮類底物，因其方法的簡便性及通用性得到廣泛應(yīng)用。本研究發(fā)現(xiàn)該方法在粗酶液篩選中易產(chǎn)生不依賴于目標底物的假陽性，但可以作為一種酶活初篩方法。Schatzle等[29]建立的ω-TAs快速動力分析法是基于另一種易脫氨供體1-PEA的方法，可以快速地對ω-TAs的熱穩(wěn)定性及反應(yīng)條件進行初步篩選。雖然理想工業(yè)用氨基供體IPA可以采用傳統(tǒng)的HPLC及轉(zhuǎn)化率的篩選，但是因費時費力不太適合高通量篩選。本研究組合了基于3種供體的篩選方法建立了一套有效的“ω-轉(zhuǎn)氨酶的工業(yè)適應(yīng)性選擇”流程。發(fā)展以生物傳感器或顯色法檢測丙酮副產(chǎn)物，來建立“基于IPA供體的ω-轉(zhuǎn)氨酶高通量篩選方法“是一個值得繼續(xù)研究的課題。

Gundersen等[32]以25 mL實驗規(guī)模，采用Ars-ωTA轉(zhuǎn)氨酶和IPA氨基供體經(jīng)過96 h反應(yīng)得到50 g/L的(S)-(+)-1-Boc-3-氨基哌啶，轉(zhuǎn)化率為91%。而本研究發(fā)現(xiàn)的ATA-W12采用酶學(xué)篩選的初步反應(yīng)條件和1.5 mol/L的IPA供體，8 h后幾乎完全轉(zhuǎn)化500 mmol/L 1-Boc-3-哌啶酮生成100 g/L的(S)-(+)-1-Boc-3-氨基哌啶，生產(chǎn)效率大大提高。這可能主要源于ATA-W12具有耐高濃度IPA和高熱穩(wěn)定性的優(yōu)良特性。對ATA-W12的轉(zhuǎn)氨過程進行優(yōu)化，提高生產(chǎn)效率值得進一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)的ATA-W12是為數(shù)不多的具有工業(yè)應(yīng)用“天賦”的野生新型ω-轉(zhuǎn)氨酶，通過該酶的底物譜研究，可以實現(xiàn)其他S-型醫(yī)藥中間體的生產(chǎn)。另外也可作為“人工進化”改造的優(yōu)良起始酶種，通過拓展底物譜改造可實現(xiàn)更多醫(yī)藥中間體生產(chǎn)，在制藥工業(yè)中具有廣闊應(yīng)用前景。