李潔瑤，張 毅，王麗萍

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心 鄭州 450052

缺氧微環(huán)境在實(shí)體腫瘤的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，涉及各種轉(zhuǎn)錄因子的活化以及多種復(fù)雜信號(hào)通路的調(diào)控[1]。腫瘤生長(zhǎng)速度過快將導(dǎo)致多數(shù)實(shí)體瘤內(nèi)部產(chǎn)生大面積缺氧區(qū)，在這個(gè)過程中，氧感應(yīng)器低氧誘導(dǎo)因子-1α (hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)由于應(yīng)答缺氧狀態(tài)會(huì)引起腫瘤微環(huán)境發(fā)生變化，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞為了存活做出適應(yīng)性改變，如活化血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子以促進(jìn)腫瘤血管生成[2]。髓源抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)是一群異質(zhì)性細(xì)胞群體，可以從功能和表面標(biāo)記物兩方面進(jìn)行區(qū)分和鑒別[3-4]。MDSC主要發(fā)揮免疫抑制作用，在腫瘤患者體內(nèi)表現(xiàn)為抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖和功能、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞繁殖和耐藥，從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[5-6]。

肺癌的發(fā)病率和死亡率在全球癌癥中居首位;肺癌中約80%為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，大部分NSCLC患者確診時(shí)已處于中晚期或者晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，其中近3/4的患者需要接受姑息性放化療[7]。本研究采集NSCLC患者外周血，檢測(cè)HIF-1α+MDSC的比例，分析其與患者臨床病理指標(biāo)和療效的關(guān)系，以及HIF-1α+MDSC對(duì)CD8+T細(xì)胞殺傷活性的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象NSCLC患者35例, 均為2018年1月至12月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科經(jīng)病理學(xué)確診的住院患者。35例中男22例，女13例；年齡32～75歲，其中<65歲7例，≥65歲28例；腫瘤大小：T1～2 22例，T3～4 13例；19例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期22例，Ⅲ+Ⅳ期13例；分化程度：高分化8例，中分化13例，低分化14例。35例之前均未接受過任何抗腫瘤治療，KPS評(píng)分>70分，預(yù)計(jì)生存期>3個(gè)月。健康供者29名(正常對(duì)照)，年齡32 ～75歲，中位年齡55歲；男20名，女9名。

1.2主要試劑和儀器FITC標(biāo)記的CD3單抗、PE標(biāo)記的CD8單抗、FITC標(biāo)記的顆粒酶B單抗、APC標(biāo)記的穿孔素單抗、APC標(biāo)記的HIF-1α單抗、FITC標(biāo)記的CD33單抗、AE標(biāo)記的CD124單抗、APC-Cy7標(biāo)記的CD14單抗、PE-Cy7標(biāo)記的CD11b單抗、Percp標(biāo)記的7AAD單抗及同型抗體均購(gòu)自BD Pharmingen公司。CD8、CD14和CD11b磁珠均購(gòu)自德國(guó)美天旎公司。超凈工作臺(tái)購(gòu)自珠江市再鑫儀器有限公司，離心機(jī)購(gòu)自Thermo Scientific公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD Biosciences公司。

1.3外周血中相應(yīng)細(xì)胞比例檢測(cè)無菌條件下抽取NSCLC患者與健康供者外周血6 mL(EDTA抗凝)，在6 h內(nèi)，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)。調(diào)整PBMC密度至1×106個(gè)/mL，避光加入免疫熒光抗體或相應(yīng)同型抗體，混勻后室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD14+CD11b+細(xì)胞(M-MDSC)、CD14-CD11b+細(xì)胞(G-MDSC)、HIF-1α+MDSC、CD33+MDSC及CD124+MDSC等細(xì)胞的比例。

1.4NSCLC患者HIF-1α+MDSC對(duì)低氧條件下正常CD8+T細(xì)胞殺傷活性的影響根據(jù)目的細(xì)胞在總細(xì)胞液中的比例以及最終所需細(xì)胞量，大致計(jì)算出需要分選的PBMC總數(shù)，依次加入CD8磁珠、CD14磁珠和CD11b磁珠，分離出某一健康供者CD8+T細(xì)胞和患者G-MDSC、M-MDSC。取健康供者CD8+T細(xì)胞，分為6組，低氧組、低氧+抑制劑組、低氧+G-MDSC1組、低氧+G-MDSC2組、低氧+G-MDSC1+抑制劑組、低氧+G-MDSC2+抑制劑組。6組均用100 mol/L CoCl2誘導(dǎo)低氧培養(yǎng)環(huán)境，低氧+G-MDSC1組和低氧+G-MDSC2組CD8+T細(xì)胞和G-MDSC分別按1∶1和1∶4共孵育；低氧+抑制劑組、低氧+G-MDSC1+抑制劑組和低氧+G-MDSC2+抑制劑組在以上處理基礎(chǔ)上加入HIF-1α抑制劑(10 μmol/L MeOE2)。共孵育72 h后收集各組細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD8+T細(xì)胞分泌顆粒酶B和穿孔素水平。另取健康供者CD8+T細(xì)胞分為6組，即低氧組、低氧+抑制劑組、低氧+M-MDSC1組、低氧+M-MDSC2組、低氧+M-MDSC1+抑制劑組、低氧+M-MDSC2+抑制劑組，同上處理。

1.5治療及療效評(píng)價(jià)所有NSCLC患者均采用以鉑類為基礎(chǔ)的兩藥聯(lián)合化療方案治療4周期，每2周期評(píng)價(jià)一次療效。療效評(píng)價(jià)按照WHO制定的實(shí)體瘤客觀療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)[8]分為：完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)和進(jìn)展(PD)?；煰熜б訮R為好轉(zhuǎn)、SD+PD為未好轉(zhuǎn)分為2組。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。NSCLC患者和正常對(duì)照外周血中HIF-1α+MDSC比例的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，HIF-1α+MDSC比例與CD33和CD124表達(dá)水平的相關(guān)性采用線性相關(guān)分析,HIF-1α+MDSC比例與NSCLC患者療效的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)分析，HIF-1α+MDSC比例與NSCLC患者臨床參數(shù)的關(guān)系采用單因素方差分析或兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，不同孵育比例和有無HIF-1α抑制劑對(duì)CD8+T細(xì)胞分泌顆粒酶B和穿孔素水平的影響采用2×3析因設(shè)計(jì)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組外周血中HIF-1α+MDSC比例的比較NSCLC患者外周血中HIF-1α+G-MDSC和HIF-1α+M-MDSC比例均高于正常對(duì)照(表1)。

表1 2組外周血中HIF-1α+MDSC比例比較 %

2.2NSCLC患者HIF-1α+MDSC比例與其表面CD33和CD124含量的相關(guān)性HIF-1α+G-MDSC比例與其表面CD33和CD124比例呈正相關(guān)，HIF-1α+M-MDSC比例與CD33比例呈正相關(guān)(表2)。

表2 NSCLC患者HIF-1α+MDSC比例與其表面CD33和CD124比例的相關(guān)性

表中為r(P)

2.3不同臨床參數(shù)和療效NSCLC患者外周血HIF-1α+MDSC比例比較NSCLC患者外周血中HIF-1α+MDSC比例與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、分化程度有關(guān)，見表3。35例NSCLC治療后均無CR病例。NSCLC患者以正常對(duì)照組HIF-1α+MDSC比例均值為界，HIF-1α+MDSC比例>11.0%為高比例組，≤11.0%為低比例組。35例患者中HIF-1α+MDSC比例高者19人，治療后6人好轉(zhuǎn)，比例低者16人，治療后12人好轉(zhuǎn)，HIF-1α+MDSC比例低者預(yù)后較好(P=0.018)。

2.4不同條件下NSCLC患者HIF-1α+MDSC對(duì)正常CD8+T細(xì)胞殺傷活性的影響結(jié)果見表4～7。結(jié)果顯示，NSCLC患者的HIF-1α+G-MDSC和HIF-1α+M-MDSC均可抑制正常CD8+T細(xì)胞分泌顆粒酶B和穿孔素的能力，即抑制CD8+T細(xì)胞的殺傷活性，其抑制作用呈一定的劑量依賴性。

表3 HIF-1α+MDSC比例與NSCLC患者臨床參數(shù)的關(guān)系

表4 不同條件下HIF-1α+G-MDSC對(duì)正常CD8+T細(xì)胞分泌顆粒酶B水平的影響

F孵育比例=15.670，P<0.001;F抑制劑=34.290,P<0.001;F交互=1.560，P=0.223

表5 不同條件下HIF-1α+G-MDSC對(duì)正常CD8+T細(xì)胞分泌穿孔素水平的影響

F孵育比例=6.960，P=0.012;F抑制劑=37.000,P<0.001;F交互=2.150，P=0.130

表6 不同條件下HIF-1α+M-MDSC對(duì)正常CD8+T細(xì)胞分泌顆粒酶B水平的影響

F孵育比例=7.480，P=0.009;F抑制劑=28.510,P<0.001;F交互=1.040，P=0.362

表7 不同條件下HIF-1α+M-MDSC對(duì)正常CD8+T細(xì)胞分泌穿孔素水平的影響

F孵育比例=6.400，P=0.015;F抑制劑=49.850,P<0.001;F交互=0.700，P=0.502

3 討論

大多數(shù)NSCLC患者確診時(shí)已達(dá)中晚期，失去手術(shù)根治的機(jī)會(huì)，既往化療是主要治療手段?；熞种颇[瘤增長(zhǎng)、減輕腫瘤負(fù)荷的效率相對(duì)較低，且不良反應(yīng)多，如粒細(xì)胞減少、末梢神經(jīng)炎、脫發(fā)、疲乏和關(guān)節(jié)痛等[9]。隨著醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展，靶向治療和免疫治療逐漸成為晚期腫瘤患者的首選治療方案。但靶向治療的缺陷在于快速耐藥，一代EGFR-TKIs平均耐藥時(shí)長(zhǎng)約為6個(gè)月，而免疫治療，如PD-1單抗，仍有30%～50%患者對(duì)其無應(yīng)答[10-11]。因此，尋找敏感靶點(diǎn)、提高腫瘤治療的有效率已成為迫在眉睫的問題。

MDSCs作為免疫抑制細(xì)胞，在抗腫瘤免疫中的作用日益被重視，許多針對(duì)其靶向治療的研究正在展開，明確MDSCs發(fā)揮功能的具體分子機(jī)制或途徑將極大提高治療的準(zhǔn)確性和效率，同時(shí)降低不良反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)35例NSCLC患者和29例正常對(duì)照外周血中HIF-1α+G-MDSC和HIF-1α+M-MDSC比例進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，NSCLC患者外周血中HIF-1α+G-MDSC和HIF-1α+M-MDSC比例均高于正常對(duì)照。其中，HIF-1α+G-MDSC比例與MDSCs表面CD33和CD124比例呈正相關(guān)，HIF-1α+M-MDSC比例與其表面CD33比例呈正相關(guān)。白介素-4受體(IR-4R)即CD124被認(rèn)為是MDSCs的功能性表面標(biāo)記物。研究[12-13]證明，IL-13/IL-4R通路從多方面調(diào)節(jié)M-MDSC功能；將外源性IL-13轉(zhuǎn)入健康人M-MDSC中可以促使MDSC活化為免疫抑制細(xì)胞，中和IL-4R 可以逆轉(zhuǎn)MDSC的免疫抑制功能。此外，本研究結(jié)果還顯示，臨床分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度低的患者外周血中HIF-1α+G-MDSC和HIF-1α+M-MDSC比例高于臨床分期Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度高者。另外，HIF-1α+MDSC比例高的NSCLC患者化療療效差，比例低者則化療療效好。

研究[14-15]表明，腫瘤患者M(jìn)DSCs表面HIF-1α比例顯著升高，在促進(jìn)腫瘤增長(zhǎng)過程中發(fā)揮重要作用。因此，惡性腫瘤患者體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境中HIF-1α+MDSC可能發(fā)揮重要抑制功能[16]。本研究結(jié)果顯示，HIF-1α+G-MDSC和HIF-1α+M-MDSC均可抑制CD8+T細(xì)胞分泌顆粒酶B和穿孔素的能力，即抑制CD8+T細(xì)胞的殺傷活性，其抑制作用呈一定的劑量依賴性；HIF-1α抑制劑可增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞分泌顆粒酶B和穿孔素的能力，即增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的殺傷活性。

綜上所述，在NSCLC患者中HIF-1α+MDSC比例高于正常對(duì)照組，其比例高低與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度有關(guān)，且比例高者療效更差。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HIF-1α+MDSC可降低CD8+T細(xì)胞的殺傷活性，造成免疫抑制，因此，HIF-1α+MDSC可作為評(píng)價(jià)預(yù)后的指標(biāo)及腫瘤治療的新靶點(diǎn)。