馮雙苗,楊賀佳,袁銀花,張化蓮

1)駐馬店市中心醫(yī)院產(chǎn)科 河南駐馬店 463000 2)鄭州大學第三附屬醫(yī)院產(chǎn)科 鄭州 450052

近來，子宮內膜癌(endometrial cancer)的發(fā)病率呈上升趨勢，發(fā)病年齡有所下降[1-3]。長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA，LncRNA)覆蓋了人類DNA的大部分非編碼信息，占整個基因組的90%以上，是由200多個核苷酸組成的廣泛而復雜的分子群，其無完整的開放閱讀框。LncRNA以多種方式參與癌癥的病理過程，在調控基因表達、轉錄和翻譯后處理方面的作用已經(jīng)在多種癌癥中得到證實[4-6]。癌易感性候選基因2(cancer susceptibility candidate 2，CASC2)是一種LncRNA，在部分癌癥中表現(xiàn)為表達水平異常降低，具有抑癌作用，包括子宮內膜癌[7-9]。生物信息學分析結果提示CASC2與miR-155-5p可能存在靶向關系。本研究旨在探討CASC2對子宮內膜癌細胞遷移、侵襲的調控機制。

1 材料與方法

1.1細胞、主要試劑和儀器人正常子宮內膜上皮細胞hEEC，人子宮內膜癌細胞HEC-1A、KLE、HHUA均購自ATCC，用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，胰蛋白酶購自Sellect公司，lipofectamine2000購自Invitrogen公司，反轉錄試劑盒購自大連TaKaRa公司，雙熒光素酶報告實驗試劑盒購自Promega公司，Matrigel基質膠購自BD公司，Transwell小室購自Corning公司。基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9多克隆抗體均購自武漢博士德生物技術有限公司，辣根過氧化物酶標記的二抗購自Santa Cruz公司，GAPDH小鼠單克隆抗體購自Abcam公司。pcDNA3.1購自Addgene公司。實驗中所涉及的質粒序列及引物的設計、合成均由上海吉瑪生物公司完成。

1.2 4種子宮內膜細胞中CASC2、miR-155-5p表達的檢測采用qRT-PCR法檢測。分別收集hEEC、HEC-1A、KLE、HHUA細胞，用RNA抽提試劑盒提取細胞總RNA，然后用反轉錄試劑盒快速合成cDNA。按PCR試劑盒說明書操作,進行PCR擴增，檢測CASC2、miR-155-5p。以U6作為內參，用2-ΔΔCt法計算CASC2、miR-155-5p的相對表達水平。CASC2上游引物序列5’-GCTGATCAGAGCACATT GGA-3’，下游5’-ATAAAGGTGGCCACAACTGC-3’。miR-155-5p上游引物序列5’-GGGGTTAATGCTA ATCGTGA-3’，下游5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’。U6上游引物序列5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’ ，下游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.3CASC2與miR-155-5p靶向關系的驗證利用在線靶基因預測工具TargetScan(http://www.targetscan.org/ )預測發(fā)現(xiàn)CASC2與miR-155-5p存在結合位點。利用雙熒光素酶報告實驗驗證兩者的靶向關系。含、不含結合位點的CASC2序列片段(CASC2-WT、CASC2-MUT)由上海吉瑪生物公司設計合成，將其克隆至熒光載體psiCHECK2，構建熒光素酶報告基因載體。采用lipofectamine2000將CASC2-WT或CASC2-MUT與miR-NC或miR-155-5p mimics共轉染入HEC-1A細胞中，24 h后按雙熒光素酶報告實驗試劑盒說明書操作，檢測螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶的熒光活性，以兩者的比值表示CASC2與miR-155-5p的結合力。

1.4過表達CASC2對HEC-1A細胞遷移能力及MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響

1.4.1 實驗分組 將對數(shù)生長期的HEC-1A細胞分為3組。未轉染組細胞常規(guī)培養(yǎng)，余2組細胞分別轉染空質粒pcDNA3.1和pcDNA3.1-CASC2。用lipofectamine2000試劑轉染。

1.4.2 細胞中CASC2表達的檢測 轉染48 h后，qRT-PCR法檢測細胞中CASC2的表達，方法同1.2。

1.4.3 細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達的檢測 采用Western blot法。轉染48 h后收集細胞，用蛋白裂解液充分裂解，提取總蛋白，定量后用沸水浴法進行變性處理。取變性蛋白上樣電泳，電泳結束后用轉膜儀將蛋白轉移到PVDF膜上，用脫脂奶粉封閉處理，將膜轉移到一抗溶液(MMP-2、MMP-9一抗稀釋度1∶1 500)中，于4 ℃冰箱中孵育過夜，轉膜至二抗溶液(稀釋度1∶1 000)中，室溫下孵育2 h。用ECL試劑盒顯影，曝光。用Image J分析，以目的條帶與內參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

1.4.4 細胞遷移、侵襲能力的檢測 采用Transwell小室實驗。用無基質膠的Transwell小室檢測細胞遷移能力。用有基質膠的Transwell小室檢測細胞侵襲能力：將Matrigel膠在4 ℃冰箱中過夜融化，然后按1∶3的比例與無血清培養(yǎng)基混勻，取30～50 μL平鋪于聚碳酸酯膜表面(以浸濕膜為準，不宜過多)，然后將小室于37 ℃放置30 min。收集細胞，調整細胞密度并接種至6孔板，每孔106個，常規(guī)培養(yǎng)至匯合度約70%，更換培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。次日，取200 μL加入小室的聚碳酸酯膜上，將600 μL含血清培養(yǎng)基加入下室，過夜培養(yǎng)。取出小室，用棉簽擦去附著在下室的細胞，用PBS洗滌3次，甲醇固定30 min，結晶紫染色20 min，PBS洗滌2次。于400倍鏡下觀察，選取3個視野拍照計數(shù)細胞數(shù)，取平均值。

1.5抑制miR-155-5p對HEC-1A細胞遷移、侵襲能力及MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響將對數(shù)生長期的HEC-1A細胞分為3組。未轉染組細胞常規(guī)培養(yǎng)，余2組細胞分別轉染anti-miR-NC和anti-miR-155-5p。48 h后，檢測細胞中miR-155-5p和MMP-2、MMP-9蛋白的表達，Transwell小室法檢測細胞的遷移和侵襲能力，方法同前。

1.6過表達miR-155-5p和CASC2對HEC-1A細胞遷移、侵襲能力及MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響將對數(shù)生長期的HEC-1A細胞分為3組，分別轉染pcDNA3.1、pcDNA3.1-CASC2+miR-NC、pcDNA3.1-CASC2+miR-155-5p。48 h后檢測細胞中CASC2、miR-155-5p和MMP-2、MMP-9蛋白的表達，Transwell小室法檢測細胞的遷移和侵襲能力，方法同前。

1.7統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)分析。多組細胞中CASC2、miR-155-5p表達，細胞遷移、侵襲能力及MMP-2、MMP-9蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，熒光素酶活性的比較采用兩獨立樣本的t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 4種子宮內膜細胞中CASC2、miR-155-5p的表達見表1。與hEEC細胞相比，HEC-1A、KLE、HHUA組胞中CASC2表達降低，miR-155-5p表達升高(P<0.05)。

表1 4種子宮內膜細胞中CASC2、miR-155-5p的表達

*:組間兩兩比較，P均<0.05

2.2CASC2與miR-155-5p靶向關系的驗證TargetScan預測結果顯示，miR-155-5p與CASC2之間存在10個互補的結合位點(圖1)。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，共轉染miR-155-5p和CASC2-WT的細胞熒光素酶活性較miR-NC和CASC2-WT共轉染細胞降低(表2)。

圖1 CASC2與miR-155-5p的靶向結合位點

表2 雙熒光素酶報告實驗結果

2.3過表達CASC2的HEC-1A細胞遷移、侵襲能力及MMP-2、MMP-9蛋白表達的變化結果見圖2和表3。與未轉染組和pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-CASC2組CASC2表達水平升高，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均降低，MMP-2、MMP-9蛋白表達亦降低(P<0.05)。

1：未轉染組:2：pcDNA3.1組；3：pcDNA3.1-CASC2組

表3 3組遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)，細胞中CASC2和 MMP-2、MMP-9蛋白表達水平的比較

*：與未轉染組和pcDNA3.1組比較，P<0.05

2.4抑制miR-155-5p后HEC-1A細胞遷移、侵襲能力及MMP-2、MMP-9蛋白表達的變化結果見圖3和表4。與未轉染組和anti-miR-NC組相比，anti-miR-155-5p組細胞中miR-155-5p表達降低，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均降低，MMP-2、MMP-9蛋白表達亦降低(P<0.05)。

2.5過表達miR-155-5p和CASC2后HEC-1A細胞遷移、侵襲能力及MMP-2、MMP-9蛋白表達的變化結果見圖4和表5。與pcDNA3.1-CASC2和pcDNA3.1-CASC2+miR-NC組相比，pcDNA3.1-CASC2+miR-155-5p組細胞中CASC2表達降低，miR-155-5p表達升高，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均升高，MMP-2、MMP-9蛋白表達水平亦升高(P<0.05)。

1：未轉染組；2：anti-miR-NC組；3：anti-miR-155-5p組

表4 3組遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)，細胞中miR-155-5p和 MMP-2、MMP-9蛋白表達水平的比較

*：與未轉染組和anti-miR-NC組比較，P<0.05

1：pcDNA3.1-CASC2組；2：pcDNA3.1-CASC2+miR-NC組；3：pcDNA3.1-CASC2+miR-155-5p組

圖4 3組細胞中MMP-2、MMP-9蛋白的表達

表5 3組細胞遷移、侵襲細胞數(shù)及細胞中CASC2、miR-155-5p和MMP-2、MMP-9蛋白表達的變化

*：與pcDNA3.1-CASC2組和pcDNA3.1-CASC2+miR-NC組比較，P<0.05

3 討論

癌組織中LncRNA與miRNA之間的關系多為LncRNA靶向調控下游的miRNA的表達[10-11]。miRNA通過抑制下游靶基因的轉錄或翻譯，或者受上游調控因子的作用，在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[12-13]，其中包括子宮內膜癌[14]。多項研究結果[7-9]表明LncRNA CASC2在子宮內膜癌組織中表達下調。我們應用生物信息學分析發(fā)現(xiàn)CASC2與miR-155-5p存在結合位點，經(jīng)雙熒光素酶報告實驗證實兩者存在靶向關系。已有研究[15-17]證實，子宮內膜癌患者血清和組織中miR-155表達均異常升高，且與癌癥的分期、腫瘤大小、轉移及預后相關。Banno等[18]通過分析子宮內膜癌組織差異miRNA表達譜發(fā)現(xiàn)，miR-155-5p為其中表達異常升高的miRNA之一。本實驗結果也顯示，子宮內膜癌細胞中CASC2表達下調，miR-155-5p表達上調。

細胞遷移和侵襲是腫瘤細胞的特征，體內腫瘤細胞的侵襲和遷移能力與細胞外基質(extracellular matrix，ECM)成分降解和上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)有關[19]。MMP-2、MMP-9是基質金屬蛋白酶家族的重要組成部分，它們可以水解ECM，可促使細胞轉移[20]。本研究結果顯示，過表達CASC2和抑制miR-155-5p均可下調子宮內膜癌細胞中MMP-2、MMP-9的表達，降低癌細胞的遷移和侵襲能力；而過表達miR-155-5p可逆轉CASC2對子宮內膜癌細胞遷移、侵襲的抑制作用。推測CASC2可能通過靶向負調節(jié)miR-155-5p的表達，參與調控子宮內膜癌細胞的遷移和侵襲。本研究為體外實驗，下一步將在動物體內進一步驗證上述結果。

綜上所述，CASC2可抑制子宮內膜癌細胞的遷移、侵襲能力，其機制與靶向負調節(jié)miR-155-5p表達有關，這為子宮內膜癌的診斷、治療提供了參考。