張志磊, 趙 冰, 劉 靈，王君敏, 李林玉, 梁 肖, 王瑩瑩, 王肖帆, 喬艷華

1)鄭州大學第三附屬醫(yī)院婦科 鄭州 450052 2)鄭州大學基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室 鄭州 450001 3)新鄉(xiāng)醫(yī)學院三全學院科研部 河南新鄉(xiāng) 453000

盆底器官脫垂(pelvic organ prolapse,POP)是絕經后子宮切除的重要原因，中老年女性發(fā)病率較高，給患者的心理和生理帶來了巨大的傷害[1-2]。研究[3]顯示，POP是具有特定遺傳傾向的個體在單個或多個獲得性因素的作用下導致的盆底支持組織退化、損傷而引發(fā)的一種退行性疾病。子宮旁韌帶群中膠原合成與分解的失衡、老化后的補充以及損傷后的修復障礙會破壞盆腔器官的支持結構[4]。經典Wnt信號通路的異?？捎绊懽訉m骶韌帶成纖維細胞增殖和功能[5]。陰道分娩、年齡、BMI和絕經狀態(tài)是普遍認同的POP影響因素[6-8]。但POP也可見于一些年輕未育女性，甚至是處女；絕大多數有過陰道分娩史甚至多產的婦女并不發(fā)生POP。POP的發(fā)病可能與基因水平的改變有關。本研究通過對POP患者子宮主韌帶中mRNA和lncRNA進行高通量基因測序，Gene Ontology(GO)富集、KEGG信號通路分析、蛋白互作網絡(protein-protein interaction，PPI)及mRNA-lncRNA共表達網絡分析，探索與POP發(fā)生發(fā)展有關的潛在生物標志物和信號通路。

1 對象與方法

1.1研究對象選擇2017年10月至2018年12月在鄭州大學第三附屬醫(yī)院接受陰式子宮切除手術的POP患者6例和同期因良性病變(子宮腺肌癥或子宮肌瘤)行子宮切除手術的非POP患者6例(對照組)。兩組患者滿足：年齡50～60歲，入院時已絕經，孕產次3～4次，且均為足月產，胎兒非巨大兒、無異常產褥病史，無高血壓和糖尿病史，無性激素類藥物應用史，術中無電刀等能量器械應用，且術后病理證實均不合并惡性病變。POP組患者POP-Q分級均Ⅲ度以上。對照組患者均不合并POP。本研究已獲得患者本人知情同意并經鄭州大學第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2標本處理術中在無菌操作下留取患者子宮主韌帶(宮旁1 cm處)新鮮組織，0.5～1.0 cm3切塊，兩組各取3例標本立即置液氮中保存以備高通量測序，另3例標本放入體積分數10%甲醛中固定以制備HE染色和Masson染色切片,以及進行qRT-PCR和Western blot。

1.3RNA的提取、測序、差異基因的篩選及富集分析由上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司完成。使用mirVana miRNA分離試劑盒進行RNA提取，在Illumina測序平臺(HiSeqTM2500)上進行測序，使用Express軟件進行轉錄本定量，采用Fold Change(FC)值來衡量差異基因表達量的差異倍數，利用R包在P≤0.05、|log2FC|≥2條件下，篩選差異基因并進行GO及KEGG富集分析。

1.4PPI分析STRING(https://string-db.org/cgi)是提供有關蛋白質之間相互作用綜合信息的數據庫，基于網站默認confidence≥0.4，對滿足|log2FC|≥5、容錯率(FDR)≤0.05的差異表達基因建立PPI。然后導入Cytoscape軟件可視化蛋白質間相互作用。

1.5mRNA-lncRNA共表達網絡分析對差異表達mRNA和lncRNA的表達量進行Pearson相關分析，用R包根據Pearson相關系數>0.8和P<0.05 的閾值產生節(jié)點(node)和關系線(edge)數據，最后采用Cytosacape軟件建立共表達網絡圖。

1.6采用qRT-PCR進行轉錄水平驗證使用Trizol試劑從主韌帶組織中提取總RNA，反轉錄合成cDNA，使用PCR試劑盒和實時PCR儀器進行qRT-PCR分析。反應體系:1 μL cDNA、5 μL 2×PCR Master Mix、0.2 μL上游引物、0.2 μL下游引物(引物序列見表1)和3.6 μL無核酸酶水。引物由上海生物醫(yī)學科技有限公司設計合成。反應條件： 95 ℃預變性10 min;94 °C變性10 min，58 ℃退火20 s， 72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)。以ACTB基因作為內參，采用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量。

1.7采用Western blot進行蛋白水平驗證使用裂解緩沖液從組織中提取總蛋白，用BCA試劑盒測

定蛋白濃度，然后用SDS-PAGE分離蛋白2 h，轉移到PVDF膜上，再用含50 g/L脫脂奶粉的TBST在37 ℃下浸泡封閉2 h。將兔抗人IL-6抗體(按1∶500稀釋)，兔抗人Nurr1抗體(按1∶500稀釋)和兔抗人β-actin抗體(按1∶1 000稀釋)添加到膜上，4 ℃孵育過夜。洗滌3次，加入山羊抗兔IgG二抗(按1∶1 000稀釋)37 ℃搖床孵育2 h，用ECL發(fā)光試劑盒檢測。以β-actin作為內參蛋白，采用Image J 1.8.0軟件分析。以目的蛋白與內參蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達水平。

表1 引物序列

1.8統(tǒng)計學處理采用Graphpad Prism 7分析數據及制作圖表，組間差異基因表達量的差異倍數用FC值表示。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1子宮主韌帶組織的形態(tài)學分析對照組子宮主韌帶組織中平滑肌束及膠原纖維束密集，排列整齊有序，且平滑肌細胞及成纖維細胞數量較多；而POP組子宮主韌帶組織中膠原纖維束和平滑肌束走向紊亂，且較纖細，多斷裂并伴玻璃樣變性(圖1)。

A和C：對照組；B和D：POP組

2.2差異表達mRNA和lncRNA的篩選得到差異表達的mRNA 794個(上調403個、下調391個)，lncRNA 1 106個(上調584個、下調522個)。差異基因表達水平聚類分析見圖2。

A：mRNA；B：lncRNA；紅色：表達量升高；藍色：表達量降低

2.3差異表達mRNA和lncRNA的富集分析

2.3.1 GO富集分析 GO富集分析結果顯示：差異表達的mRNA在1 863個GO條目中富集。從富集TOP30條目(圖3)可見，生物過程主要富集于核小體組裝(GO:0006334)和染色質組織(GO:0006325)等，分子功能主要富集蛋白質異二聚化活性(GO:0046982)和DNA聚合(GO:0003677)等，細胞成分主要定位于核小體(GO:0000786)和核染色質(GO:0000790)等。使用TopGO軟件對富集條目繪制有向無環(huán)圖，結果顯示這些差異基因的功能通路最終指向核小體及染色質的組裝，所涉及的基因有36個是組蛋白相關基因，其中有16個滿足FC>10，差異最顯著的是HIST1H3J(FC=18.47，P=0.003)。而差異表達的lncRNA則在881個GO條目中富集，在L-α-氨基酸跨膜轉運(GO:1902475)和中性氨基酸跨膜轉運蛋白活性(GO:0015175)這兩個條目富集最為顯著。

A：mRNA；B：lncRNA

2.3.2 KEGG富集分析 KEGG富集分析結果顯示：差異表達mRNA在77個KEGG通路中富集，在一級通路中主要富集于感染性、免疫性、內分泌和代謝疾病通路中。從TOP20富集通路(圖4)可見，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(has:05322)、Wnt信號通路(has:04310)和人T淋巴細胞病毒感染通路(has:05166)富集顯著。其中在Wnt通路中，主要富集于Wnt/β-Catenin通路。差異lncRNA則在51個KEGG通路中富集，主要涉及信號轉導、感染性疾病、免疫系統(tǒng)疾病等通路，這一分布和mRNA的富集情況一致。

A：mRNA的TOP20氣泡圖；B：lncRNA的富集通路分類圖

2.4PPI分析繪制的PPI包括152個節(jié)點和2 475個相互作用(圖5)。整個網絡由3個功能模塊組成：A模塊主要和轉錄調控基因有關，B模塊主要和組蛋白基因有關，C模塊主要和細胞周期調節(jié)基因有關。其中有數十個基因節(jié)點的連接度很高，連接度TOP10的核心基因見表2，連接最廣泛的是IL-6。

A:轉錄調控基因；B：組蛋白基因；C：細胞周期調節(jié)基因；節(jié)點大小和連接度有關；紅色表示上調基因，綠色表示下調基因，黃色描邊標記的節(jié)點是TOP10核心差異基因

圖5PPI 分析圖

表2 連接度TOP10核心基因

2.5mRNA-lncRNA共表達網絡分析從共表達關系網絡(圖6)中發(fā)現lnc-ZNF727-12∶2與PPI網絡中核心基因IL-6和下調顯著的NR4A2均有共表達關系。

2.6部分差異基因的qRT-PCR和Western blot驗證選取8個差異表達的mRNA通過qRT-PCR進一步驗證，其中上調和下調的基因均為4個，所有被選的mRNA均與轉錄組測序表達量具有相同的表達趨勢。由于IL-6是連接度最高的核心基因，且是下調幅度最為明顯的基因，而NR4A2是Wnt通路中的核受體基因并同樣差異表達顯著，且和IL-6均與lnc-ZNF727-12∶2有共表達關系，故對IL-6和NR4A2進行Western blot驗證，結果顯示POP患者中這兩個蛋白的表達水平均較對照組明顯降低，與基因測序結果一致。

箭頭節(jié)點表示lncRNA，圓形節(jié)點表示mRNA，紅色字體表示表達上調，藍色字體表示表達下調，黑色字體表示無統(tǒng)計學意義

3 討論

子宮主韌帶組織結構和功能的破壞是影響POP發(fā)生發(fā)展的重要因素[9]。本研究通過對子宮主韌帶組織轉錄組高通量測序，共篩選出794個差異表達顯著的mRNA和1 106個lncRNA，通過生物信息學分析發(fā)現它們的功能主要集中于組蛋白和核小體的裝配、細胞的生成與死亡等方面，并通過Wnt/β-cantenin途徑、細胞周期途徑、組蛋白及轉錄調控途徑，進一步影響韌帶中成纖維細胞增殖與死亡的平衡以及膠原的代謝。

3.1Wnt/β-cantenin信號通路和細胞周期通路通過對差異基因的KEGG通路分析，作者發(fā)現有12個差異表達的基因在Wnt/β-cantenin途徑富集，如FZD5、AXIN2、SOX17、MYC、JUN、FOSL1、CCND1、MMP7等。Wnt/β-Catenin信號通路可傳導生長刺激信號，參與不同的發(fā)育機制，如影響細胞分化以及決定細胞的增殖等[10]。研究發(fā)現，膜受體FZD5可抑制下游胞質中AXIN2表達[11]，而SOX17通過與AXIN2結合形成共調節(jié)因子[12]，在轉錄水平反向抑制Wnt/β-cantenin通路中下游核心差異基因MYC的表達[13]，進而導致核內靶基因FOSL1、MMP7等多個重要轉錄因子的表達抑制。MMP家族主要負責膠原纖維的代謝[14]，FOSL1可與JUN蛋白二聚化形成轉錄因子復合物AP-1，而AP-1已顯示是多種MMP的主要轉錄調節(jié)劑[14]。上述改變會進一步抑制細胞周期通路中細胞周期調節(jié)蛋白RGCC的表達。KEGG通路富集分析發(fā)現有17個差異表達的mRNA富集于細胞周期通路：如CDK1、CDKN1A、PLK1、CDC20、CDC45、TTK、CCNA2、CCNB2等。下調的RGCC在體內會關聯并激活細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)，進而影響G2/M轉變[15]。PLK1是真核細胞周期中的關鍵參與者，介導真核生物的磷酸化調節(jié)，如G2/M轉換、有絲分裂和胞質分裂等細胞周期進程[16-17]。本研究發(fā)現POP患者子宮主韌帶組織中PLK1明顯上調，提示G2/M轉換異常。另外，表達顯著下調的核心基因MYC是細胞周期特異性關鍵酶CDK-1的正調節(jié)劑，影響成纖維細胞的增殖活性及膠原的生物合成過程。POP患者宮旁韌帶成纖維細胞中經典Wnt/β-Catenin信號傳導通路受到抑制，可進一步級聯影響細胞周期通路，進而降低成纖維細胞的增殖及合成膠原蛋白的能力[5]。

3.2組蛋白相關基因對轉錄調控的影響組蛋白基因表達上調是進入細胞周期階段的標志之一[18-19]。本研究中有大量組蛋白家族mRNA表達明顯上調。越來越多的實驗[20]證實組蛋白N′端的堿基容易在翻譯后被不同的基團修飾，從而具備調控基因表達的功能，H3組蛋白的磷酸化修飾在G2晚期出現，M期開始增加，H2A和H2B組蛋白的泛素化在M期開始減少。本研究分析了目前36個差異表達的組蛋白相關基因的改變，亦提示細胞周期G2/M轉化異常。結合差異基因表達PPI分析圖，組蛋白相關基因和細胞周期調控基因的異常表達可能共同引起子宮主韌帶中成纖維細胞周期阻滯，進而影響韌帶損傷后的自我修復和正常衰老細胞的補充。綜上，作者推測組蛋白基因的高表達和細胞周期紊亂是促成POP發(fā)病的重要原因。

3.3IL-6與PPI和mRNA-lncRNA共表達網絡本研究結果顯示共表達網絡中ZNF727-12∶2與IL-6和NR4A2有共表達關系，IL-6位于PPI的核心。IL-6是重要的多功能細胞因子，廣泛參與炎癥、免疫、細胞增殖與活化等生理病理過程[21]。結合KEGG富集分析結果顯示，在人體器官系統(tǒng)通路類別中差異基因富集度最高的是免疫系統(tǒng)，作者考慮POP患者IL-6轉錄水平的抑制可能與局部微環(huán)境的免疫力降低有關。另外，結合對差異基因的GO富集分析提示，IL-6也參與膠原合成的調節(jié)和膠原代謝調節(jié)，IL-6表達水平的降低可影響局部組織的膠原合成代謝。NR4A2是核受體家族中重要一員，可被多種細胞外刺激因素激活而廣泛參與調控生物的代謝、免疫以及細胞的生長、分化、凋亡等重要生理病理過程，其功能同時也受到磷酸化、蛋白質相互作用等多種途徑的調控[22]。有研究[23]提示NR4A家族與Wnt/β-Catenin信號通路之間有明確的相互作用，如NR4A2可以抑制β-catenin介導的Axin2的表達。作者在PPI分析圖中發(fā)現該家族中三種受體均在轉錄調控網絡中發(fā)揮廣泛作用。綜上，作者推測在某些易感因素的刺激下(如分娩、感染等)，ZNF727-12∶2調控序列被激活，他們可能參與抑制了包括IL-6與NR4A2等核心基因的表達，進而影響轉錄因子和組蛋白的調控網絡以及Wnt/β-catenin信號通路，導致主韌帶中成纖維細胞的增殖及補充障礙[5]。

總之，POP的發(fā)生發(fā)展與多基因的改變有關，包括轉錄調節(jié)因子(如IL-6、MYC、ATF3等)、Wnt/β-cantenin通路相關基因(如FZD5、AXIN2、MMP7等)、細胞周期調節(jié)基因(如CDK1、CCNB1等)以及組蛋白調控相關基因(如CENPA、ASF1B等)，這些基因在PPI中相互作用，尤其是位于網絡核心的IL-6及與其共表達的ZNF727-12∶2在整個差異表達譜中的作用不可忽視。但是，由于術中電刀、超聲刀等能量器械的廣泛應用會對樣本造成破壞，導致臨床中完全符合高通量測序要求的標本較少，今后的實驗中我們將加大樣本量進一步驗證，也期待后續(xù)研究通過大樣本量的生物信息挖掘得到整合結論，促進在基因層面對POP的認識。

致謝：真誠感謝上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司工作人員的技術支持及課題組其他成員的熱心幫助。