汲 翔，郭 勛，范丹丹，康巧珍，袁維堂

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肛腸外科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001 3)鄭州大學(xué)河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院腫瘤研究所 鄭州 450052

T細(xì)胞可誘導(dǎo)共刺激分子(inducible co-stimulator, ICOS)及其配體(ICOS ligand, ICOSL)是近年來發(fā)現(xiàn)的B7/CD28家族成員[1]。ICOSL又名B7h、B7-H2，最早在研究鼠cDNA文庫時(shí)分離獲得，在正常生理狀態(tài)下低水平表達(dá)于B細(xì)胞表面，通過與T細(xì)胞的ICOS相互作用，構(gòu)成ICOS/ICOSL信號(hào)通路，主要調(diào)控T細(xì)胞的活化、Th1/Th2細(xì)胞亞群分化等[2-3]。ICOSL在炎癥性疾病、腫瘤和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用[4-5]。有研究[6]表明ICOSL在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸密切相關(guān)。還有報(bào)道[7-8]表明，使用單克隆抗體阻斷ICOS/ICOSL信號(hào)通路會(huì)下調(diào)T細(xì)胞表面活化標(biāo)志物CD69和CD25表達(dá)，減少IL-4和IFN-γ細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制小鼠紅斑狼瘡疾病模型的發(fā)展。但該信號(hào)通路在抗腫瘤免疫和自身免疫疾病中的分子機(jī)制還有待深入研究?？寺COSL胞外段(ICOSL-N)基因并獲得重組融合蛋白不僅為研究ICOS/ICOSL信號(hào)通路在T細(xì)胞活化調(diào)控中的功能機(jī)制提供分子模型，還將為腫瘤免疫治療提供新思路。本研究利用生物信息學(xué)軟件設(shè)計(jì)ICOSL-N和IgG4基因引物，采用RT-PCR法從小鼠脾臟中克隆目的基因ICOSL-N，通過基因工程技術(shù)構(gòu)建原核重組質(zhì)粒pET22b-ICOSL-N-Ig，獲得ICOSL-N-Ig重組蛋白，為ICOS/ICOSL信號(hào)通路機(jī)制研究及免疫調(diào)節(jié)藥物研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料大腸桿菌DH5α、感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ、RNAiso Plus試劑盒購自大連寶生物公司，Pfu Master Mix試劑購自北京康為世紀(jì)生物公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國(guó)賽默飛世爾科技公司，質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購自美國(guó)Genview 公司，DNA產(chǎn)物純化試劑盒購自北京索萊寶生物有限公司，pET22b(+)載體購自大連寶生物公司，人源IgG4重鏈Fc基因模板為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2引物設(shè)計(jì)與合成搜索NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫和UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫，查詢小鼠ICOSL和人源IgG4編碼基因序列，采用Primer 5軟件設(shè)計(jì)ICOSL-N和IgG4基因PCR上下游引物序列。利用重疊延伸PCR設(shè)計(jì)原理和選取的酶切位點(diǎn)，在ICOSL-N的上游引物插入NdeⅠ酶切位點(diǎn)，IgG4基因下游引物插入XhoⅠ酶切位點(diǎn)，同時(shí)分別在ICOSL-N下游引物和IgG4上游引物插入柔性鏈接子(GGGS)3。ICOSL-N上游引物：5’-CCGCATATGCTCATCATTGGCTTTGGC-3’；下游引物：5’-AGAACCGCCACCGCCGGAGCCACCGCCACCAGATCCGCCACCGCCCTCATTATTGTGGGTTTCCT-3’。IgG4上游引物：5’-GGCGGTGGCGGATCTGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGCGGTTCTGCTGAATCTAAGTACGGTCCA-3’，下游引物：5’-GGGCCCTCGAGACCAAGACTTAATGAAAG-3’。劃線部分為酶切位點(diǎn)，加粗部分為柔性鏈接子(GGGS)3序列。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3PCR模板制備選取8周齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠(購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，頸椎脫臼法處死小鼠，無菌條件下取小鼠脾臟組織50 mg，按照RNAiso Plus試劑盒說明書操作，提取總RNA，定量取1 μg 總RNA，反轉(zhuǎn)錄(42 ℃60 min，70 ℃5 min)獲得模板cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4ICOSL-N和人源IgG4基因克隆以保存的C57BL/6小鼠脾臟cDNA和人源IgG4基因?yàn)槟０澹捎肐COSL-N和IgG4上下游引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃5 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃1 min，29個(gè)循環(huán)；72 ℃6 min。收集PCR產(chǎn)物，利用DNA 產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，4 ℃保存。

1.5ICOSL-N-Ig融合基因的制備采用PCR重疊延伸技術(shù)，即在ICOSL-N下游引物和IgG4上游引物擴(kuò)增過程中，重疊鏈(GGGS)3延伸，目的基因ICOSL-N和IgG4 連接后得到融合基因ICOSL-N-Ig片段。分別取2 μL ICOSL-N和2 μL IgG4的PCR純化產(chǎn)物，加入ICOSL-N上游引物2 μL、IgG4下游引物2 μL、Pfu Master Mix 25 μL、ddH2O 17 μL后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃5 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃1 min，29個(gè)循環(huán)；72 ℃6 min。取5 μL PCR產(chǎn)物，經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電壓120 V，時(shí)間30 min，凝膠圖像分析儀觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6pET22b-ICOSL-N-Ig原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建按照質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取pET22b(+)空質(zhì)粒，融合基因片段與pET22b(+)質(zhì)粒用NdeⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，37 ℃反應(yīng)3 h?；厥针p酶切產(chǎn)物，T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接。常規(guī)轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆進(jìn)行雙酶切與測(cè)序鑒定。

1.7融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定將測(cè)序正確的陽性重組質(zhì)粒pET22b-ICOSL-N-Ig轉(zhuǎn)化至原核表達(dá)菌株BL21(DE3)，接種環(huán)挑取單菌落至含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基內(nèi)，200 r/min、37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)。次日以體積比1∶100轉(zhuǎn)接于新鮮的LB培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃培養(yǎng)。利用分光光度計(jì)檢測(cè)600 nm處的光密度(OD)值，當(dāng)OD值達(dá)到0.6(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)時(shí)，加入誘導(dǎo)劑0.4 mmol/L IPTG 37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，收集菌液，9 000 r/min離心5 min，收集菌體沉淀物，-20 ℃保存。用可溶性平衡緩沖液(300 mmol/L NaCl、50 mmol/L NaH2PO4、10 mmol/L咪唑、10 mmol/L Tirs，pH 8.0)重懸菌體后超聲破碎，然后離心收集沉淀和上清。以BL21(DE3)和pET22b 空質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。SDS上樣緩沖液處理樣品，120 g/L SDS-PAGE電泳分析融合蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1ICOSL-N基因的克隆及與IgG4基因的體外融合PCR分別擴(kuò)增出ICOSL-N與IgG4基因序列后，利用PCR重疊延伸技術(shù)擴(kuò)增，得到符合理論值1 425 bp的基因條帶(圖1)，表明成功制備融合基因ICOSL-N-Ig。

M：DNA Marker；1：ICOSL-N-Ig；2：ICOSL-N；3：IgG4

2.2pET22b-ICOSL-N-Ig原核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定陽性克隆雙酶切鑒定結(jié)果(圖2)顯示，目的基因條帶符合理論預(yù)期大小(1 425 bp)，與ICOSL-N-Ig片段大小一致，表明成功構(gòu)建了pET22b-ICOSL-N-Ig原核表達(dá)質(zhì)粒。

M：DNA Marker；1：pET22b-ICOSL-N-Ig雙酶切結(jié)果

2.3pET22b-ICOSL-N-Ig測(cè)序結(jié)果將雙酶切鑒定符合預(yù)期的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中小鼠ICOSL-N基因序列進(jìn)行在線比對(duì)，結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中ICOSL-N及IgG4基因一致，證實(shí)成功構(gòu)建了ICOSL-N-Ig基因融合表達(dá)的重組質(zhì)粒。

2.4融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE結(jié)果(圖3)顯示，ICOSL-N-Ig以包涵體形式存在于菌體中，在53 800處可見明顯的條帶，且與目標(biāo)蛋白的大小基本一致，表明融合蛋白ICOSL-N-Ig成功誘導(dǎo)表達(dá)。

M：蛋白Marker；1：BL21(DE3)菌體沉淀物；2：BL21(DE3)菌體上清

圖3重組蛋白SDS-PAGE電泳圖譜

3 討論

T細(xì)胞是獲得性免疫應(yīng)答的主要識(shí)別和效應(yīng)細(xì)胞，其活化調(diào)控與機(jī)體抗感染、抗腫瘤及自身免疫疾病的發(fā)生密切相關(guān)。T細(xì)胞活化受兩種信號(hào)調(diào)控：第一信號(hào)是由T細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR)與抗原肽-MHC復(fù)合物相互作用啟動(dòng)；第二信號(hào)是ICOS與ICOSL結(jié)合形成的輔助信號(hào)。ICOS是表達(dá)于T細(xì)胞表面的一類跨膜糖蛋白，其與ICOSL結(jié)合不僅能增強(qiáng)T細(xì)胞與抗原遞呈細(xì)胞的連接，促進(jìn)TCR與抗原肽-MHC復(fù)合物的結(jié)合，還能向T細(xì)胞傳遞完全活化所必需的輔助信號(hào)，參與T細(xì)胞增殖、分化及免疫功能的調(diào)控[1]。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞ICOS/ICOSL有很多種，包括CD28/B7、CD40/CD145、Fas/FasL、OX40/OX40L、4-1BB/4-1BBL[9-11]等。B7家族ICOS是由結(jié)構(gòu)相關(guān)的細(xì)胞表面蛋白組成，通過與其受體相結(jié)合提供共刺激或共抑制信號(hào)來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[2]。本研究通過查詢GenBank數(shù)據(jù)庫和UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫得到了T細(xì)胞ICOSL-N基因序列，利用基因工程技術(shù)將鼠源ICOSL-N基因與人源IgG4重鏈Fc恒定區(qū)蛋白進(jìn)行融合，成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET22b-ICOSL-N-Ig。IgG4的引入為利用融合蛋白ICOSL-N-Ig開展免疫調(diào)節(jié)功能與機(jī)制的體內(nèi)外研究奠定了基礎(chǔ)。

本研究選用經(jīng)典的大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)獲得目的基因融合蛋白。原核表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉且易用于產(chǎn)業(yè)化推廣等優(yōu)點(diǎn)，但在蛋白誘導(dǎo)表達(dá)過程中易出現(xiàn)包涵體。包涵體的形成受多因素影響，本實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)表達(dá)的ICOSL-N-Ig融合蛋白就是以包涵體形式存在，后續(xù)將會(huì)繼續(xù)開展融合蛋白表達(dá)體系的優(yōu)化及蛋白純化工藝研究。