米一，王立華，李欣，王皓，張晨亮，馬靜，苗麗，劉擁軍，劉廣洋

·論著·

SPD-TRAIL基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞及其殺傷肺腺癌細(xì)胞的研究

米一，王立華，李欣，王皓，張晨亮，馬靜，苗麗，劉擁軍，劉廣洋

100176 北京貝來生物科技有限公司（米一、李欣、王皓、張晨亮、馬靜、苗麗、劉擁軍、劉廣洋）；100176 北京市亦創(chuàng)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)研究院干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究所（米一、李欣、王皓、張晨亮、馬靜、苗麗、劉擁軍、劉廣洋）；053600 石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液科（王立華）

通過基因工程手段構(gòu)建了可高表達(dá)十二聚體 TRAIL的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC），以期為臨床應(yīng)用以 MSC為載體的腫瘤靶向治療提供新的實(shí)驗(yàn)方法。

通過基因工程手段改造 TRAIL 基因序列，在其 N-末端增加肺表面活性蛋白-D（SPD）結(jié)構(gòu)域，使其形成穩(wěn)定構(gòu)象的十二聚體 TRAIL 蛋白，采用慢病毒載體基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞，得到可高表達(dá) TRAIL 蛋白的 SPD-TRAIL-MSC 種子細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上對基因修飾細(xì)胞進(jìn)行功能學(xué)檢測。

基因修飾后 MSC 流式表型、分化能力均未有顯著變化；SPD-TRAIL-MSC 及 TRAIL-MSC（對照組細(xì)胞）均可高表達(dá) TRAIL 蛋白，而 SPD-TRAIL-MSC 表達(dá)的 TRAIL 蛋白顯著高于對照組細(xì)胞（< 0.001）；通過腫瘤殺傷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SPD-TRAIL-MSC 對肺癌細(xì)胞系 A549 具有更顯著的增殖抑制（< 0.01）及促凋亡作用。

SPD-TRAIL 基因修飾的 MSC 可穩(wěn)定高表達(dá) TRAIL 蛋白，并對肺癌細(xì)胞系具有顯著殺傷作用，為肺癌治療提供了新的思路。

間充質(zhì)干細(xì)胞； 肺腺癌； SPD-TRAIL； 基因修飾； 凋亡

惡性腫瘤作為一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病，其發(fā)病率和致死率逐年升高，肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，非小細(xì)胞肺癌約占肺癌的 80%[1]，而肺腺癌又是最常見的組織學(xué)類型，約占全部肺癌患者的 1/2[2]，其惡性程度高，大部分患者確診時分期較晚，因此治療原則上仍以全身化療為主[3]，大部分患者因不能耐受化療的毒副作用而無法完成正常的化療療程，對于腫瘤控制及預(yù)后恢復(fù)極其不利[4]。干細(xì)胞作為向腫瘤轉(zhuǎn)移的基因載體已被廣泛研究。研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在炎性因子和趨化因子的作用下具有專門跟蹤和遷移到體內(nèi)腫瘤部位的特性，將間充質(zhì)干細(xì)胞作為抗癌藥物的靶向載體，攜帶外源性抑癌因子作用于腫瘤，是目前較為有效的新的治療手段。

腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）可通過激活腫瘤細(xì)胞表面促凋亡死亡受體（DRs）4 和 5，誘導(dǎo) Caspase-8 依賴性凋亡。TRAIL 可以選擇性靶向腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡，且對多數(shù)正常細(xì)胞表現(xiàn)無毒或低毒，具有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷選擇性，是極具潛力的新型抗腫瘤藥物。研究證實(shí)，TRAIL 基因修飾的 MSC 注射至肺部轉(zhuǎn)移癌動物模型體內(nèi)后，TRAIL-MSC 細(xì)胞可以遷移至腫瘤組織中，并穩(wěn)定持續(xù)釋放 TRAIL，從而抑制肺部腫瘤細(xì)胞生長，促進(jìn)腫瘤凋亡[5]。研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL 蛋白單體分子具有高度的寡聚化傾向，天然狀態(tài)下可形成分子量為 66 kD 的三聚體；而在 TRAIL 蛋白 N 末端增加肺表面活性蛋白-D（SPD）結(jié)構(gòu)域，可使其形成穩(wěn)定構(gòu)象的十二聚體。十二聚體 TRAIL（dTRAIL）在腫瘤殺傷、穩(wěn)定性方面明顯優(yōu)于 TRAIL 其他高級結(jié)構(gòu)[6]。

本研究通過基因工程手段在體外構(gòu)建了 TRAIL 和 SPD-TRAIL 基因，通過病毒載體轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞，使間充質(zhì)干細(xì)胞分別高表達(dá)可溶性 TRAIL 及十二聚體 TRAIL，在此基礎(chǔ)上驗(yàn)證其對肺腺癌細(xì)胞系的殺傷作用，以期為臨床應(yīng)用以 MSCs 為載體的腫瘤靶向治療提供新的實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺癌細(xì)胞 A549 購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；DMEM 高糖培養(yǎng)液、DMEM/F-12 培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶及成骨、成脂分化培養(yǎng)液等均購于美國 Thermo Fisher 公司；第四代慢病毒載體系統(tǒng)購自美國 Origene 公司；TRAIL 蛋白ELISA 檢測試劑盒購于美國 R&D System 公司；CCK8 試劑盒及 Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒購于日本東仁化學(xué)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞獲取及檢測 人臍帶組織來源于合作婦產(chǎn)科醫(yī)院剖腹產(chǎn)出生的健康胎兒。選擇健康供者臍帶組織，將臍帶組織剪至直徑為1 ~ 1.5 mm 的小段，采用貼壁培養(yǎng)法獲取原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UC-MSCs）。待細(xì)胞融合度為 80% 后，對細(xì)胞進(jìn)行蛋白酶消化和計(jì)數(shù)，并將細(xì)胞按1 × 104/cm2接種至新的培養(yǎng)瓶。按同樣方法將細(xì)胞擴(kuò)增至 P2代，凍存。

1.2.2 SPD-TRAIL 質(zhì)粒構(gòu)建及病毒轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞 按照文獻(xiàn)[6]所述方法，設(shè)計(jì)并合成了 SPD-TRAIL基因質(zhì)粒，利用第四代慢病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建 LV-SPD-TRAIL 慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，并以 LV-TRAIL作為對照病毒。

將 LV-SPD-TRAIL 質(zhì)粒以及 LV-TRAIL 慢病毒表達(dá)質(zhì)粒分別與慢病毒框架質(zhì)?；旌?，通過 LTX 脂質(zhì)體導(dǎo)入 293T 細(xì)胞，包裝得到成熟慢病毒，收獲病毒。將收獲的病毒轉(zhuǎn)染至臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，24 h 后加入嘌呤霉素篩選加壓，待加壓結(jié)束后換新鮮完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至 80% 密度后傳代擴(kuò)增。

1.2.3 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)功能檢測 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞收獲后，以正常臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UC-MSC）作為對照，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面抗原（CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD11b、CD19 及 HLA-DR 等）。

將上述各組細(xì)胞接種至 96 孔板中，分別培養(yǎng) 0、24、48、72 及 96 h，采用 CCK8 試劑盒檢測各組細(xì)胞增殖情況，各組細(xì)胞 6 個復(fù)孔。

將上述各組細(xì)胞接種至 24 孔板中，各組細(xì)胞待細(xì)胞密度達(dá)到 80% 融合度時分別加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液及成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)，2 ~ 3 d 換一次誘導(dǎo)培養(yǎng)液。誘導(dǎo)培養(yǎng) 3 ~ 4 周后，成脂誘導(dǎo)的細(xì)胞采用油紅-O 進(jìn)行染色，成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞采用茜素紅-S 進(jìn)行染色。

1.2.4 ELISA 檢測基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)TRAIL 采用 TRAIL 蛋白 ELISA 檢測試劑盒檢測 UC-MSC、SPD-TRAIL-MSC 及 TRAIL-MSC 的細(xì)胞上清液中 TRAIL 的含量，具體方法參照說明書。

1.2.5 基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞對非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞的增殖抑制 SPD-TRAIL-MSC 及 TRAIL-MSC 培養(yǎng)上清液備用，將非小細(xì)胞肺癌 A549 細(xì)胞按照 5000/孔接種至 96 孔板，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 12 h 后小心吸棄培養(yǎng)液。將培養(yǎng)液及稀釋后的條件培養(yǎng)上清液加入 A549 細(xì)胞中，分組如下：200 μl完全培養(yǎng)液、200 μl UC-MSC 上清液、200 μl TRAIL-MSC 上清液、200 μl SPD-TRAIL-MSC 上清液，各培養(yǎng) 24、48、72 及 96 h，分別采用 CCK8 試劑盒檢測腫瘤細(xì)胞增殖情況，各組細(xì)胞 6 個復(fù)孔。

1.2.6 基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞對非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞的凋亡情況 將 A549 細(xì)胞分為 4 組，分別按 2 × 105/孔接種至 6 孔板，置于 37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 12 h 后小心吸棄培養(yǎng)液。培養(yǎng)過程中 4 組細(xì)胞分別加入 2 ml 完全培養(yǎng)液、2 ml UC-MSC 上清液、2 ml TRAIL-MSC 上清液及 2 ml SPD-TRAIL-MSC 上清液，各培養(yǎng) 48 h 和 72 h，采用無 EDTA 胰酶消化、收集細(xì)胞，并采用 Annexin V-FITC/PI 流式細(xì)胞法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡情況，各組細(xì)胞重復(fù) 3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 LV-TRAIL 病毒轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞

體外構(gòu)建 LV-SPD-TRAIL、LV-TRAIL 等慢病毒表達(dá)載體，并分別轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞，采用嘌呤霉素篩選、加壓后獲得 SPD-TRAIL-MSC及 TRAIL-MSC。圖 1 為 LV-SPD-TRAIL 和 LV-TRAIL 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。其中 LV-SPD-TRAIL 結(jié)構(gòu)為 tPA 作為啟動子連接 SPD 序列，其后連接 hTRAIL 編碼區(qū)；而 LV-TRAIL 結(jié)構(gòu)為 tPA 作為啟動子其后直接連接 hTRAIL 編碼區(qū)。

2.2 基因修飾 MSC 生物學(xué)功能檢測

采用流式細(xì)胞法檢測 UC-MSC 及基因修飾后 MSC，結(jié)果如表 1 所示，各組細(xì)胞均符合 MSC 表型：CD19、CD34、CD11b、CD45 和 HLA-DR 均為陰性（陽性率 < 2%）；CD73、CD90、CD105 均為陽性（陽性率 > 95%）。

采用成骨及成脂分化培養(yǎng)液對各組細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)，結(jié)果（圖 2）發(fā)現(xiàn)，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 4 周后，各組細(xì)胞經(jīng)茜素紅-S 進(jìn)行染色均為陽性；而成脂誘導(dǎo) 3 周后，各組細(xì)胞經(jīng)油紅-O 染色均為陽性。

圖 1 TRAIL 及 SPD-TRAIL 慢病毒載體質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖

Figure 1 Lentiviral vector plasmids structure of TRAIL and SPD-TRAIL

表 1 各組 MSC 流式細(xì)胞表型結(jié)果統(tǒng)計(jì)（%，）

圖 2 基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞成骨成脂分化結(jié)果（A：茜素紅 S 染色，所示各組細(xì)胞均具有成骨分化結(jié)果；B：油紅-O 染色結(jié)果，所示各組細(xì)胞均具有成脂分化結(jié)果）

Figure 2 Osteogenic and adipogenic differentiation results of MSCs from each group (A: Alizarin Red staining means osteogenic differentaiton result; B: Oil-O staining means adipogenic differentiation result)

采用 CCK8 檢測各組 MSC 細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果（圖 3）發(fā)現(xiàn)，各組 MSC 之間的增殖能力無顯著差異（> 0.05）。

2.3 TRAIL 表達(dá)水平檢測

采用 TRAIL ELISA 檢測試劑盒檢測 SPD-TRAIL-MSC 及 TRAIL-MSC 上清液中TRAIL 的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兩種基因修飾 MSC 均可以高表達(dá) TRAIL 蛋白，SPD-TRAIL-MSC 表達(dá)量顯著高于 TRAIL-MSC（< 0.001）（圖 4）。

2.4 TRAIL-MSC 對 A549 的增殖抑制作用

采用基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系 A549 進(jìn)行培養(yǎng)，通過 CCK8 檢測細(xì)胞增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SPD-TRAIL 及 TRAIL 基因修飾后間充質(zhì)干細(xì)胞均顯著抑制 A549 細(xì)胞增殖水平，而與 TRAIL-MSC 相比，SPD-TRAIL 基因修飾 MSC 對 A549 抑制效果更加顯著（圖 5）。

圖 3 CCK8 檢測各組細(xì)胞增殖（n = 6，*P > 0.05）

Figure 3 Cell proliferation of MSC with CCK8 assay (n = 6,*> 0.05)

圖 4 ELISA 檢測基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá) TRAIL（pg/106細(xì)胞）[SPD-TRAIL-MSC 與 TRAIL-MSC 比較

（n = 6），***< 0.001]

Figure 4 TRAIL expression from each MSC group with ELISA assay (pg/106cell) [SPD-TRAIL-MSC vs TRAIL-MSC (n = 6),***< 0.001]

圖 5 基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞對非小細(xì)胞肺癌 A549 細(xì)胞的抑制[SPD-TRAIL-MSC 與 TRAIL-MSC比較（n = 6），**P < 0.01]

Figure 5 TRAIL engineered MSC can inhibit the proliferation of A549 cells [SPD-TRAIL-MSC vs TRAIL-MSC (n = 6),**< 0.01]

2.5 TRAIL-MSC 對 A549 的殺傷作用

采用基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系 A549 進(jìn)行培養(yǎng)，通過 Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒檢測 A549 凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因修飾后間充質(zhì)干細(xì)胞可顯著促進(jìn) A549細(xì)胞凋亡，而與對照組相比（TRAIL 基因修飾 MSC），SPD-TRAIL 基因修飾 MSC 對 A549 殺傷效果更加顯著（表 2 及圖 6）。

3 討論

TRAIL 在不影響正常細(xì)胞的情況下導(dǎo)致腫瘤凋亡和死亡的能力使其成為一種非常令人興奮的腫瘤治療分子。TRAIL 蛋白的構(gòu)型穩(wěn)定性及聚集形式與其腫瘤殺傷活性、受體親和性以及穩(wěn)定性等有著密切的關(guān)系，當(dāng) TRAIL 在空間上形成十二聚體結(jié)構(gòu)時，其抗腫瘤活性最佳而穩(wěn)定性最高。研究發(fā)現(xiàn)，肺表面活性蛋白-D（surfactant protein-D，SPD）在分子結(jié)構(gòu)上通過二硫鍵共價(jià)結(jié)合可形成三螺旋平行盤繞線圈結(jié)構(gòu)域，從而幫助蛋白質(zhì)折疊成十二聚體。本研究證明了 SPD-TRAIL 基因修飾的 MSC 及 TRAIL-MSC 均可以高表達(dá) TRAIL 蛋白，SPD-TRAIL-MSC 表達(dá)量顯著高于 TRAIL-MSC，對 A549 細(xì)胞抑制效果和促凋亡作用更加顯著。

表 2 各組 MSC 對非小細(xì)胞肺癌 A549 細(xì)胞凋亡的影響流式結(jié)果（%, ）

圖 6 各組 MSC 對非小細(xì)胞肺癌 A549 細(xì)胞凋亡的影響代表性圖片（n = 3）

Figure 6 Representative figures of MSC anti A549 cells (n = 3)

我們之所以把 MSC 作為基因傳遞載體，是因?yàn)?MSC 能夠或至少優(yōu)先歸巢到腫瘤內(nèi)，同時也因?yàn)?MSC 被廣泛認(rèn)為是免疫豁免的。從理論上講，未來使用同種異體間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞治療可以不預(yù)先使用免疫調(diào)節(jié)劑。并且，臍帶源 MSC 比其他來源的 MSC 更加易于收獲、培養(yǎng)和產(chǎn)業(yè)化。

間充質(zhì)干細(xì)胞對疾病是否會產(chǎn)生直接的影響是很重要的。一些研究表明，MSCs 在一些動物模型中顯示出內(nèi)在的抗腫瘤特性，能夠改善卡波西斯肉瘤[7]和皮下乳腺腫瘤[8]。人們提出了各種 MSC 抗腫瘤的機(jī)制，包括抑制 Akt[7]，下調(diào) NF-κB[9]和 Wnt 通路[8]。相反，間充質(zhì)干細(xì)胞也被發(fā)現(xiàn)在某些模型中與腫瘤促進(jìn)作用有關(guān)，包括促進(jìn)結(jié)腸[10]和乳腺[11]皮下腫瘤模型的增長和轉(zhuǎn)移。在肺腺癌的皮下腫瘤模型中，注射 MSC 后，沒有看到腫瘤的增長，并且在肺腺癌轉(zhuǎn)移模型中，間充質(zhì)干細(xì)胞顯示出了抗腫瘤作用[5]。本研究從細(xì)胞學(xué)水平證實(shí)了 TRAIL 基因修飾的 MSCs 能夠抑制肺腺癌細(xì)胞增殖。SPD-TRAIL 基因修飾的 MSC 的 TRAIL 表達(dá)量更高，其對 A549 肺癌細(xì)胞的抑制效果和促凋亡作用也更加顯著。

TRAIL 在體內(nèi)具有腫瘤的免疫監(jiān)測作用。注射抗 TRAIL 抗體或使用 TRAIL 敲除小鼠表明 TRAIL 缺陷的小鼠更易發(fā)生 TRAIL 敏感的腫瘤和轉(zhuǎn)移[12-14]。研究表明，體內(nèi)示蹤的 TRAIL-MSC 可能替代了 NOD/SCID 小鼠缺陷的免疫監(jiān)測系統(tǒng)缺陷，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的破壞和預(yù)防轉(zhuǎn)移的發(fā)生[5]。預(yù)防轉(zhuǎn)移對于許多實(shí)體瘤的病人來說很重要，原發(fā)腫瘤可通過切除、化療和放療來治療，但仍存在未來發(fā)生轉(zhuǎn)移癌的風(fēng)險(xiǎn)。利用高靈敏度和特異性的分子及細(xì)胞學(xué)技術(shù)能夠檢測血液和骨髓中非常少量的循環(huán)腫瘤細(xì)胞[15-16]，將來可能通過 TRAIL-MSC 靶向消除這些轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞。我們將進(jìn)一步通過動物實(shí)驗(yàn)探究 SPD-TRAIL 基因修飾的 MSC 對肺腺癌的生長和轉(zhuǎn)移作用。

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Study of engineered mesenchymal stem cells with SPD-TRAIL gene and their killing effect on the lung adenocarcinoma cells

MI Yi, WANG Li-hua, LI Xin, WANG Hao, ZHANG Chen-liang, MA Jing, MIAO Li, LIU Yong-jun, LIU Guang-yang

Beijing Baylx Biotech Co., Ltd., Beijing 100176, China (MI Yi, LI Xin, WANG Hao, ZHANG Chen-liang, MA Jing, MIAO Li, LIU Yong-jun, LIU Guang-yang); Stem Cell Biology and Regenerative Medicine Institution, Yi-Chuang Institute of Bio-Industry, Beijing 100176, China (MI Yi, LI Xin, WANG Hao, ZHANG Chen-liang, MA Jing, MIAO Li, LIU Yong-jun, LIU Guang-yang); Department of Hematology, The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 053600, China (WANG Li-hua)

To engineer mesenchymal stem cells (MSCs) to express dodecameric TRAIL and analyze the antitumor effect of dTRAIL-MSC.

TRAIL was genetic modified with SPD and then transfected into the mesenchymal stem cells. The characteristics of the cells were evaluated and we compared the antitumor effects of MSCs expressing SPD-TRAIL (SPD-TRAIL-MSCs) or TRAIL (TRAIL-MSCs) in A549 Lung adenocarcinoma cells.

The results showed that all UC-MSC groups, after TRAIL engineered or not, possessed the expression of the characteristic MSC surface marker and the ability of osteogenic and adipogenic differentiation. SPD-TRAIL-MSCs secreted more TRAIL protein than TRAIL-MSCs, and the SPD-TRAIL-MSCs exerted more significant inhibition of proliferation and induction of apoptosis in A549 cells.

SPD-TRAIL-modified MSCs can stably overexpress TRAIL protein and have a significant killing effect on lung cancer cell lines, providing new ideas for lung cancer treatment.

Mesenchymal stem cells; Lung adenocarcinoma; SPD-TRAIL; Gene engineering; Apoptosis

LIU Guang-yang, Email: Liugy04@163.com

劉廣洋，Email：liugy04@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.02.012

2019-10-31