李 娟，王一方，初彩華，詹 卉，張?jiān)赂撸跏锕猓?/p>

(1. 西南林業(yè)大學(xué) 云南省高校林木生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南 昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 云南 昆明 650224)

竹類(lèi)植物的繁殖方式多數(shù)以無(wú)性繁殖為主，在自然條件下大部分竹種需經(jīng)歷120年或更長(zhǎng)的時(shí)間才能開(kāi)花，因而竹類(lèi)植物的開(kāi)花現(xiàn)象也極少[1]，這導(dǎo)致竹類(lèi)植物通過(guò)生殖器官進(jìn)行形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、系統(tǒng)分類(lèi)等方面的研究皆遇到極大的阻礙，尤其是在胚胎學(xué)方面的研究更加困難。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)竹類(lèi)植物花的解剖學(xué)已經(jīng)有少量研究，但僅對(duì)少數(shù)竹種的生殖生物學(xué)進(jìn)行過(guò)詳細(xì)描述，如孝順竹(Bambusa multiplex (Lour.) Raeusch. ex Schult.)、綿竹（Bambusa intermedia Hsueh et Yi）、青絲黃竹（Bambusa eutuldoides McClure var. viridi-vittata (W.T. Lin) Chia）、異葉苦竹（Pieioblastus simonii f. heteophyllus Muroi）、綠竹（Dendrocalamopsis oldhami(Munro)Keng）、毛竹（Phyllostachys heterocycla(Carr.) Mitford cv. Pubescens）、鵝毛竹（Shibataea chinensis Nakai）、巨龍竹（Dendrocalamus sinicus Chia et J.L.Sun）、雷竹（Phyllostachys praecox C.D. Chu et C. S. Chao 'Prevernalis'）等竹種[2-11]。

硬頭黃竹（Bambusa rigida Keng et Keng f.）屬禾本科（Gramineae）箣竹屬（Bambusa）竹種[12]。主要分布在我國(guó)的廣東省、貴州省、四川省、江西贛州等地，其稈通直，材質(zhì)硬且堅(jiān)厚，可作竹筷、竹涼席等日用品開(kāi)發(fā)，在用材和造紙方面前景廣闊[13-14]。以往國(guó)內(nèi)外對(duì)硬頭黃竹的研究主要集中在形態(tài)與理化特性、遺傳多樣性及解剖結(jié)構(gòu)等方面[15-23]，缺乏對(duì)其具體花器官及胚胎發(fā)育方面的細(xì)致研究。本研究通過(guò)觀察硬頭黃竹花的基本結(jié)構(gòu)，對(duì)硬頭黃竹的分類(lèi)特征描述進(jìn)行補(bǔ)充，并對(duì)硬頭黃竹雌雄配子體發(fā)育進(jìn)行觀察，包括子房形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)以及雌雄配子體發(fā)育過(guò)程等，總結(jié)其胚胎發(fā)育規(guī)律，分析硬頭黃竹結(jié)實(shí)率較低的原因，為硬頭黃竹胚胎學(xué)研究積累原始資料，并為硬頭黃竹的育種工作打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)所用材料于2017年4月采自西南林業(yè)大學(xué)珍稀竹種園。將不同發(fā)育階段的小穗和花枝固定于50%FAA固定液中，進(jìn)行真空抽氣備用。

將固定處理后的小穗使用體視解剖鏡（Olympus HO11）進(jìn)行不同發(fā)育時(shí)期的結(jié)構(gòu)解剖、測(cè)量及拍照。然后再將解剖后的花藥和子房，浸蠟包埋后，旋轉(zhuǎn)切片機(jī)進(jìn)行切片，切片厚度為6～8 μm。利用番紅-固綠雙重染色，加拿大樹(shù)膠封片[24]。在Nikon-ECLIPSE50顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 硬頭黃竹花序和小穗的形態(tài)結(jié)構(gòu)

硬頭黃竹的花序軸是由不同的節(jié)和節(jié)間營(yíng)養(yǎng)枝生長(zhǎng)發(fā)育而來(lái)，小穗生于花枝各節(jié)，呈淡黃綠色（圖1A）。小穗底部具有潛伏芽，柄幾無(wú)，為假小穗，呈簇狀，多為2個(gè)或2個(gè)以上長(zhǎng)在花序軸的節(jié)上（圖1A、B）。底部有3～5片由小變大的近卵形苞片包裹，苞片常發(fā)生脫落，苞片背面有紫黑色斑點(diǎn)，苞片一般無(wú)毛（圖1C）。小穗含有兩性花3～7朵，平均長(zhǎng)3.75 cm，小穗軸節(jié)間平均長(zhǎng)3.0 mm（圖1D）。開(kāi)花時(shí)，往往花枝同一節(jié)的小穗開(kāi)花程度不同，且同一小穗的不同小花之間開(kāi)花情況和次序也不同。一般由下往上成熟程度遞減，即基部小花發(fā)育成熟最早，頂部小花發(fā)育成熟最晚。小穗軸節(jié)間清晰可見(jiàn)，后期會(huì)發(fā)生逐節(jié)斷落的現(xiàn)象（圖1E）。小穗軸的節(jié)間較扁且長(zhǎng)度不同，通?；抗?jié)間較短，上部節(jié)間較長(zhǎng)，且同一節(jié)間，下部較細(xì)，上部較粗（圖1F）。

圖 1 硬頭黃竹小穗的形態(tài)解剖Fig. 1 The morphological anatomy of spikelets in Bambusa rigida

2.2 硬頭黃竹的小花形態(tài)結(jié)構(gòu)

硬頭黃竹小花主要由外稃、內(nèi)稃、漿片、雄蕊和雌蕊五部分組成（圖2）。解剖發(fā)現(xiàn)，硬頭黃竹小花包括內(nèi)外稃片各1枚，外稃質(zhì)地較硬，平均長(zhǎng)1.25 cm，具多脈，頂端急尖，前端邊緣具齒，一般外被纖毛，內(nèi)側(cè)表面光滑（圖2A～D）。內(nèi)稃對(duì)生外稃內(nèi)側(cè)且短于外稃，有2脊，5脈，上部同樣被纖毛（圖2E）。漿片3枚，2枚呈半勺形，另外1枚較其它2枚略長(zhǎng)，上部邊緣有纖毛（圖2F）。開(kāi)花時(shí)，漿片吸水膨脹，內(nèi)外稃張開(kāi)，此時(shí)雄蕊露出小花，因此硬頭黃竹又屬于開(kāi)放型花。

硬頭黃竹具1枚雌蕊，三分支羽毛狀柱頭，柱頭較長(zhǎng)，花柱極短（圖2G）。子房呈長(zhǎng)卵圓形，較扁，具明顯三棱，上部具絨毛，下部光滑（圖2H）。雄蕊6枚，未成熟時(shí)呈白色，形狀整齊，基部呈箭簇狀，花藥成熟時(shí)顏色逐漸變深，且不斷長(zhǎng)大（圖2I）?；ㄋ幊墒旌蠡ńz伸出而垂懸于小花外（圖1A）。

圖 2 硬頭黃竹小花形態(tài)解剖Fig. 2 The morphological anatomy of florets in Bambusa rigida

2.3 硬頭黃竹花藥的解剖結(jié)構(gòu)與發(fā)育

硬頭黃竹小穗的每朵小花具6枚花藥，每枚花藥具有4個(gè)藥室（圖3A）?；ㄋ幈诘膶訑?shù)隨著發(fā)育時(shí)期不同而有所變化。造孢細(xì)胞時(shí)期花藥壁完全分化，形成四層藥壁細(xì)胞，從外向內(nèi)依次是表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層（圖3A）。孢原細(xì)胞發(fā)育為初生造孢細(xì)胞后又進(jìn)行分裂，發(fā)育成為次生造孢細(xì)胞，此時(shí)花藥壁為完整的四層結(jié)構(gòu)（圖3A）。次生造孢組織游離形成小孢子母細(xì)胞（圖3B）。在小孢子母細(xì)胞時(shí)期，絨氈層可能由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分泌和消耗，細(xì)胞質(zhì)變淡（圖3B）。接著小孢子母細(xì)胞開(kāi)始減數(shù)分裂（圖3C～E），第一次減數(shù)分裂過(guò)程中發(fā)育為二分體，兩個(gè)核在同步進(jìn)行第二次分裂后，會(huì)在四個(gè)核之間產(chǎn)生細(xì)胞壁并且形成四分體，然后形成單核小孢子（圖3F）。此時(shí)，在藥室內(nèi)仍見(jiàn)到處于減數(shù)分解期的小孢子母細(xì)胞，這表明硬頭黃竹同一花藥室內(nèi)的不同小孢子發(fā)育是不同步的（圖L）。隨著小孢子的體積逐漸增大和細(xì)胞質(zhì)逐漸液泡化，形成許多小液泡，然后小液泡之間互相融合為大液泡，細(xì)胞核被大液泡擠到細(xì)胞的一端，即單核靠邊期（圖3G），此時(shí)可以在花粉壁上觀察到呈凸透鏡狀的花粉萌發(fā)孔，絨氈層發(fā)生顯著退化，幾近消失，只剩下一薄層貼著藥室內(nèi)壁，藥室內(nèi)壁也尚未纖維化形成纖維層。后來(lái)液泡逐漸消失，細(xì)胞質(zhì)逐漸充滿(mǎn)整個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞核進(jìn)行一次有絲分裂，形成二細(xì)胞花粉粒，藥室內(nèi)壁也發(fā)生顯著纖維化，形成纖維層（圖3H）?；ǚ哿ｋS后進(jìn)一步發(fā)生沉積，形成成熟花粉粒，從而導(dǎo)致花粉粒內(nèi)的細(xì)胞核難以觀察到（圖3I）。在花粉粒發(fā)育成熟后，藥室壁連接花絲處比較薄，且未發(fā)生纖維化，由于纖維層的作用，進(jìn)而導(dǎo)致此處藥壁縱向裂開(kāi)，以方便花粉粒釋放。在此階段，花藥壁僅剩下表皮細(xì)胞和纖維化的藥室內(nèi)壁共兩層細(xì)胞（圖3I）。

圖 3 硬頭黃竹花藥解剖結(jié)構(gòu)Fig. 3 The anther anatomical structure of Bambusa rigida

2.4 硬頭黃竹花藥敗育

硬頭黃竹雖然開(kāi)花，但結(jié)實(shí)率極低，幾無(wú)種子可以收獲。通過(guò)對(duì)花藥進(jìn)行切片觀察，可以發(fā)現(xiàn)花藥出現(xiàn)大量敗育的現(xiàn)象。對(duì)這些敗育的花藥進(jìn)行解剖觀察分析，可歸納總結(jié)為以下幾種類(lèi)型（圖4）。

第一種類(lèi)型為花藥壁發(fā)育正常，能形成正常的纖維層，絨氈層亦能退化，藥室內(nèi)僅個(gè)別花粉粒發(fā)育正常，但其他花粉粒發(fā)生收縮等異常現(xiàn)象（圖4A）。第二種類(lèi)型為花藥壁發(fā)育異常，未能形成纖維層，藥室內(nèi)的小孢子幾乎全為空殼花粉粒（圖4B）。第三種類(lèi)型為花藥壁也未能形成纖維層，花粉粒全部收縮變形，藥室也可能會(huì)一起發(fā)生收縮（圖4C、D），該類(lèi)型也可能是第二種類(lèi)型的不同發(fā)育階段。第四種類(lèi)型為花藥壁能形成絨氈層，且絨氈層發(fā)生退化，花藥壁也未發(fā)生纖維化，甚至藥室為空藥室，未產(chǎn)生任何小孢子（圖4E）。第五種類(lèi)型為花藥壁未能夠正常分化，花藥室也未能產(chǎn)生正常的小孢子（圖4F）。

2.5 硬頭黃竹子房的解剖結(jié)構(gòu)

硬頭黃竹極少開(kāi)花，也未能收獲到發(fā)育成熟的果實(shí)。在采集硬頭黃竹小穗的時(shí)候，由于只有一叢竹子中的幾株開(kāi)花，因此能夠采集到可用于實(shí)驗(yàn)的小穗不多，加上子房極小，很難切到不同發(fā)育時(shí)期的雌配子體，因此可以觀察并用以進(jìn)行描述的代表性切片較少（圖5）。硬頭黃竹子房位于雌蕊下端，子房上部外披較硬的纖毛、下部光滑，且有棱邊?？v切發(fā)現(xiàn)該竹種為側(cè)膜胎座，倒生胚珠（圖4A），2層珠被（圖4B）。對(duì)膨大的子房進(jìn)行縱切，可偶爾發(fā)現(xiàn)發(fā)育中的種胚（圖4C）。但由于野外未能收獲發(fā)育成熟的果實(shí)，也未在竹叢下部的土壤中發(fā)現(xiàn)實(shí)生苗，因此部分受精成功的子房未能發(fā)育成正常種子的原因并不清楚。而與此形成鮮明對(duì)比的是，在校園開(kāi)花慈竹(Neosinocalamus affinis)竹叢林下的土壤中可以觀察到大量存活的實(shí)生苗。

圖 4 硬頭黃竹各種發(fā)育異常的花藥Fig. 4 Various kinds of abortive anthers in Bambusa rigida

圖 5 硬頭黃竹子房Fig. 5 The ovary of Bambusa rigida

另外觀察發(fā)現(xiàn)，開(kāi)花的硬頭黃竹竹叢中少數(shù)竹稈開(kāi)花，并沒(méi)有全部竹稈一起持續(xù)開(kāi)花，開(kāi)花后相應(yīng)的竹稈、竹叢也未死去，仍正常生長(zhǎng)，也未再次開(kāi)花。由于未見(jiàn)到其它地理種源的硬頭黃竹開(kāi)花特征是否與此一致，因此未能明確此特征是否為該竹種的共同特征。但根據(jù)杜凡等[25]的總結(jié)，將梨藤竹屬（Melocalamus）、空竹屬（Cephalostachyum）、滇竹屬（Oxytenanthera）、思勞竹屬（Schizostachyum）、薄竹屬（Leptocanna）、牡竹屬（Dendrocalamus）、慈竹屬（Neosinocalamus）、懸竹屬（Ampelocalamus）等歸為開(kāi)花后死亡類(lèi)型，新小竹屬（Neomicrocalamus Keng f.）、箣竹屬（Bambusa）、大節(jié)竹屬（Indosasa）等為開(kāi)花不死亡類(lèi)型，箭竹屬（Fargesia）和剛竹屬（Phyllostachys）則開(kāi)花死亡和開(kāi)花不死亡兩種情況都有。本研究中硬頭黃竹屬于箣竹屬下的竹種為開(kāi)花不死亡類(lèi)型符合該結(jié)論。

3 討論

目前在竹類(lèi)植物研究中，有關(guān)竹類(lèi)植物的花序一般是遵循McClure[26]和耿伯介先生[27]的定義。McClure[26通過(guò)研究中國(guó)的竹種Schizostachyum的花序，在1934年首次提出“假小穗”的概念，他對(duì)竹類(lèi)植物的花序進(jìn)行了分類(lèi)，認(rèn)為竹子的花序可以分為：determinate inflorescence（有限制花序）和indeterminate inflorescence（無(wú)限制花序）兩大類(lèi)，其區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)為小穗的基部有無(wú)潛伏芽的存在。通常indeterminate inflorescence 的基部苞片內(nèi)有休眠芽，可以不斷地產(chǎn)生新的小穗狀，此種類(lèi)型為假小穗；而determinate inflorescence的基部沒(méi)有休眠芽，它的各小花是一次性進(jìn)行開(kāi)放的。林樹(shù)燕等[28]通過(guò)對(duì)翠竹(Pleioblastus fortunei (Van Houtte ex Munro) Nakai)、黃條金剛竹(Sasaella kongosanensis‘Aureostria-tus’)以及‘霞早’綠竹 (Bambusa oldhamii‘Xia Zao’)的花序建成過(guò)程進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)同一個(gè)花序中頂部的小穗首先發(fā)育，然后向基部依次發(fā)育，由不同位置小穗共同組成的花序?yàn)橛邢藁ㄐ?；而同一小穗上不同部位小花的發(fā)育順序?yàn)榛康巾敳康捻樞蛞来伍_(kāi)放，為無(wú)限制花序。因此，林樹(shù)燕等[28]認(rèn)為竹類(lèi)植物的花序應(yīng)為混合花序。根據(jù)McClure[26]和耿伯介[27]的觀點(diǎn)，黃條金剛竹和翠竹的花序類(lèi)型屬于有限花序即真花序，根據(jù)其定義小穗基部應(yīng)沒(méi)有休眠芽。而林樹(shù)燕等[27]發(fā)現(xiàn)，黃條金剛竹頂部小穗發(fā)育完成后，其基部又新分化出小穗。因此林樹(shù)燕等[28]認(rèn)為竹類(lèi)植物小穗基部具潛伏芽，應(yīng)均為有限制花序（假小穗）。本研究中硬頭黃竹小穗采集時(shí)間較早，采集時(shí)并未關(guān)注硬頭黃竹的花序，因此不予討論小穗所組成的花序方式。但由于硬頭黃竹與林樹(shù)燕等所報(bào)道的綠竹均屬同屬，因此兩者花序應(yīng)該相同。在硬頭黃竹小穗內(nèi)，小花由基部向頂部逐漸開(kāi)放的順序，屬于無(wú)限制花序，與林樹(shù)燕等人的觀點(diǎn)一致。由于硬頭黃竹小穗基部具有潛伏芽，屬于傳統(tǒng)觀點(diǎn)的“假小穗”。

有關(guān)竹類(lèi)植物花粉敗育、結(jié)實(shí)率低的報(bào)道并不是特別多，王雨珺等[4]在綿竹花藥中發(fā)現(xiàn)了大量敗育的現(xiàn)象，并對(duì)花藥敗育進(jìn)行分析，認(rèn)為花藥缺乏正常的造孢細(xì)胞、絨氈層中層發(fā)育異常、藥室收縮變形、花粉粒中空、花粉粒皺縮等多種變異類(lèi)型導(dǎo)致花藥敗育。林樹(shù)燕[29]認(rèn)為花粉敗育及萌發(fā)率低、胚囊發(fā)育異常、柱頭可授性低及自然授粉率低等情況均引起竹類(lèi)植物的結(jié)實(shí)率顯著降低。龐延軍等[30]認(rèn)為爬竹(Drepanostachyum scandeus (Hsuch et Yi) Keng f. ex Yi)雄蕊發(fā)育異常的現(xiàn)象最早出現(xiàn)在雄蕊原基發(fā)育時(shí)期，發(fā)育異常的雄蕊不能形成花粉囊或花粉囊內(nèi)細(xì)胞高度液泡化，無(wú)法形成正常的小孢子母細(xì)胞。王曙光等[10]認(rèn)為巨龍竹的小穗中存在營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，致使頂端的小花先發(fā)育結(jié)實(shí)，并先一步成為營(yíng)養(yǎng)中心，而開(kāi)花瀕死的巨龍竹本身營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，進(jìn)而限制其它小花的發(fā)育。除此之外，在青絲黃竹[5]、鵝毛竹[9]中均報(bào)道過(guò)多種敗育現(xiàn)象，這些敗育現(xiàn)象中與本研究中發(fā)現(xiàn)的硬頭黃竹藥室內(nèi)的小孢子幾乎全為空殼花粉粒、花藥壁未能形成纖維層，花粉粒及藥室收縮變形及花藥壁的絨氈層退化，花藥壁未發(fā)生纖維化，甚至藥室為空藥室，未產(chǎn)生任何小孢子等觀察到的敗育現(xiàn)象相似。因此，花粉敗育可能是竹類(lèi)植物敗育過(guò)程中發(fā)生共同現(xiàn)象，是竹類(lèi)植物結(jié)實(shí)率低的共同原因。

硬頭黃竹的雌雄異熟的特殊條件導(dǎo)致硬頭黃竹結(jié)實(shí)率降低。雌蕊和雄蕊幾乎都不是同時(shí)成熟的，導(dǎo)致硬頭黃竹不能自花授粉，多是異花授粉現(xiàn)象。而異花授粉現(xiàn)象在一定程度上加大了授粉成功的難度，由此降低了硬頭黃竹的結(jié)實(shí)率。同時(shí)，硬頭黃竹的開(kāi)花季節(jié)在雨季，雨季花粉粒沾水后導(dǎo)致其傳粉性能變差，由于其授粉的方式為風(fēng)媒，因此在一定程度上也降低了硬頭黃竹的授粉幾率。在有限的范圍內(nèi)，開(kāi)花的竹叢少，可授粉的雌蕊又不足的情況下，必然會(huì)導(dǎo)致硬頭黃竹的結(jié)實(shí)率下降。

4 結(jié)論

硬頭黃竹小穗基本結(jié)構(gòu)發(fā)育正常，小穗基部具潛伏芽，為假小穗。小穗開(kāi)花順序由基部向頂部開(kāi)放，屬于無(wú)限制花序。小穗發(fā)育正常，包含3～7朵小花，小花為開(kāi)放型，具內(nèi)外稃各1片，漿片3枚，雌蕊1枚，雄蕊6枚。雌蕊為三分枝羽毛狀柱頭，花柱極短。子房長(zhǎng)卵圓形，具三棱。子房單室，側(cè)膜胎座、倒生胚珠?；ǚ哿槎?xì)胞花粉，花藥發(fā)育后期出現(xiàn)大量敗育現(xiàn)象，可總結(jié)為5種敗育類(lèi)型?；ㄋ帞∮菍?dǎo)致硬頭黃竹結(jié)實(shí)率低的主要原因。