周 程

“直面新型冠狀病毒肺炎：重大疫情防控的跨學科研究”專刊

病毒是什么？——人類發(fā)現(xiàn)首個病毒的過程考察

周 程1，2

（1. 北京大學 哲學系，北京 100871；2. 北京大學 醫(yī)學人文學院，北京 100191）

在細菌致病學說盛行的時代，在電子顯微鏡尚未問世的情況下，病毒是怎樣被發(fā)現(xiàn)的？病毒的概念又是怎樣被構建起來的？基于科學思想史視角，對人類發(fā)現(xiàn)第一個病毒——煙草花葉病毒過程中的如下8個關鍵節(jié)點進行了考察：（1）麥爾發(fā)現(xiàn)煙草患花葉病后其病葉汁液具有傳染性；（2）伊萬諾夫斯基發(fā)現(xiàn)煙草花葉病致病因子具有濾過性；（3）貝杰林克發(fā)現(xiàn)煙草花葉病致病因子是“傳染性活流質”；（4）呂夫勒和菲洛施發(fā)現(xiàn)?？谔阋咧虏∫蜃邮恰皹O小生物”；（5）伊萬諾夫斯基認為煙草花葉病致病因子不是活流質；（6）杜加爾認為煙草花葉病致病因子是可在細胞內增殖的微粒；（7）斯坦利基于結晶實驗提出煙草花葉病毒是一種蛋白質；（8）煙草花葉病毒原來是桿狀核酸蛋白質復合體。在此基礎上，還針對科學研究的局限性和科學認知的漸進性問題進行了探討。

細菌致病學；煙草花葉病毒；科學發(fā)現(xiàn)；科學概念；科學精神

自武漢爆發(fā)新型冠狀病毒肺炎以來，病毒這個專業(yè)術語在國內迅速普及，可以說如今已成為家喻戶曉、婦孺皆知的日常用語了。不過，對于國際病毒分類委員會為什么會在這次的新型冠狀病毒命名問題上產生意見分歧，很多人未必有很深刻的理解。

按照美國主流教科書《現(xiàn)代病毒學導論》給出的解釋，病毒是亞微觀的寄生性的含有蛋白質衣殼的遺傳物質顆粒[1]。說得更具體一點，病毒與細菌不同，是一類極小的非細胞生物；其體積小到可以通過細菌過濾器，人們只能借助電子顯微鏡才能看到它；病毒的結構非常簡單，通常由蛋白質衣殼和核酸內芯組成（圖1）。

人類最早發(fā)現(xiàn)的病毒是煙草花葉病毒（圖2）（Tobacco Mosaic Virus，縮寫為TMV）。這種亞微觀的病毒究竟是怎樣被發(fā)現(xiàn)的？其概念又是怎樣被構建起來的？不同時期、不同國別、不同專業(yè)的學者在此過程中扮演了什么樣的角色？

荷蘭林堡大學健康倫理與哲學系的赫爾沃特（Ton van Helvoort）博士曾于1991年發(fā)表長文討論過這些問題[2]，日本東京大學理學部名譽教授岡田吉美甚至在2004年出版專著詳細梳理了煙草花葉病毒研究百年史[3]。盡管二人的研究已有些年頭，但仍具有重要參考價值。筆者擬基于他們的研究和新近問世的相關論著，并盡可能對照當年研究煙草花葉病毒的學者發(fā)表的原始論文或報告，從科學思想史視角就上述問題做些粗淺的考察，以期能為國內的科學史和科學哲學研究提供一些素材，并為中國當下的科學技術治理提供一些借鑒。

圖1 形形色色的病毒

需要指出的是，本文在深描煙草花葉病毒的發(fā)現(xiàn)過程時，重點關注的是跨時代、跨國別和跨專業(yè)的病毒研究人員持續(xù)性的、反思性的“集體學習”行動。這種研究接力，揭示了有別于傳統(tǒng)的知識生產模式。其中，每位后來者扮演的都不是簡單的“反對者”角色，而是在揚棄的基礎上調度更多的研究資源，以形成更具魯棒性的科學共識。

1 麥爾發(fā)現(xiàn)煙草患花葉病后其病葉汁液具有傳染性

因率先成功制備煙草花葉病毒蛋白質結晶而分享1946年諾貝爾化學獎的美國生物化學家斯坦利（Wendell Meredith Stanley，1904-1971），在1944年發(fā)表的一篇文章中指出：有相當多的理由將俄國的植物生理學家伊萬諾夫斯基（Dmitrii Ivanovsky，1864-1920）視作新興的病毒學學科之父[4]。盡管如此，討論首個病毒的發(fā)現(xiàn)經緯時，仍不能不從德國農業(yè)化學家麥爾（Adolf Eduard Mayer，1843-1942）談起。

麥爾于1843年生于德國西北部的奧爾登堡。他1860年進入卡爾斯魯厄理工學院學習數學和化學，1862年又進入著名的海德堡大學深造，并于1864年獲得該校的博士學位。在海德堡大學講授一段時間的發(fā)酵學和化學工程之后[5]13，麥爾于1876年赴荷蘭擔任瓦格寧根農業(yè)試驗站主任[6]。當時，很多種植煙草的農民都遇到了一個困惑，那就是，煙草長出的深綠色葉子上會莫名其妙地出現(xiàn)淺綠色斑紋，致使煙葉的產量和質量都受到嚴重的影響（圖3）。為探明該煙草疾病的產生原因，麥爾自1879年開始對煙草的種植展開了長時間的觀察與實驗研究，并于1882年將這種煙草疾病命名為“煙草花葉病”（mozaik ziekte van de tabak,即Tobacco Mosaic Disease）[3]22（圖4）。

圖3 煙草花葉病癥狀

麥爾曾研究過種子對煙草花葉病的影響，但他排除了這一影響的存在。因為同一批種子種植在不同的地方，并沒有都出現(xiàn)花葉病。麥爾還研究過氣溫、光照對煙草花葉病的影響，他發(fā)現(xiàn)煙草花葉病與氣候并沒有直接的關聯(lián)，因為不同地區(qū)、不同時節(jié)的煙草都會得花葉病。于是，麥爾將研究的重點集中到土壤的影響上。

1840年，德國的化學家李比希（Justus von Liebig，1803-1873）公開出版了《化學在農業(yè)和生理學中的應用》一書，揭開了近代農業(yè)化學革命的序幕[7]。1862 年，李比希把它增補成兩厚冊作為第7版出版時，麥爾正在海德堡大學攻讀與化學有關的學位。因此，這本名著不可避免地對他產生了影響。按照李比希在該書中提出的物質補償法則，麥爾推測，煙草花葉病很有可能是因為土壤中缺少某種或某些元素導致煙草營養(yǎng)不良造成的。為此，他對患病煙草和健康煙草的葉子所含有的化學成分以及患病煙草和健康煙草根莖周圍的土壤成分進行了對比分析，但他并沒有找到導致煙草患花葉病的原因[8]。

1881年夏季的某一天，麥爾漫無目的地來到瓦格寧根農業(yè)試驗站的實驗苗圃。他發(fā)現(xiàn)苗圃中種植的好幾個外國品種的煙草都沒有患花葉病，但附近農家種植的本國品種煙草都不同程度地得了花葉病[5]13。麥爾由此意識到煙草花葉病不太可能是由土壤成分的差異造成的。這些煙田互相毗鄰，土壤成分不可能有太大的差異。既然煙草花葉病不可能是營養(yǎng)不良癥，那么它又是由什么因素造成的呢？

當時，德國細菌學家科赫（Robert Koch，1843-1910）雖然尚未因發(fā)現(xiàn)結核桿菌而成為家喻戶曉的英雄人物，但他1876年在《植物生物學通訊》上發(fā)表的論文“炭疽熱病因：基于炭疽桿菌的發(fā)展過程”已在學術界產生了廣泛的影響[9]。盡管人們已普遍接受動物罹患的一些疾病是因感染了某種特定的細菌造成的這一細菌致病理論（germ theory）[10]，但是沒有任何證據表明某些植物疾病也是因細菌感染造成的。

處于窮途末路的麥爾決定模仿科赫的研究看看煙草花葉病是不是也會通過病原體傳染。于是，他將患有花葉病的煙草葉子搗碎、將從中提取的汁液用玻璃毛細管注入多株健康煙草的葉脈中。他發(fā)現(xiàn)，這些煙草已經長出的葉子并沒有出現(xiàn)花葉病癥，但大約10天后新長出來的嫩葉幾乎都出現(xiàn)了花葉病癥。而且，將從患有花葉病的煙草葉子中提取的汁液加熱到攝氏80度后，這些汁液都會失去上述特性[3]23。因此，麥爾懷疑患病煙草葉子的汁液中含有可傳染花葉病的細菌。但他使用當時最先進的光學顯微鏡也未觀察到這種假想的細菌。而且，用培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)后也沒有培養(yǎng)出任何可傳染煙草花葉病的細菌。

圖4 麥爾（Adolf Eduard Mayer，1843-1942）拍攝的感染上花葉病的煙草葉子

于是，麥爾開始給健康煙草接種各種各樣的已知細菌，看看導致煙草感染花葉病的細菌是不是其中的一種。未果后，他又給健康煙草接種一些動物和人的糞肥，以及磨碎了的過期奶酪和腐敗了的豆制品，看看煙草花葉病會不會是像酵母那樣的真菌作用的結果，因為當時基于李比希的發(fā)酵和腐敗學說建立起來的發(fā)酵致病理論（zymotic theory）仍然相當流行[11]61-69。當然，所有這些努力都未能幫助麥爾找到煙草花葉病的致病因子[8]。

麥爾后來又做了一系列實驗。他發(fā)現(xiàn)，用單層濾紙過濾患病煙草葉子的汁液時，致病因子是能夠通過濾紙的。但他還發(fā)現(xiàn)，使用雙層濾紙過濾時，提取液會變成“透明濾液”，而且這種濾液不具有傳染性。由此，麥爾推定，煙草感染花葉病不可能是由真菌引起的，因為即使是酵母這樣的微小真菌也穿越不了濾紙，也就是說它們在第一次過濾時就會被濾除。麥爾認為，煙草花葉病也不會是酶參與作用的結果，因為酶之類化學物質不僅不能自我繁殖，而且即使是使用多層濾紙過濾也不至于被濾除。

麥爾最終給出的結論是，（1）煙草感染花葉病與細菌有關；（2）患有花葉病的煙草葉子污染土壤后容易引起花葉病，因此不能將病變煙葉放置在煙田里。盡管麥爾并沒有真正找到煙草花葉病的致病因子，但他1886年還是公開發(fā)表了上述研究結論[12]。

實際上，煙草花葉病是由病毒而非細菌引起的。由于病毒遠小于細菌，使用光學顯微鏡根本就看不到，所以麥爾當時找不到煙草花葉病的致病因子并不奇怪。問題是病毒是可濾過的，即便使用多層濾紙過濾，濾液都應該具有傳染性。是故，麥爾提出的非濾過性的細菌是導致煙草患花葉病的病原這個觀點并不成立，它經受不住重復實驗的檢驗。但毋容置疑的是，麥爾乃史上第一個發(fā)現(xiàn)煙草花葉病是一種植物傳染病的科學家。

麥爾開啟了煙草花葉病致病因子的研究先河。他的研究結果對正在撰寫與煙草花葉病有關的學位論文的俄國學生伊萬諾夫斯基以及當時也在瓦格寧根工作的荷蘭同行貝杰林克（Martinus Beijerinck，1851-1931）產生了很大的影響，并為他們取得研究突破奠定了重要的基礎。

2 伊萬諾夫斯基發(fā)現(xiàn)煙草花葉病致病因子具有濾過性

伊萬諾夫斯基1864年11月9日生于圣彼得堡附近的一個鄉(xiāng)村，其父乃西伯利亞的一名地主，幼年喪父后，隨家人搬遷至圣彼得堡的一個貧民區(qū)，并在那里上完了中學。1888年，伊萬諾夫斯基提交的學位論文“論煙草的兩種疾病”通過審查，被圣彼得堡大學授予理學士學位。剛畢業(yè)時，他繼續(xù)待在圣彼得堡大學，一邊準備申請教職，一邊在植物學實驗室工作。此后，他轉赴圣彼得堡科學院的法明茨恩（Andrei Sergeevich Famintsyn，1835-1918）實驗室擔任助手。伊萬諾夫斯基于1895年完成論文“對酒精發(fā)酵的一項調查”的寫作，并因此獲得碩士學位。之后，他又因在煙草花葉病研究方面卓有建樹而于1903年被授予博士學位[13]。同年，伊萬諾夫斯基獲聘擔任波蘭的華沙大學植物學系教授。

伊萬諾夫斯基在圣彼得堡大學學習期間，曾于1887年和1890年兩度接受俄羅斯農業(yè)部的委托赴烏克蘭和克里米亞調查煙草疾病的形成原因。在搜集有關煙草疾病的先行研究文獻過程中，他獲悉德國學者麥爾此前已對煙草花葉病展開過深入細致的研究[13]。不過，伊萬諾夫斯基在重復麥爾的實驗時發(fā)現(xiàn)，使用兩層濾紙對患有花葉病的煙草葉子的汁液進行過濾后，所獲得的濾液仍然具有傳染性，這與麥爾的實驗結果明顯不符。于是，他又使用一種當時最為先進的生產無菌純凈水用過濾器——尚柏朗（Charles Chamberland，1851-1908）氏過濾器對患有花葉病的煙草葉子的汁液進行了過濾（圖5）。結果，所獲得的濾液同樣具有傳染性。這使伊萬諾夫斯基感到非常納悶[5]14。

圖5 尚柏朗（Charles Chamberland，1851-1908）氏燭形陶瓷濾芯過濾器

在伊萬諾夫斯基看來，只有兩種可能性可以解釋這種現(xiàn)象。一是這種過濾器存在質量不穩(wěn)定問題，以致具有傳染性的細菌通過了通常根本無法通過的微小濾孔。二是濾液中的致病因子是一種和自己兩年前發(fā)現(xiàn)的毒素類似的物質，這種毒素有可能是細菌在加壓過濾過程中分泌出來的。不論是前者還是后者，歸根結底，汁液的傳染性都是由細菌導致的。由此可見年輕的伊萬諾夫斯基當時對巴斯德（Louis Pasteur，1822-1895）和科赫的細菌致病說的盲信程度。正因為如此，他未能對該項實驗結果所揭示的意義進行深入的思考和探究。他雖然率先發(fā)現(xiàn)通過細菌過濾器的濾液仍然具有傳染性這一現(xiàn)象，但卻未能明確提出濾過性病原體這一概念[5]14。

其實，即使是在當時的實驗條件下，要排除毒素引起花葉病這種可能也并不困難。譬如說，可以使用玻璃毛細管將少量通過尚柏朗氏過濾器的汁液稀釋后接種至健康煙草的葉脈中，待該煙草的葉子出現(xiàn)花葉病癥狀后，再提取該患病葉子的汁液，并將其稀釋后接種至其他健康煙草的葉脈中。如果傳染是由毒素類化學物質引起的，此時汁液中的毒素的濃度會大為降低，因此傳染性會明顯減弱。這樣重復做幾輪實驗后，被接種的健康煙草應該不會再出現(xiàn)花葉病癥狀。如果仍然出現(xiàn)，那就意味著汁液中的致病因子具有增殖性，不太可能是毒素類化學物質引起的。

當然，伊萬諾夫斯基也可以多購置幾個過濾器再做幾次重復實驗。如果更換多個甚至是多個型號的過濾器后，所獲得的濾液都具有傳染性，那么就應該意識到，即使這種濾過性病原體是“細菌”，那它也非通常意義上的細菌，而是一種體度遠小于常見細菌的致病因子。但是，伊萬諾夫斯基并沒有這么做。

伊萬諾夫斯基1892年向圣彼得堡科學院提交了一篇題為“關于煙草花葉病”的論文，介紹了上述研究發(fā)現(xiàn)[14]。因此，后來很多學者，尤其是俄國學者據此認為，伊萬諾夫斯基是濾過性病原體、亦即病毒的發(fā)現(xiàn)者。為紀念伊萬諾夫斯基的上述研究業(yè)績，前蘇聯(lián)《微生物學》雜志曾在1942年出了一個紀念專輯[15]。1964年，在伊萬諾夫斯基誕辰100 周年之際，前蘇聯(lián)還將其視作為病毒學的創(chuàng)始人特意為其發(fā)行了一枚紀念郵票[16]（圖6）。1992年，普林斯頓大學分子生物學系的盧斯蒂格（Alice Lustig）和萊文（Arnold J. Levine）在題為《病毒學100年》的評論中高度評價了伊萬諾夫斯基百年前的研究，認為該項研究邁出了病毒發(fā)現(xiàn)的第一步[13]。

但是很多歐美學者認為，雖然伊萬諾夫斯基1892年發(fā)表的論文值得在病毒學史中大書特書，但將其視作為病毒的發(fā)現(xiàn)者未必合適。例如，1998年，英國皇家學會召開了“煙草花葉病毒：一個世紀的開創(chuàng)性研究”專題研討會，該會的組織者就傾向于認為荷蘭的微生物學家貝杰林克才是病毒學學科的創(chuàng)始人[6]。

圖6 前蘇聯(lián)發(fā)行的伊萬諾夫斯基（D. Ivanovsky, 1864-1920）紀念郵票

3 貝杰林克發(fā)現(xiàn)煙草花葉病致病因子是“傳染性活流質”

貝杰林克1851年生于阿姆斯特丹，1872年畢業(yè)于代爾夫特理工學院化學系，1877年獲萊頓大學理學博士學位。1876年，他赴新創(chuàng)立的瓦格寧根農業(yè)學校擔任植物學教師。同年，麥爾也來到了瓦格寧根。由于研究領域相近，二人在瓦格寧根交往甚密，所以貝杰林克從麥爾那里獲得了不少有關煙草花葉病的研究信息[17]。1885年，貝杰林克從瓦格寧根搬遷到代爾夫特，在一家生產酵母和酒精的工廠擔任細菌學實驗室負責人。1895年，他又來到代爾夫特理工學院擔任細菌學教授[16]。

1897年，新的細菌學實驗室和溫室一經建成，貝杰林克便急切地重新開啟了煙草花葉病研究。1898年，他發(fā)表了一篇著名論文，提出了“傳染性活流質（）”的概念（圖7）。1900年，他又將這篇論文翻譯成了法文，引起了廣泛的關注[16]。

從貝杰林克1898年發(fā)表的論文中可以看出，他和伊萬諾夫斯基一樣使用尚柏朗氏過濾器對從患有花葉病的煙草葉子中提取的汁液進行了過濾，并發(fā)現(xiàn)濾液具有傳染性[18]（圖8）。不過，貝杰林克在上述論文中并沒有引用伊萬諾夫斯基1892年寫的論文。這很可能是因為他當時的確沒有看到該論文。

尚柏朗氏過濾器使用無釉陶瓷做濾芯，濾芯上的濾孔直徑在0.1~1微米，因此即使是非常微小的細菌也無法通過濾芯上的濾孔進入濾液。現(xiàn)在從患有花葉病的煙草葉液中提取的濾液居然有傳染性，如何解釋？問題是使用最先進的光學顯微鏡也無法從濾液中找到致病因子；而且，無論是在有氧的環(huán)境下，還是在無氧的環(huán)境下，對濾液進行培養(yǎng)后，都顯示濾液中沒有任何細菌。不過，貝杰林克并沒有裹足不前。

貝杰林克對濾液進行大劑量稀釋后做了一組對比實驗，他發(fā)現(xiàn)大劑量稀釋后的濾液和未經稀釋的濾液對健康煙草產生感染的程度幾乎沒有差別。而且，受稀釋濾液感染的煙草葉子的汁液仍然具有很強的感染性，健康煙草接種其汁液后仍然都會出現(xiàn)花葉病癥狀。于是，貝杰林克推定濾液的感染性不是由無生命的化學物質引起的。

圖7 貝杰林克（M. Beijerinck，1851-1931）1898年論文中的接種實驗插圖

如果濾液中存在有生命的致病因子，那么這種致病因子是如何增殖的呢？貝杰林克又做了一組對比實驗。他像過濾患病煙草葉子的汁液一樣，用尚柏朗氏過濾器對健康煙草葉子的汁液進行了過濾，并獲得了一批濾液。他將這種濾液加入到有傳染性的濾液中之后，再給健康煙草進行接種。他發(fā)現(xiàn)健康煙草感染后的病癥表現(xiàn)程度與他用同體積的蒸餾水稀釋后的帶有傳染性的濾液的情況一樣。這意味著致病因子并沒有在健康煙草葉子汁液的濾液中發(fā)生增殖。它表明，致病因子只有在有細胞的條件下才有可能發(fā)生增殖。

盡管濾液中的致病因子無法用光學顯微鏡觀察到，但并不能排除它是比細胞還要小的超顯微顆粒的可能。于是，貝杰林克又使用瓊脂凝膠層析的方法做了一組實驗。他將從患病煙草葉子的汁液中提取的濾液滴到瓊脂凝膠上，然后將其抹勻，并定期加注純凈水，以方便濾液擴散。貝杰林克認為，如果濾液中的致病因子具有可溶性，那它就會滲透到瓊脂凝膠內部；如果致病因子具有顆粒性，那它就不會擴散。結果顯示，濾液10日后能夠向瓊脂凝膠內部至少擴散2毫米。而且，擴散至瓊脂凝膠內部的濾液仍然具有傳染性。貝杰林克據此推定，煙草花葉病的致病因子是一種液體或者是可溶的，也就是說不是顆粒狀的。

為了弄清煙草花葉病致病因子是如何感染煙草組織的，貝杰林克進行了一系列觀察。他發(fā)現(xiàn)，健康煙草接種病變葉子汁液的濾液后，總是在新長出來的嫩葉上出現(xiàn)花葉病斑，已經完全成熟的煙草葉子上并不會出現(xiàn)花葉病斑。葉子在生長過程中，總是在葉尖部位出現(xiàn)花葉病斑，在葉尖下部并不會出現(xiàn)花葉病斑。由于土壤中的致病因子是由根部進入煙草體內的，因此，貝杰林克推定，致病因子先進入煙草莖部，然后再感染正在進行細胞分裂的組織——葉芽或葉尖。致病因子只會在細胞組織分裂、生長時才增殖，且不會在不再分裂的成熟的細胞組織中增殖，但卻可以通過其傳播擴散。

貝杰林克還對煙草花葉病致病因子的活性進行了深入研究。他發(fā)現(xiàn)，濾液保存三個月之后，其傳染能力并沒有出現(xiàn)任何變化。而且，在攝氏40度的條件下將在病葉汁液中浸泡過的濾紙烘干后，仍能使健康煙草出現(xiàn)花葉病癥；將自然干燥后的病葉放置在植物標本箱里保存兩年后，同樣能使健康煙草感染花葉病。不過在這兩種情況下，致病因子的感染能力都會有所減弱。此外，將病葉汁液的濾液加熱到攝氏90度后，濾液將會完全失去活性，不再具有傳染性。

圖8 貝杰林克的煙草花葉病實驗記錄

貝杰林克還做了一項有關煙草花葉病致病因子的越冬性實驗。他在秋季終止給患有花葉病的盆栽煙草澆水，等其枯死后再拔出煙草，并將粘在煙草根部的土放回盆中。第二年春天，他在干放了一個冬季的盆子里栽了幾顆健康煙草。他發(fā)現(xiàn)，這些健康煙草最終都不同程度地患了花葉病。貝杰林克由此推定，煙草花葉病的致病因子即使在干燥的土壤中也能越冬，而且這些致病因子在春天會經由新栽培的煙草根部、莖部，感染煙草葉子，使其出現(xiàn)花葉病斑。

盡管當時的實驗條件和對細胞的認識有限，但貝杰林克的上述推論和假設有不少后來被證明與事實相當吻合。

4 呂夫勒和菲洛施發(fā)現(xiàn)?？谔阋咧虏∫蜃邮恰皹O小生物”

值得注意的是，貝杰林克只在論文題目和兩個小節(jié)的標題中使用了“傳染性活流質”（）這一術語，在論文的正文中，貝杰林克提及該因子時，都用“contagium”（觸染物）或“virus”（病毒）表示，后者更為常見[16]。

根據《牛津英語詞典》的解釋，“Virus”一詞源自于拉丁語，其字面意思是“粘稠的液體，毒素”，在中世紀晚期的英語中主要指“蛇的毒液”。實際上，“Virus”的含義在貝杰林克1898年發(fā)表上述文章之前一直沒有發(fā)生過太大的變化。因此，在十九世紀后期，人們在表達生物體內增殖的“poison”（毒素）之意時，會根據自己的喜好選擇“contagion”（觸染物）、“germs（病菌）”、“bacteria”（細菌）、或“virus”[11]126。它表明，這一時期“virus”仍未被賦予濾過性病原體的含義，它和“觸染物”、“病菌”、“細菌”可以互換使用。

1890年，微生物學之父巴斯德提出著名的論斷：“tout virus est un microbe”（所有的病毒都是微生物）。[16]但是，時過八年之后，貝杰林克就將“virus”用來指代“傳染性活流質”。貝杰林克的“傳染性活流質”的概念包含這幾層含義：（1）能通過細菌過濾器；（2）具有傳染性；（3）能在生物體內增殖，但不能在體外生長。簡言之，病毒是一種濾過性病原體。

很明顯，貝杰林克1898年時已經確立了存在一種自主的亞微觀（亞細胞）生命形式的信念。于是，“所有的病毒都是微生物”變成了“病毒不是微生物”。貝杰林克對病毒概念如此進行形塑與德國的細菌學家、科赫的弟子呂夫勒（Friedrich Loeffler，1852-1915）和菲洛施（Paul Frosch，1860-1928）的工作有著一定的關聯(lián)。

1882年，科赫在柏林生理學學會上宣布，他找到了結核病的病原體，這是一種若不用特殊染料進行染色，用光學顯微鏡根本看不見；而且生長十分緩慢，即使在特殊培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩周后也只能形成很小菌落的新型桿菌[9]?？坪盏倪@一重大發(fā)現(xiàn)在學界掀起了一波尋找疑難病病原菌的熱潮[10]。科赫的助手呂夫勒同年就發(fā)現(xiàn)了類鼻疽桿菌，1884年又培養(yǎng)出了白喉桿菌[19]。積累了豐富的細菌學研究經驗后，呂夫勒又和菲洛施合作于1897年在科赫擔任所長的普魯士皇家傳染病研究所（現(xiàn)羅伯特·科赫研究所，RKI）啟動了?？谔阋卟≡w的探究（圖9）。如前所述，貝杰林克也是在同年啟動了對煙草花葉病的研究。

?？谔阋呤且环N傳染病，其典型癥狀是牛口腔、乳房和蹄部出現(xiàn)水泡和潰爛，犢?；疾『笏劳雎氏喈敻撸▓D10）。呂夫勒和菲洛施研究后發(fā)現(xiàn)，牛患口蹄疫后，其淋巴液中含有能通過細菌過濾器的傳染性物質，而且這種口蹄疫致病因子小到無法通過光學顯微鏡觀察到，也無法在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。還有，病牛淋巴液的濾液經過高度稀釋后，仍然具有傳染性，因此可排除其為化學毒素的可能性[20]。這項發(fā)現(xiàn)和伊萬諾夫斯基1892年研究煙草花葉病時的發(fā)現(xiàn)有著很多相似之處，不同的是，后者當時沒有用實驗排除致病因子是化學毒素的可能。

呂夫勒曾長期在科赫身邊工作，他對科赫確立的細菌致病理論深信不疑。因此，盡管牛口蹄疫的病原體具有濾過性，但他仍然不愿意全面修正細菌致病理論。呂夫勒和菲洛施認為，牛口蹄疫病原體雖然能夠通過連最小的細菌都無法通過的過濾器濾孔，但它仍是一種微粒（corpuscular）。人類和動物罹患的很多其他傳染病，例如天花、牛痘、猩紅熱、麻疹、傷寒和牛瘟等，其病原體也都是這種類型的“極小生物體”（）。很明顯，在呂夫勒和菲洛施看來，究極而言?？谔阋卟≡w是一種微生物，只不過其體度極小罷了。

圖9 呂夫勒（Friedrich Loeffler，1852-1915）1897年所在的皇家傳染病研究所

呂夫勒和菲洛施將上述研究成果整理成了4份研究報告，第1份報告的落款日期為1897年4月17日，因此被認為有可能在當年就已經公開發(fā)表了。不過，可以確定的是呂夫勒和菲洛施于1897年9月發(fā)表了一份德文的研究摘要，可能是因為沒有過濾實驗記錄，所以沒有引起貝杰林克的關注。貝杰林克在1898年的論文中只提到了呂夫勒1898年獨立發(fā)表的第4份研究報告[16]。毋容置疑，貝杰林克在研究煙草花葉病過程中受到了呂夫勒對?？谔阋卟≡w的研究影響。但是，二人在濾過性病原體究竟是微粒還是流質一事上看法截然不同。因此，貝杰林克在1898年的論文中批評了呂夫勒的濾過性病原體微粒說。

要而言之，貝杰林克發(fā)現(xiàn)煙草花葉病病原體的時間點與呂夫勒和菲洛施發(fā)現(xiàn)?？谔阋卟≡w的時間點幾乎沒有差異，而且他們都用實驗表明濾過性病原體是一種客觀存在。只是雙方對實驗結果的解釋不同，貝杰林克認為這種新病原體是“傳染性活流質”，不是細菌；呂夫勒和菲洛施認為這種新病原體乃迄今為止從未遇到過的一種極其細小的微粒，但它仍屬于微生物，除體度外和細菌沒有太大的差異。因此，將貝杰林克視作病毒概念的提出者似乎更有說服力。但是，若將濾過性病原體的發(fā)現(xiàn)等同于病毒的發(fā)現(xiàn)，那么將病毒發(fā)現(xiàn)者的榮冠戴在貝杰林克的頭上還不如戴在呂夫勒和菲洛施的頭上更合適。實際上，伊萬諾夫斯基早在1892年就已發(fā)現(xiàn)了濾過性病原體，只是他對當時觀察到的實驗現(xiàn)象沒有進行深究罷了。

圖10 現(xiàn)已解明的口蹄疫病毒生命周期示意圖

5 伊萬諾夫斯基認為煙草花葉病致病因子不是活流質

1899年，貝杰林克將自己1898年發(fā)表的上述論文翻譯成了德文。這篇德文論文很快就引起了伊萬諾夫斯基的關注。伊萬諾夫斯基當年就寫了一篇論文回應道：自己早在1892年就已發(fā)現(xiàn)濾過性病原體，因此濾過性病原體的發(fā)現(xiàn)者應該是他，而不是別人[3]23。通過貝杰林克的論文，伊萬諾夫斯基獲悉貝杰林克和呂夫勒對濾過性病原體是微粒還是流質存在嚴重的意見分歧。伊萬諾夫斯基難以接受貝杰林克的活流質說，他更傾向于支持呂夫勒的微粒說。于是，伊萬諾夫斯基開始對貝杰林克基于實驗提出的諸多觀點進行了追試[5]16-17。

伊萬諾夫斯基也使用尚柏朗氏過濾器對患花葉病的煙草葉子的汁液進行了過濾（圖11）。不過，伊萬諾夫斯基過濾時沒有給汁液加壓，而且分三個時段進行了采樣。他發(fā)現(xiàn)，健康煙草接種這些濾液試樣后發(fā)病情況存在明顯差異。具體而言，最初采集的濾液確實具有傳染性，會使健康煙草出現(xiàn)花葉病癥。但是，過濾12小時后采集的濾液試樣和過濾36小時后采集的濾液試樣都不具有傳染性。因此，他認為貝杰林克的活流質說不成立。

圖11 燭形陶瓷濾芯過濾原理示意圖

在伊萬諾夫斯基看來，如果煙草花葉病病原體是液體，或者是可溶的，那么不論是在哪個時段采集的濾液都應具有傳染性，只有當煙草花葉病病原體是微粒時才會出現(xiàn)濾液的傳染性隨時間不斷降低的情況。其原因是，在不加壓的情況下，微粒形態(tài)的病原體會逐漸淤積在過濾器的微小濾孔中，使得病原體越來越難以通過濾孔，當達到一定的時間值后，只有液體才能通過過濾器的濾孔，由于此時微粒形態(tài)的病原體也不再能夠通過濾孔，所以濾液不再具有傳染性。

伊萬諾夫斯基對貝杰林克的瓊脂凝膠層析實驗也進行了追試。不過，伊萬諾夫斯基使用的是剛剛凝固成形的新鮮瓊脂凝膠。他發(fā)現(xiàn)，患有花葉病的煙草葉汁的濾液根本就不會在這種新鮮瓊脂凝膠中擴散，而且做對比實驗用的顏料墨水溶液也不會在這種新鮮瓊脂凝膠中擴散。但是，如果使用放置數日的陳舊瓊脂凝膠做實驗，那么煙草葉汁的濾液和顏料墨水溶液都會在瓊脂凝膠中擴散。

圖12 伊萬諾夫斯基1903年論文中的病葉光學顯微鏡觀察圖

伊萬諾夫斯基的解釋是，瓊脂凝膠放置一段時間后內部會出現(xiàn)細微裂紋，從而使煙草葉汁的濾液和顏料墨水溶液能夠滲透到其內部。顏料墨水溶液能夠在陳舊瓊脂凝膠中擴散，說明陳舊瓊脂凝膠中的裂紋已經相當之大。因此，貝杰林克觀察到的煙草葉汁的濾液在瓊脂凝膠中擴散的現(xiàn)象不足以證明煙草花葉病的濾過性病原體是流質的觀點。

既然煙草花葉病的病原體不是液體或可溶的，那它是什么？是一種細菌，還是一種異常原生質? 伊萬諾夫斯基認為，它應該是一種極其微小的細菌。

只要煙草花葉病的病原體是細菌，不論它的體度小到何種程度，都應該能夠進行體外培養(yǎng)。因此，伊萬諾夫斯基嘗試著對煙草花葉病的病原體進行了體外培養(yǎng)。他發(fā)現(xiàn)，健康煙草接種培養(yǎng)液后出現(xiàn)花葉病的個體數量比對比組的要多，這個現(xiàn)象似乎只能用病原體在體外培養(yǎng)時發(fā)生了增殖來進行解釋。因此，伊萬諾夫斯基最終還是傾向于認定，煙草花葉病病原體是一種極其特殊的細菌（microbe），而非人們通常所講的細菌。不過，他在1903年公開發(fā)表的論文的結尾處提到，有關煙草花葉病病原體的人工培養(yǎng)問題需留待將來繼續(xù)研究（圖12）。

伊萬諾夫斯基對貝杰林克的流質說進行了有力的反駁，但他并沒有用實驗充分證明煙草花葉病病原體就是微粒。因此，進入20世紀后，學術界圍繞濾過性病原體，亦即貝杰林克所說的病毒是否是微粒問題展開了新一輪的研究競爭。

6 杜加爾認為煙草花葉病致病因子是可在細胞內增殖的微粒

邁入20世紀后，躋身煙草花葉病毒研究領域的學者越來越多。因電子顯微鏡的普及是1939年以后的事，故20世紀初期人們對煙草花葉病毒的研究只能是各顯神通。當時，人們討論得最多的問題是，煙草花葉病毒究竟是不是微粒？它是不是微生物？

1899年，美國農業(yè)部植物產業(yè)局專家伍茲(Albert F. Woods，1866-1948) 在研究葉綠素變色問題時意識到樹葉入秋后由綠變黃可能是葉內的氧化酶的作用結果。他由此推測某些植物病變，譬如煙草花葉病有可能是因葉內的氧化酶或過氧化酶活性增強所致[2]。這意味著煙草花葉病有可能不是外源性疾病，而是植物本身出了問題。1902年，他深入研究后發(fā)現(xiàn)患花葉病的煙草葉子的汁液中的確含有大量的氧化酶。他據此斷定，煙草花葉病是因氧化酶的新陳代謝發(fā)生紊亂引起的[21]。這樣，毒素說又開始抬頭。稍后進入美國農業(yè)部植物產業(yè)局擔任專家的奧拉德（Harry A. Allard，1880-1963）對毒素說表示懷疑。他1916年在對伍茲的實驗研究進行追試后指出，氧化酶不是引發(fā)煙草患花葉病的原因，而是煙草患花葉病導致的結果[22]。

當時第一次世界大戰(zhàn)正酣，奧拉德無法從德、法等國買到尚柏朗氏過濾器。正巧利文斯通（Burton. E. Livingstone）1908年發(fā)明了一種用于監(jiān)測土壤水分變化情況的裝置（圖13）。該裝置帶有一個埋在土壤中的、主要用云母制成的多孔杯。于是，奧拉德就用這種現(xiàn)成的多孔杯來替代尚柏朗氏過濾器進行過濾。他發(fā)現(xiàn)，患花葉病的煙草葉子的汁液用這種多孔杯過濾后，濾液中確實含有高活性的氧化酶，但這種濾液幾乎沒有傳染性。它表明煙草花葉病病原體已被多孔杯過濾掉了。盡管這是一項偶然發(fā)現(xiàn)，但它卻很好地證明了氧化酶并非煙草花葉病的病原體，同時還證明了煙草花葉病病原體是可被云母吸附的顆粒。

奧拉德還發(fā)現(xiàn)，煙草花葉病病原體不僅能夠被云母吸附，而且使用高濃度的乙醇對其進行處理后病原體還會失去活性。不過，使用45%～50%的乙醇對其進行處理后，病原體仍然會保持較強的活性，同時還會出現(xiàn)沉淀。

圖13 利文斯通（B. E. Livingstone）1908年發(fā)明的帶有多孔杯的土壤水分監(jiān)測儀

奧拉德的上述研究引起了美國著名的植物生理學家、植物病理學拓荒者杜加爾（Benjamin M. Duggar，1872-1956）的注意。杜加爾1898年在康奈爾大學取得博士學位后，曾赴美國農業(yè)部擔任過一年的植物生理學專家。1912年，他來到圣路易斯擔任華盛頓大學的植物生理學教授和密蘇里植物園的生理學專家，開始涉足煙草花葉病研究[23]。

杜加爾和其研究助理使用奧拉德的方法制得煙草花葉病病原體的沉淀物后，通過與已知物質顆粒的大小進行比對，于1921年推定，煙草花葉病致病因子的大小與血紅蛋白相近，直徑大約為30納米，體積大約是一般細菌的1/37000[24]。當時，測定血紅蛋白、明膠這類膠體的分子大小時都是先讓它們在溶液中充分擴散，然后用孔徑不同的超細過濾器進行過濾，根據其不能通過的最大孔徑來推定該分子的大小取值范圍。

杜加爾在研究過程中還發(fā)現(xiàn)，用45%~50%的乙醇處理后獲得的煙草花葉病致病因子好幾天后仍具有傳染性。此前，有研究表明，枯草菌的芽孢對高濃度的乙醇也具有耐受性。兩者的性質似乎沒有本質上的差異。杜加爾感到很好奇，于是和其研究助理對煙草花葉病致病因子和枯草菌的芽孢展開了比較研究。結果，枯草菌的芽孢在瑪瑙研缽中研磨3小時后就失去活性，而煙草花葉病致病因子研磨9個小時后仍然具有一定的傳染性[25]（圖14）。杜加爾給出的解釋是，枯草菌的芽孢在研磨過程中由于細胞結構被破壞了所以才失去活性，煙草花葉病致病因子的體積只有枯草菌芽孢的1/37000，由于不可能擁有枯草菌芽孢那樣的細胞結構，所以長時間研磨后仍未失去傳染性。這意味著煙草花葉病致病因子乃有別于細菌的微粒。

圖14 電動瑪瑙研缽主要部件

杜加爾在1923年的上述論文中指出：目前，認為煙草花葉病致病因子是細菌的觀點可能是完全錯誤的；被廣泛接受的觀點是煙草花葉病致病因子乃“病毒”。這種病毒在細胞內具有非同尋常的活性，但脫離細胞后，和任何沒有細胞結構的膠體粒子一樣沒有活性?？傮w看來，花葉病毒的行為更像是生物膠體，但它具有復制力。在該文的末尾，他寫道：“花葉病的致病因子可能是宿主細胞的間歇性產物，但不是像酶那樣簡單的產物，更像是構成染色質的顆?；蚓哂心撤N遺傳結構，譬如基因那樣的顆粒。也就是說，它擺脫了宿主細胞中各種調節(jié)機制的束縛，并被賦予了自我復制的能力?！盵25]至于顆粒狀的煙草花葉病致病因子自身究竟有沒有生命？杜加爾并沒有回答。

由上可知，一戰(zhàn)結束之初，美國的煙草花葉病毒研究水準就已超過歐洲。此時，在一些美國學者看來，致使煙草患花葉病的病毒乃濾過性病原體，但它既不是“傳染性活流質”，也不像具有細胞結構的“極小生物”，而是可在細胞內進行自我復制的超顯微顆粒。問題是這種顆粒狀的病毒究竟是什么？

7 斯坦利基于結晶實驗提出煙草花葉病毒是一種蛋白質

19世紀末期的煙草花葉病毒研究雖然只是小荷才露尖尖角，但卻帶動了20世紀早期的病毒研究的快速發(fā)展。不過，“20世紀早期的病毒研究主要在病毒病，而不在病毒的本質，因為識別某些傳染病比識別病原體要容易些?！盵26]

一戰(zhàn)后初期，在煙草花葉病毒研究領域表現(xiàn)最為突出的研究團隊當屬博伊斯湯普森植物研究所的昆克爾實驗室。昆克爾（Louis O. Kunkel，1884-1960）早年曾在美國農業(yè)部植物產業(yè)局研究過土豆病毒病，1920年去夏威夷工作后主要研究甘蔗病毒病，1923年他接受新成立的湯普森植物研究所的聘請來到紐約，負責組建植物病毒學實驗室[27]。該實驗室很快就吸引來了一批對煙草花葉病毒研究抱有濃厚興趣的學者。其中的代表人物有普爾蒂（H.A.Purdy）、霍姆斯（F.O.Holmes）和文森（C.G.Vinson）[3]41-46。

普爾蒂在研究過程中發(fā)現(xiàn)，患有花葉病的煙草葉汁中存在一種健康煙草葉汁中沒有的特殊物質，而且用煙草花葉病毒感染同為茄科的番茄、矮牽牛、辣椒等植物后，其葉汁中同樣含有這種物質，但在受其他病毒感染的煙草葉汁中并沒有找到這種物質。實驗表明，將該特殊物質與使用兔子制備的抗煙草花葉病毒血清混合后，其感染性會被中和。很明顯，這種具有抗原性的特殊物質源自于煙草花葉病毒。由于已有研究表明，具有抗原性的物質通常都是蛋白質，所以普爾蒂在1928年推定煙草花葉病毒中含有蛋白質。

霍姆斯在閱讀與煙草花葉病有關的研究文獻時注意到，有多篇文章提及將患有花葉病的煙草葉汁接種到某些煙草屬植物的葉子上之后，該片葉子上會出現(xiàn)局部病斑。于是，他給17種煙草屬植物接種了患有花葉病的煙草葉汁，結果，其中5種植物的葉子上出現(xiàn)了局部病斑（圖15）。霍姆斯確認這些局部病斑都是由煙草花葉病毒感染引起的。他認為可以用受感染葉子上的局部病斑數量來檢測所接種的煙草花葉病毒的濃度。于是，他于1929年開發(fā)出了使用心葉煙草定量檢測煙草花葉病毒濃度的新方法。這種方法不僅耗時短、精度高，而且簡單易行。此項研究為煙草花葉病毒的提純帶來了極大的便利。

文森在處理被煙草花葉病毒感染的煙草病葉提取液時發(fā)現(xiàn)，添加藏紅、丙酮、乙醇等沉淀劑后，傳染性物質會發(fā)生沉淀。而且，添加藏紅后沉淀的那些被認為是病毒的傳染性物質，不再具有傳染性，但去除其中的藏紅后，又會恢復傳染性。文森認為這可能是傳染性物質與藏紅發(fā)生反應造成的，換言之，病毒可能是一種化學物質。他于1931年推定這種化學物質與酶類似。此外，文森還注意到，用丙酮處理煙草病葉提取液時，會有結晶析出。不過，這種結晶的傳染性不強，而且含有不少雜質。盡管他試圖用結晶的方式提取分離煙草花葉病毒，但一直沒有成功。

圖15 煙草花葉病毒誘發(fā)的煙葉局部病斑

從煙草病葉的提取液中成功分離出煙草花葉病毒晶體的是美國洛克菲勒醫(yī)學研究所的生物化學家斯坦利。

1932年，在時任所長西蒙·弗萊克斯納（Simon Flexner，1863-1946）的主導下，洛克菲勒醫(yī)學研究所將位于普林斯頓的動物病理學部擴充為動物與植物病理學部。鑒于昆克爾在湯普森植物研究所組織開展植物病理學研究卓有成效，弗萊克斯納決定聘請他擔任新設立的植物病理學部門主任。昆克爾到任后，除了將霍姆斯等一批老部下帶到新單位之外，還將剛滿28歲的斯坦利納入自己的麾下。

斯坦利曾在伊利諾伊大學跟隨在美國科學界和工業(yè)界享有盛譽的著名化學家羅杰·亞當斯（Roger Adams，1889-1971）教授學習有機化學，并于1929年在那里獲得博士學位。之后，他又赴德國慕尼黑跟隨1927年的諾貝爾化學獎得主海因里?！ぞS蘭德（Heinrich Wieland，1877-1957）教授做了一段時間與天然物化學有關的博士后研究。[28]在這兩個有機化學頂尖研究室受到的學術訓練為他進入科研經費充裕的洛克菲勒醫(yī)學研究所開展煙草花葉病毒結晶研究奠定了重要的基礎。

斯坦利1933年啟動煙草花葉病毒結晶研究可以說是恰逢其時。（1）已有研究表明，煙草花葉病毒可能含有蛋白質；（2）提純所需的快速測定煙草花葉病毒濃度的方法已經確立；（3）從溶液中制備高純度晶體蛋白酶已有成功先例。關于第（3）點，需要再做些補充說明。

1926年康奈爾大學生物化學助理教授薩姆納（James B. Sumner，1887-1955）成功地從刀豆中提取分離出晶體脲酶,這是生物化學史上首次獲得的晶體酶。受其鼓舞，洛克菲勒醫(yī)學研究所研究員諾斯羅普（John H. Northrop，1891-1987）重啟了胃蛋白酶的研究與制備工作，并于1930年從一種商業(yè)胃蛋白酶制劑中分離出了晶體胃蛋白酶。此后，他又與人合作分離出了多種蛋白酶及其前體，從而使“酶是蛋白質”這一發(fā)現(xiàn)成為學界共識，并且積累了豐富的制備晶體蛋白酶的經驗[29]。

斯坦利的煙草花葉病毒結晶研究是從重復文森等人的實驗開始的。由于煙草病葉的提取液中除含有煙草花葉病毒外，還含有很多其他成分，所以需要采用鹽析法和層析法進行提純。關鍵是使用鹽析法進行分級沉淀時，需要對變量進行嚴格控制。斯坦利是學有機化學出身的，而且必要時還可以請所里的同事諾斯羅普提供幫助。這些有利條件都是文森所不具備的。而且，在濃縮病毒過程中，還需要頻繁地使用局部斑紋定量檢測法來確認沉淀物或上清液有無傳染性。由于霍姆斯已成為同事，所以必要時也可以隨時請教?？傊?，斯坦利很快就獲得了高濃度的煙草花葉病毒提取物。

斯坦利發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶雖然能抑制這種煙草花葉病毒提取物的傳染性，但其傳染性仍能恢復，而胃蛋白酶則能使其水解，從而徹底失去傳染性。據此，他1934年得出結論：煙草花葉病毒是一種蛋白質，或與某種蛋白質密切相關。其后，對煙草花葉病毒在不同氫離子濃度下的滅活速率的研究也同樣支撐這一結論[30]。這一結論無疑有助于斯坦利將目標直接鎖定蛋白質結晶的制備來設計接下來的濃縮與純化煙草花葉病毒的研究進路。

由于方向明確、路線正確、條件優(yōu)越，斯坦利1935年就從煙草病葉的提取液中成功地濃縮、分離出了高純度的煙草花葉病毒結晶（圖16）。該結晶即使稀釋10億倍或重復結晶10次仍然具有傳染性。而且，給動物注射這種結晶后獲得的抗血清能夠抑制煙草花葉病毒的傳染性。斯坦利隨即就將這項研究結論發(fā)表在當年的《科學》雜志上。他在這篇文章中明確指出：“煙草花葉病毒被認為是一種自催化蛋白質，就目前而言，它的增殖可能需要活細胞的存在?！薄霸摰鞍踪|的分子量，大約是幾百萬。”[31]

圖16 斯坦利（W. M. Stanley，1904-1971）1935年制備的TMV結晶

在西門子公司于1939年首次推出實用電子顯微鏡之前，科學家們雖然有足夠的證據斷定煙草花葉病毒是一種不同于細菌的微粒，但一直無法借助光學顯微鏡觀察到病毒。在根本看不到病毒的情況下，要將病毒分離出來進行培養(yǎng)，進而對其本質展開深入探究，無異于緣木求魚。斯坦利獨辟蹊徑，采用化學方法從患有花葉病的煙草葉子的提取液中成功分離出煙草花葉病毒結晶，使煙草花葉病毒變成一種既“看得見”又“摸得著”的蛋白質顆粒。這一貢獻無疑推動了人們從分子水平去進一步認識病毒的本質，促進了生物學與化學以及生物學與物理學的交叉融合，并為分子生物學的誕生奠定了重要基礎。斯坦利因在病毒蛋白質的分離、純化與結晶方面貢獻突出，1946年與薩姆納、諾斯羅普一道被授予諾貝爾化學獎。這是病毒研究領域的第一個諾貝爾獎。

8 煙草花葉病毒原來是桿狀核酸蛋白質復合體

斯坦利從患有花葉病的煙草葉子的提取液中濃縮、分離出蛋白質結晶，并用實驗證明這種蛋白質結晶具有傳染性，亦即能夠進行自我增殖。自我增殖乃生物才具有的屬性，如果像蛋白質這樣的化學物質的確具有自我增殖能力，那么生命和物質之間的界限豈不需要重新劃分？面對年輕的化學家提出的挑戰(zhàn)，生物學家不可能無動于衷。那些堅信病毒是生物，晶體蛋白質不是生物，因而不可能是病毒的生物學家最初的反應是對斯坦利的研究結論表示懷疑[2]。

理論上講，病原體的確定必須遵循生物學家公認的“科赫四原則”[32]。具體到煙草花葉病毒就是以下情況。（1）所有煙草病葉中都應含有煙草花葉病毒，但健康的煙草葉子中不能有。在這種情況下，我們并不知道煙草花葉病毒是導致煙草葉子受感染的原因，還是煙草葉子受感染后出現(xiàn)的結果。（2）從煙草病葉中分離出煙草花葉病毒，并進行純培養(yǎng)或純化處理。如果不能獲得無雜質的純粹煙草花葉病毒，根本就無法做單一要素可控實驗。而非單一要素實驗，對其結果無法進行明確歸因。（3）用純煙草花葉病毒給健康煙葉接種，健康煙葉都會發(fā)生相同病變。如果健康煙葉接種煙草花葉病毒后并沒有都發(fā)生病變，那意味著導致病變的并不只是煙草花葉病毒，可能還有其他未知因素參與作用。（4）從接種后發(fā)生病變的煙草葉子中仍能分離出煙草花葉病毒，而且分離出的病毒與抗煙草花葉病毒血清混合后會發(fā)生中和，亦即特異性應答。如果發(fā)生病變的煙草葉子中未必都確定有煙草花葉病毒，那么煙草花葉病的病原體究竟是什么，仍然不能完全斷定。

斯坦利1935年在《科學》雜志上發(fā)表的那篇論文不足2頁，由于寫得過于簡練，引起一些質疑在所難免。但他在1936年發(fā)表的一篇論文中詳細地介紹了自己的具體研究過程和所獲得的數據[33]。從中可以看出，他的煙草花葉病毒結晶研究從整體上講符合“科赫四原則”的基本精神。

比起生物學家，化學家對斯坦利的質疑則要尖銳得多。當時，化學家提出的主要問題是，煙草花葉病毒結晶的純度如何？它果真只是蛋白質？

從1935年的論文中可以看出，斯坦利從煙草花葉病毒結晶中并沒有測出磷，只是說測出了1%的灰分，而且測出的含氮量高達20%，與已知的蛋白質含氮量不符。這意味著他在使用硫酸銨鹽析法和硅藻土過濾法制備煙草花葉病毒結晶過程中很有可能沒有完全去除硫酸銨。在1936年的論文中，他雖然更正了含氮量的數值，但仍然沒有測出含磷量。

1936年，英國洛桑農業(yè)實驗站植物病理部門的鮑頓（F. C. Bawden）和劍橋大學病理系的皮里（N. W. Pirie）合作對自己混合使用硫酸銨鹽析法和等電點沉淀法精制出的煙草花葉病毒結晶進行檢測后發(fā)現(xiàn)，結晶中的含氮量為16.7%，含磷量為0.5%，含糖量為2.5%。他們深入研究后指出：煙草花葉病毒大約是由95%的蛋白質和5%的核糖核酸（RNA）組成的核酸蛋白質復合體。而且，他們還基于煙草花葉病毒溶液具有各向異性推定煙草花葉病毒顆粒呈桿狀[34]。這意味著病毒并不像人們通常想象的那樣是非常小的細菌，而是一種完全不同的實體。

鮑頓和皮里雖然證明了煙草花葉病毒中含有RNA，但是他們當時并沒有發(fā)現(xiàn)RNA作為基因組攜帶著重要的遺傳信息?！癛NA具有增殖能力，亦即傳染性”直到1956年才被德國科學家吉爾（A. Gierer）和施拉姆（G. Schramm）發(fā)現(xiàn)。1956年，吉爾和施拉姆將煙草花葉病毒放在水和苯酚中震蕩，使RNA與蛋白質分離后，再用提純過的RNA去給煙草接種，結果煙草葉子上出現(xiàn)了典型的花葉病斑。而當用核糖核酸酶對RNA進行處理后，再給煙草接種，煙草葉子上并不會出現(xiàn)病斑。經過一系列實驗驗證之后，吉爾和施拉姆指出，RNA是一種遺傳物質，煙草花葉病毒的RNA成分在接種后的煙草葉片中能夠誘導合成出新的煙草花葉病毒。1957年，佛蘭科爾-康拉特（H. Fraenkel-Conrat）和辛格爾（B. Singer）通過病毒的重建進一步證實了吉爾和施拉姆的上述結論[3]81-84。

鮑頓的弟子哈里森（B. D. Harrison）曾在文章中談到，鮑登和皮里當時曾就RNA是否具有傳染性的問題進行過實驗研究，可能是由于兩人的實驗室相距有50英里，等皮里把分離出的RNA運送給鮑登時RNA已經失活，所以鮑登和皮里未能發(fā)現(xiàn)RNA的傳染性[35]。

盡管鮑登和皮里推定煙草花葉病毒顆粒呈桿狀結構，但是直到1939年才被柏林帝國生物學研究所的生物化學家古斯塔夫·阿道夫·考舍（Gustav Adolf Kausche，1901-1960）等人確認。如眾所知，1933年，兩位德國年輕人恩斯特·魯斯卡（Ernst Ruska，1906-1988）與波多·馮·波里斯（Bodo von Borries，1905-1956）合作，成功地研制出了全球第一臺分辨率超過光學顯微鏡的電子顯微鏡。但這臺電子顯微鏡結構比較簡單，實用性不強。1938年，二人在西門子公司的支持下又合作研制出2臺結構更加合理、功能更為齊全、放大率可達3萬倍的實用電子顯微鏡試制品，其中1臺旋即交給了恩斯特·魯斯卡的胞弟，同時也是波多·波里斯的妻兄哈爾墨特·魯斯卡（Helmut Ruska，1908-1973）測試使用（圖17）。在此基礎上，西門子公司于1939年正式推出第1臺商用電子顯微鏡[36]。哈爾墨特·魯斯卡當時正在柏林大學查理特醫(yī)學院實習，他堅信電子顯微鏡有助于促進醫(yī)學和生物學的發(fā)展，因此1938年拿到電子顯微鏡后就開始嘗試著用它來觀察多種亞微觀生物。1939年他又協(xié)助考舍等人使用電子顯微鏡成功地觀察到了煙草花葉病毒[37]（圖18）。

考舍等人為了增加影像的對比度，將煙草花葉病毒與膠體金混合，不僅在電子顯微鏡中觀察到了煙草花葉病毒,而且還獲得了第一張煙草花葉病毒的電鏡照片。根據考舍等人的觀察，“煙草花葉病毒分子”呈桿狀，其直徑大約為15納米，長度為150或300納米。斯坦利等人1941年也使用電子顯微鏡對晶體煙草花葉病毒進行了觀察，這兩個團隊的觀察結果高度吻合。

這樣，自貝杰林克1898年使用“病毒”一詞特指濾過性病原體以來，人們終于用自己的眼睛看到了病毒顆粒，并確認它是含有RNA成分、具有傳染性的核酸蛋白質復合體。只是后來隨著電子顯微鏡技術的不斷發(fā)展，人們對桿狀煙草花葉病毒體度和結構的把握更加精準罷了。

9 結語

19世紀末20世紀初，巴斯德、科赫等人提出的細菌致病學說正處于鼎盛時期。受這種學說的啟迪，德國農業(yè)化學家麥爾發(fā)現(xiàn)煙草花葉病是一種植物傳染病，但他未能證明煙草花葉病的致病因子是一種濾過性病原體。首先在實驗過程中意識到煙草花葉病的致病因子是一種濾過性病原體的是俄國的伊萬諾夫斯基，但他當時并未意識到這種濾過性病原體是一種有別于細菌的新型病原體。

圖17 哈爾墨特·魯斯卡（H. Ruska，1908-1973）1938年用過的電子顯微鏡

圖18 考舍（G. A. Kausche，1901-1960）1939年拍攝的TMV電鏡照片

由于傳染病皆由細菌或其毒素引起的觀點獲得了廣泛認同，因此當可以通過細菌過濾器的新型病原體——口蹄疫病毒被“發(fā)現(xiàn)”之后，德國的呂夫勒和菲洛施等人仍然不愿意拋棄既有的理論和概念，繼續(xù)將這種新型病原體視作一種細菌。荷蘭學者貝杰林克雖然改造了傳統(tǒng)的“病毒”概念，并賦予其全新的涵義——“傳染性活流質”，但很少有人能夠接受這一觀念，因為根據以往的經驗人們很難想象非顆粒形態(tài)的流質也像單細胞細菌那樣具有生命力。

一戰(zhàn)結束后不久，美國植物病理學家杜加爾基于自己的實驗研究將“病毒”的概念發(fā)展成為可在細胞內自我增殖的微粒，但他既沒有見到這種微粒形態(tài)的病毒，也不知道它究竟是什么。因此，當美國生物化學家斯坦利借助當時最先進的酶蛋白質結晶技術于1935年制得煙草花葉病毒結晶，并指出“病毒”是一種蛋白質時，在學術界引起了熱議，因為這種“病毒”概念顛覆了很多人對生命和物質的認知。自我增殖被認為是只有生命才具有的屬性，如果作為化學物質的蛋白質確實具有這種屬性，那么生物與非生物的界限在哪里？

盡管對斯坦利的研究表示懷疑的人有很多，但很快就用事實修正斯坦利的研究結論的唯有英國的鮑登和皮里。鮑登和皮里1936年用無可爭辯的實驗數據證明，煙草花葉病毒中除含有大量的蛋白質外，還含有少量的RNA，只是他們當時并沒有意識到這種RNA才是病毒的遺傳物質。鮑登和皮里還從這種核酸蛋白質復合體具有各向異性推出，煙草花葉病毒應該是桿狀顆粒，而不是球狀顆粒。在電子顯微鏡的發(fā)明人、1986年諾貝爾物理學獎得主恩斯特·魯斯卡的弟弟哈爾墨特·魯斯卡的協(xié)助下，德國生物化學家考舍于1939年終于直接觀察到了煙草花葉病毒，并確認其為桿狀顆粒。不過，考舍給出的煙草花葉病毒的大小尺寸并不準確。

從最初斷定煙草花葉病毒為濾過性病原體，到終于看到這種濾過性病原體為一種亞微觀顆粒，人類整整用了41年。在這段時間里，很多科學家都為人類加深對病毒的理解做出了重要的貢獻。不可否認的是，這些科學家雖然在研究煙草花葉病毒的過程中都得出了一些符合事實的、有價值的結論，但是他們的論文或報告中也都存在著這樣或那樣的錯誤，要么實驗結果不完全符合事實，要么構建的病毒概念不完全正確。簡言之，沒有一篇論文或報告沒有錯誤，沒有一位科學家說得完全正確。至于沒有為加深對病毒的理解做貢獻，甚至對病毒概念的形成產生嚴重誤導的論文或報告則不計其數。如果當時的人們對這些論文或報告推崇備至，甚至將這些論文或報告的作者奉若神明，不僅不利于病毒概念的形塑，甚至會阻礙科學的發(fā)展。

倘若歷史上的絕大多數論文與報告都會或多或少地存在一些錯誤，每一位科學家都會不可避免地存在一些認識誤區(qū)，那么今人該如何看待科學認知，如何對待科學家？尤其是，今天的科學家會不會像100年前的科學家那樣，即使在自己的專業(yè)領域內也會頻頻出錯？顯然，迷信科學和盲從科學家并不能使我們更加接近真理，也無助于我們解決當下所面臨的諸多科技難題。懷疑的世界真理多，盲信的社會謬誤多?？茖W始于疑問，過去是如此，現(xiàn)在也應該是這樣。

通過回顧煙草花葉病毒的發(fā)現(xiàn)過程，我們還可以看到，科學的發(fā)展是累積性的，即使是重大發(fā)現(xiàn)通常也是由很多人共同完成的。因此，有必要在科學共同體內部建立平等對話和合作交流的機制。

只有充分發(fā)揚學術民主，建立平等對話的機制，才有可能使每一位科學家的真知灼見都不至于被埋沒，同時確保任何權威的認知盲點都不至于成為阻礙科學發(fā)展的絆腳石。真理越辯越明，在科學共同體內部，批評錯誤觀點和理論的方法不是壓制這種觀點和理論的傳播，而是提出一個更有競爭力的觀點和理論。

要建立合作交流機制，首先需要建立一套大家都能理解的話語體系，不能各說各話；其次需要搭建一批方便各國學者高效溝通的平臺，不能畫地為牢?？梢哉f，無論是德國學者、俄國學者，還是美國學者、英國學者，如果大家在研究煙草花葉病毒過程中，不是基于普遍主義立場行動，就不可能建立起那么龐大的“行動者網絡”，因而也就不可能形成那么強大的如實表征病毒本質的能力。

致謝

在成稿過程中，康奈爾大學科學技術論系胡萬亨博士曾幫助搜集部分研究資料，北京大學生命科學學院昌增益教授曾提出很多中肯的修改建議，特此一并致謝！

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What is Virus: A Historical Review of Discovery of the Tobacco Mosaic Virus

Zhou Cheng1, 2

(1. Department of Philosophy, Peking University, Beijing 100871, China;2. School of Health Humanities, Peking University, Beijing 100191, China)

In the years before the advent of electron microscopy, where the “germ”, as in the dominating germ theory of disease, was confined to bacteria, how did virus, which remained invisible, come to be known? How did people manage to identify something as “virus”? This article approached these issues by studying the intellectual history of science in the discovery of the tobacco mosaic virus (TMV), while remaining fully aware that scientific research has its limitations and that knowledge resulting from it could be wrong. Specifically, this article reviews eight milestone discoveries that gradually revealed the TMV: 1) tobacco mosaic disease was transmissible by inoculating healthy plants with sap from the leaves of diseased plants (Adolf Mayer); 2) the agent that causes the disease was filterable (Dmitri Ivanowsky); 3) the agent was(Martinus Beijerinck); 4) foot-and-mouth disease in cattle was caused by the “minutest organisms” (Friedrich Loeffler & Paul Frosch); 5) the infective entity of the tobacco mosaic disease was not(Ivanowsky); 6) the disease was caused by some particle that could multiply itself in cells (Benjamin M. Duggar); 7) crystallization showed TMV as a protein (Wendell Meredith Stanley); and 8) TMV turned out to be a rod-shaped aggregate of protein containing RNA.

Germ theory; TMV; scientific discovery; scientific concept; scientific spirit

2020–02–01;

2020–02–17

中國科學院學部咨詢項目( 2017ZWH016A–040)

周 程（1964–），男，博士，教授，研究方向為科學社會史、科學實踐哲學、創(chuàng)新管理與科技政策。E-mail: zhoucheng@pku.edu.cn

10.3724/SP.J.1224.2020.00092

N09

A

1674-4969(2020)01-0092-21