方貴楨， 胡立新， 黃國勇， 趙建亮， 應(yīng)光國

(華南師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院∥廣東省化學(xué)品污染與環(huán)境安全重點實驗室∥環(huán)境理論化學(xué)教育部重點實驗室，廣州 510006)

由于生活和生產(chǎn)的需求，中國的化學(xué)品生產(chǎn)量和使用量數(shù)目龐大，且仍保持日趨增多的趨勢. 但相應(yīng)的化學(xué)品行業(yè)管理制度和風(fēng)險防控措施不到位，許多化學(xué)品未經(jīng)有效處理就直接排放到環(huán)境中. 科學(xué)研究表明:工業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生廢氣、廢水、廢渣未經(jīng)處理后排放會導(dǎo)致土壤中的重金屬含量增加[1]；種植業(yè)化學(xué)品通過化學(xué)肥料、化學(xué)農(nóng)藥和農(nóng)膜的使用釋放到環(huán)境中[2]，導(dǎo)致環(huán)境中化學(xué)品污染及健康風(fēng)險問題日漸突出. 現(xiàn)階段，化學(xué)分析可以獲得環(huán)境樣品的種類和含量等信息，但不能準(zhǔn)確反映樣品的毒性以及評估這些化學(xué)品暴露引發(fā)的環(huán)境風(fēng)險[3]，為此，本文采用生物毒性測試來表征環(huán)境樣品的生物毒性及其生態(tài)風(fēng)險.

傳統(tǒng)的生物毒性試驗可以用的試驗生物包括藻類[4]、原生動物類[5]、魚類[6]、植物[7]和其他生物體，但這些受試生物大多需要特殊設(shè)備和專業(yè)操作人員、試驗周期長、重復(fù)率低，試驗生物標(biāo)準(zhǔn)化也備受爭議[8-9]. 而細菌，具有生物機體小、種群數(shù)量大、生長繁殖快、結(jié)構(gòu)簡單、對環(huán)境變化敏感等優(yōu)點，與傳統(tǒng)的生物毒性試驗相比，細菌毒性試驗可以在短時間內(nèi)對受試物的毒性進行評價，預(yù)測受試物的環(huán)境毒性，可操作性強. 發(fā)光細菌是一類可以自身發(fā)出藍綠色熒光的細菌，發(fā)光強度持續(xù)、穩(wěn)定，一旦遭遇到外界不利因素，如遇到有毒的物質(zhì)時，其發(fā)光強度會受到抑制，抑制的程度跟暴露環(huán)境中毒物的質(zhì)量濃度(毒性)大小有關(guān).

為了驗證基因重組發(fā)光菌在生物毒性測試中的可靠性，本研究采用微板測試法(MTA)，分別利用基因重組發(fā)光菌和費氏弧菌對8種重金屬化合物(ZnSO4、CuSO4、FeCl3、HgCl2、MnCl2、CdCl2、CoCl2和K2Cr2O7)進行生物毒性測試. 利用非線性擬合工具GraphPad Prism 4中Sigmoid函數(shù)和Matlab 的LS-SVM函數(shù)研究其劑量-效應(yīng)關(guān)系，計算其半數(shù)致死效應(yīng)質(zhì)量濃度，從而評價重金屬對基因重組發(fā)光菌和費氏弧菌的生物毒性. 進一步以基因重組發(fā)光菌為受試生物，比較了“綠色溶劑”(離子液體)和有機溶劑的毒性效應(yīng)，論證基因重組發(fā)光菌在生物毒性測試中的可行性.

1 研究方法

1.1 實驗材料

1.1.1 儀器與試劑 儀器：高速冷凍臺式離心機(Beckman， CA92821，美國)；多功能酶標(biāo)儀(BioTek，美國)、 震蕩培養(yǎng)箱(上海知楚，中國)；白色96微孔板(COSTAR，美國)；生物安全柜(上海博訊，中國)；高壓蒸汽滅菌器(Panasonic，日本)；不同量程的單、多通道移液器(Eppendorf，德國). 試劑：硫酸卡那霉素(Amresco，美國)；CuSO4(Sigma-Aldrich，美國)；ZnSO4·7H2O(AR，上海麥克林)；HgCl2(AR，貴州銅仁利祥)；FeCl3·6H2O、MnCl2·4H2O、CdCl2·2.5H2O、CoCl2·6H2O、K2Cr2O7均購買于天津市大茂化學(xué)試劑廠. 甲醇(HPLC級，德國)、無水乙醇、乙腈(HPLC級，美國)、二甲基亞砜(DMSO，HPLC級，上海麥克林)、丙酮(HPLC級，美國). 6種不同烷基鏈長度的離子液體(ILs)購買于中科院蘭州化學(xué)物理研究所.

1.1.2 測試菌株 采用的測試菌株是插入了luxCDABE基因的基因重組發(fā)光菌E.coliHB101 pUCD607[10](以下簡稱基因重組發(fā)光菌).Lux基因是海洋細菌費氏弧菌(Vibriofischeri)中與細菌生物發(fā)光相關(guān)的基因，將攜帶有該基因的pUCD607質(zhì)粒導(dǎo)入非發(fā)光細菌中，可使其穩(wěn)定表達lux基因. 只要代謝正常，菌株就可以持續(xù)產(chǎn)生生物發(fā)光. 當(dāng)菌株接觸到能夠影響其代謝活性的有毒物質(zhì)時，生物發(fā)光就會減弱. 生物發(fā)光受抑制的程度可以用適當(dāng)?shù)墓怆妭鞲衅鳈z測，從而推算毒物的毒性大小. 費氏弧菌來源于杭州綠潔水務(wù)科技股份有限公司，是海洋中一種革蘭氏陰性菌，由于細菌之間相互交流，啟動相關(guān)基因的表達而引起生物發(fā)光. 任何影響細胞代謝的作用都會導(dǎo)致其發(fā)光的減少，所以費氏弧菌被普遍作為環(huán)境測試指標(biāo)[11].

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度以重金屬離子來計算. 以ZnSO4·7H2O(Zn2+)為例，稱取439.83 mg的ZnSO4·7H2O加蒸餾水溶解，最后定容到100 mL，得到Zn2+儲備液的質(zhì)量濃度為1 g/L. 其他重金屬離子按照同樣的方法配制成1 g/L儲備液. 離子液體1-乙基-3-甲基咪唑氯鹽(IM-2)、1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽(IM-4)、1-己基-3-甲基咪唑氯鹽(IM-6)的儲備液的質(zhì)量濃度為200 g/L，1-辛基-3-甲基咪唑氯鹽(IM-8)的儲備液的質(zhì)量濃度為100 g/L，1-癸基-3-甲基咪唑氯鹽(IM-10)、1-十二基-3-甲基咪唑氯鹽(IM-12)的儲備液的質(zhì)量濃度為50 g/L,有機溶劑直接用純的試劑作為儲備液. 所有的儲備液均避光室溫保存.

1.2.2 基因重組發(fā)光菌試驗 含有30 μg/L硫酸卡那霉素的液體培養(yǎng)基的配制：稱取10 g胰蛋白胨、10 g NaCl、5 g酵母粉、1 g葡萄糖溶于1 000 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH到7. 然后121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min. 待培養(yǎng)基的溫度降到55 ℃時，加入100 μL 0.3 g/L的硫酸卡那霉素，搖勻備用.

基因重組發(fā)光菌的培養(yǎng)：從冰箱中取一瓶基因重組發(fā)光菌的凍干粉，加入0.5 mL 0.1 mol/L 的KCl溶液，放到搖床中(20 ℃、150 r/min)培養(yǎng)20 min，進行菌種的復(fù)蘇. 然后取200 μL菌液接種到50 mL之前準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基中，20 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h. 然后取100 μL培養(yǎng)了24 h的菌液接種到50 mL新的液體培養(yǎng)基中，20 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h.

以白色96微孔板為載體，基因重組發(fā)光菌E.coliHB101 pUCD 607為試驗生物，以相對發(fā)光單位為檢測信號，采用微板毒性分析法進行EC50的測定. 將96孔微板的第1列的6個孔加蒸餾水作為空白對照，第2～12列設(shè)計為化合物的11個質(zhì)量濃度梯度. A～F行為6個平行，每孔加入150 μL的樣品，用多通道移液器往每一列加入50 μL重新懸浮的基因重組發(fā)光菌. 由于試驗暴露的時間較短，基因重組發(fā)光菌受時間影響較大，酶標(biāo)儀掃描整塊微板中加有樣品的72孔時間為36 s，為了減少誤差，加入菌液的時間控制約36 s. 加入菌液開始計時，放到酶標(biāo)儀中軌道震蕩15 s，計時器到14 min 45 s，點擊酶標(biāo)儀的開始按鈕(酶標(biāo)儀有15 s的緩沖時間)，測定每一個微孔的相對發(fā)光單位. 舍棄發(fā)光值的最高值和最低值，計算出 4個空白發(fā)光值的平均值(I0)和樣品每個質(zhì)量濃度的平均值(I)，按公式(1)計算出不同物質(zhì)在不同質(zhì)量濃度下對基因重組發(fā)光菌的抑制率(E)[12]:

E=(I0-I)/I0×100%.

(1)

1.2.3 費氏弧菌試驗 費氏弧菌培養(yǎng)基的配制：稱取5 g蛋白胨、0.5 g酵母粉、3 mL甘油、30 g NaCl、6.10 g NaH2PO4·H2O、2.75 g KH2PO4·3H2O、0.204 g MgSO4·7H2O、0.5 g (NH4)2HPO4溶于1 000 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH到7，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min.

費氏弧菌的培養(yǎng)：取一瓶費氏弧菌凍干粉加入2 mL培養(yǎng)液室溫復(fù)蘇5 min，將其全部接種到50 mL費氏弧菌培養(yǎng)基中，20 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)36 h. 然后取200 μL菌液接種到新的培養(yǎng)基中，20 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)36 h，放到4 ℃冰箱備用. 在測試過程中，如果費氏弧菌的發(fā)光值超過酶標(biāo)儀的量程，用2%的NaCl進行稀釋.

將96微孔板的第1列的6個孔作為空白對照(直接用蒸餾水)，第2～12列設(shè)計為化合物的11個質(zhì)量濃度梯度. A～F行為6個平行，每孔加入150 μL的樣品，用多通道移液器從第1～12列的每一列加入20 μL 20%的NaCl調(diào)節(jié)滲透壓，然后加入30 μL費氏弧菌菌液. 后續(xù)的步驟與基因重組發(fā)光菌保持一致.

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)差異性分析在GraphPad Prism 4上進行，劑量-效應(yīng)曲線擬合中Sigmoid函數(shù)在GraphPad Prism 4上運行，LS-SVM函數(shù)在Matlab上運行.

2 結(jié)果與討論

2.1 毒性測試參照物驗證

現(xiàn)行發(fā)光菌毒性測試標(biāo)準(zhǔn)方法(GB/T 15441-1995)[13]是以汞離子為毒性參照，然而汞離子為高毒物質(zhì)，對環(huán)境和試驗操作人員有害. 近年來，研究人員經(jīng)多次篩選，發(fā)現(xiàn)鋅離子易溶、穩(wěn)定且對人和環(huán)境危害較小，作為陽性對照具有安全、穩(wěn)定等優(yōu)勢，因此建議選用鋅離子作為發(fā)光菌毒性測試陽性對照物質(zhì)[14].

為此，本試驗選取了上述2種離子作為陽性對照物質(zhì)，對比了其試驗效果. 從表1可知，鋅離子對基因重組發(fā)光菌的抑制敏感性(EC50)比汞離子大. 從圖1可以看出鋅離子的重現(xiàn)性更好，通過分析發(fā)現(xiàn)：鋅離子EC50的變異系數(shù)較小(16.79%)，說明鋅離子作為陽性對照物質(zhì)具有較好的穩(wěn)定性.

圖1 陽性對照物質(zhì)鋅離子對基因重組發(fā)光菌的毒性效應(yīng)

Figure 1 The toxic effects of positive control substance zinc ions on gen recombinant luminescent bacteria

2.2 基因重組發(fā)光菌毒性測試的靈敏度比較

為檢測基因重組發(fā)光菌毒性測試方法的靈敏度，本試驗選用環(huán)境中常見的8種重金屬(ZnSO4、CuSO4、FeCl3、HgCl2、MnCl2、CdCl2、CoCl2和K2Cr2O7)為目標(biāo)化合物，對其測試靈敏度進行比較.

以8種重金屬離子為目標(biāo)化合物，以費氏弧菌為受試生物進行毒性測試，用Boltzmann Sigmoidal函數(shù)對化合物質(zhì)量濃度與費氏弧菌發(fā)光抑制率進行擬合，得到上述重金屬離子對應(yīng)的EC50，如表1所示分別為1.978、17.860、5.214、0.150、47.370、18.290、2.898和11.980 mg/L. 以8種重金屬離子為目標(biāo)化合物，以基因重組發(fā)光菌為受試生物進行毒性測試，用Boltzmann Sigmoidal函數(shù)對化合物質(zhì)量濃度與基因重組發(fā)光菌發(fā)光抑制率進行擬合，得到上述重金屬離子所對應(yīng)的EC50分別為1.203、1.646、1.226、0.659、9.935、8.718、1.045和10.550 mg/L.

表1 8種重金屬對費氏弧菌和基因重組發(fā)光菌的劑量-效應(yīng)曲線擬合信息

注：a、b和c分別表示Boltzmann Sigmoidal的擬合參數(shù)，EC50表示半數(shù)效應(yīng)質(zhì)量濃度，R2表示相關(guān)系數(shù)的平方.

通過比較重金屬對費氏弧菌和基因重組發(fā)光菌的毒性作用，結(jié)果表明：以基因重組發(fā)光菌為受試生物的毒性測試結(jié)果(EC50)比費氏弧菌靈敏度更高. 如圖2所示，在銅離子、錳離子、鐵離子和鎘離子的毒性作用方面，基因重組發(fā)光菌和費氏弧菌EC50之間存在顯著性差異(P<0.05)，表明基因重組發(fā)光菌在毒性測試方面具有較高的靈敏度. 不同重金屬對同種細菌的毒性差異以及同種重金屬對不同細菌的毒性差異主要取決于以下3點: (1)受試生物的敏感性；(2)不同重金屬的生物可利用性；(3)重金屬離子毒性的表達能力，即與水中其它陰離子絡(luò)合能力[15].

圖2 8種重金屬對基因重組發(fā)光菌和費氏弧菌的毒性比較

Figure 2 The comparison of the toxicity of eight heavy metals to gene recombinant luminescent bacteria andVibriofischeri

2.3 應(yīng)用重組發(fā)光菌對有機溶劑和“綠色溶劑”進行毒性測試

離子液體是指在室溫或者室溫附近溫度下呈液體狀態(tài)的物質(zhì)，主要由陰離子和陽離子2部分構(gòu)成，具有蒸汽壓較低、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性較高、導(dǎo)電性較高、熱容量較大等特點[16]，與一般的有機溶劑相比，離子液體不具有揮發(fā)性，對大氣環(huán)境的影響很小. 基于這些特點，綠色化學(xué)的研究者認為：離子液體可作為揮發(fā)性有機溶劑的替代物. 然而，近年來有研究表明：離子液體的大規(guī)模使用也會對水環(huán)境造成很大的危害[17]. 鑒于此，本試驗比較了6種常用的有機溶劑和6種不同烷基鏈長度的離子液體對重組發(fā)光菌的毒性效應(yīng).

結(jié)果表明：6種有機溶劑對基因重組發(fā)光菌的毒性效應(yīng)中，只有甲醛對基因重組發(fā)光菌的劑量-效應(yīng)曲線是經(jīng)典的S-型曲線(圖3)，其他5種有機溶劑均存在hormesis效應(yīng)，與之前學(xué)者的研究結(jié)果一致[18-20]. 從毒性數(shù)據(jù)可以看出，相比之下二甲基亞砜的EC50最大(表2)，說明其對發(fā)光細菌的毒性最小. 甲醛對發(fā)光細菌的毒性效應(yīng)最大，EC50達到5.122 g/L(表2). 從甲醇對基因重組發(fā)光菌的毒性效應(yīng)可以看出，甲醇對基因重組發(fā)光菌的EC50為36.120 g/L，隨著暴露質(zhì)量濃度的降低，發(fā)光抑制率逐漸減小. 當(dāng)甲醇的暴露質(zhì)量濃度達到10.110 g/L時，隨著處理質(zhì)量濃度的降低，甲醇對基因重組發(fā)光菌產(chǎn)生刺激作用，在處理質(zhì)量濃度達到2.319 g/L時，刺激效應(yīng)最強(-65.36%). 乙醇、丙酮、二甲基亞砜和乙腈對發(fā)光菌的劑量-效應(yīng)曲線與甲醇類似，在較低劑量下均存在刺激效應(yīng). 其零點效應(yīng)質(zhì)量濃度分別為54.050、26.050、122.500、38.700 g/L，最大刺激效應(yīng)濃度為9.246、4.687、12.890、11.510 g/L(表2). 據(jù)報道，有機溶劑乙腈、甲醇、乙醇和丙酮對發(fā)光細菌-青海弧菌Q67的EC50值分別為36.530、71.730、79.630、46.580 g/L[18]，本研究的基因重組發(fā)光菌對于以上4種有機溶劑的EC50分別為47.880、36.120、52.140、10.270 g/L，相對于甲醇、乙醇、丙酮，基因重組發(fā)光菌比青海弧菌Q67靈敏性高，而相對于乙腈，青?；【鶴67靈敏性更高，可能是由2種菌自身的內(nèi)部條件所決定的，有待更進一步的研究.

關(guān)于有機溶劑在低劑量下對基因重組發(fā)光菌產(chǎn)生刺激作用，研究人員主要存在2種觀點：一種是有機溶劑在低劑量下誘導(dǎo)細胞內(nèi)NADH氧化酶，使細菌分裂加速，發(fā)光強度增加；另一種是低劑量下有機溶劑引起發(fā)光細菌DNA突變而影響發(fā)光[21].

表2 6種有機溶劑對基因重組發(fā)光菌的劑量-效應(yīng)曲線擬合信息

注：ZEC表示零效應(yīng)點質(zhì)量濃度，EC表示最大刺激效應(yīng)點質(zhì)量濃度，EC50表示半數(shù)效應(yīng)質(zhì)量濃度，R2表示相關(guān)系數(shù)的平方，表3同.

研究表明(圖4)：6種不同烷基鏈長度的咪唑氯鹽離子液體對重組發(fā)光細菌的毒性效應(yīng)中，IM-2在處理質(zhì)量濃度低于22.010 g/L時存在刺激效應(yīng)，隨著處理質(zhì)量濃度的降低，刺激效應(yīng)在4.687 g/L時達到最大. 其他5種離子液體對基因重組發(fā)光菌的劑量-效應(yīng)曲線均是經(jīng)典的S-型(圖4). 烷基鏈上碳原子個數(shù)從4～12，其相對應(yīng)的EC50分別為9.131、0.219、0.012、0.024和0.016 g/L(表3).

隨著咪唑氯鹽離子液體烷基鏈長度的增加，其毒性效應(yīng)存在增加的趨勢，表現(xiàn)出明顯的烷基鏈-效應(yīng)關(guān)系. 通過對烷基鏈上碳原子個數(shù)與其對應(yīng)的EC50進行分析，可以發(fā)現(xiàn)烷基鏈-效應(yīng)關(guān)系符合S-型曲線，且呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性(R2=1.000). 研究表明:離子液體隨著烷基鏈長度的增加，對大腸桿菌的存活率的影響越來越大，離子液體能夠損傷細胞膜，影響細胞膜的通透性，使得胞內(nèi)細胞器和生物大分子外泄，從而抑制細菌的生長[22].

圖4 6種不同烷基鏈長度離子液體對基因重組發(fā)光菌的劑量-效應(yīng)曲線

表3 6種離子液體對基因重組發(fā)光菌的劑量-效應(yīng)曲線擬合信息

綜上所述，通過對咪唑氯鹽離子液體和常見有機溶劑進行EC50比較發(fā)現(xiàn):有機溶劑的EC50比離子液體的值大(P<0.05)，說明離子液體對發(fā)光菌的毒性顯著高于有機溶劑(圖5)，具有較強的毒性作用. 作為有機溶劑替代物的“綠色溶劑”可能存在潛在的環(huán)境風(fēng)險.

圖5 有機溶劑和離子液體對基因重組發(fā)光菌的毒性比較

Figure 5 The comparison of toxicity of organic solvents and ionic liquids to gene recombinant luminescent bacteria

3 結(jié)論

(1)因鋅離子對環(huán)境污染較小以及穩(wěn)定性較高，基因重組發(fā)光菌毒性測試以鋅離子代替汞離子作為陽性對照，具有一定的可行性.

(2)通過對基因重組發(fā)光菌和費氏弧菌毒性測試靈敏度的比較發(fā)現(xiàn)，基因重組發(fā)光菌具有較高的靈敏度和穩(wěn)定性.

(3)通過對咪唑氯鹽離子液體和常見有機溶劑進行EC50比較發(fā)現(xiàn)，離子液體對基因重組發(fā)光菌的毒性效應(yīng)顯著高于常用有機溶劑.