宋利娜，劉沂霖，任 銳，蘇 雙，尹榮蘭*

1.吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，吉林長春 130062；2.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林長春 130062

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）引起的急性傳染病，其典型病癥為急性腸胃炎、水樣腹瀉、嘔吐等，可在各年齡階段的豬中傳播，在仔豬中的死亡率高達100%，2010年底中國大面積爆發(fā)急性豬流行性腹瀉造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，2013年首次在美國報道，一年內(nèi)造成800萬頭仔豬病死，并迅速傳至加拿大和墨西哥，隨后PEDV在亞洲其他國家爆發(fā)，如韓國、日本。

PEDV屬于冠狀病毒屬α冠狀病毒科，PEDV基因組為約28kb的單股正鏈RNA，包括5’帽子和3’poly尾巴，5’UTR和3’UTR及7個開放閱讀框（ORF1a，ORF1b和ORF2-6），ORF1a翻譯成復(fù)制酶多蛋白復(fù)合物，而ORF1b是通過一個核糖體移位（1 ribosomal frame shift， RFS）表達的，最終將ppla延伸到pp1ab。四個結(jié)構(gòu)蛋白（纖突蛋白S、囊膜蛋白E、膜蛋白M和核衣殼蛋白N）和16個非結(jié)構(gòu)蛋白（nsp1-16），S蛋白與宿主靶細(xì)胞受體結(jié)合介導(dǎo)病毒入侵和誘導(dǎo)中和抗體。S蛋白還與體外復(fù)制適應(yīng)性和體內(nèi)PEDV毒力減弱有關(guān)。S基因編碼的S蛋白由兩個結(jié)構(gòu)域S1和S2組成，其中S1與宿主細(xì)胞受體的相互作用與感染細(xì)胞相關(guān)。

病毒在感染和復(fù)制過程中，先天免疫作為免疫應(yīng)答的第一道防線，以防止感染的擴散，并幫助啟動適應(yīng)性免疫反應(yīng)，最終將病毒從宿主體內(nèi)清除。它涉及多種機制，包括IFNs、炎性細(xì)胞因子、凋亡、自噬等。其中干擾素作為宿主免疫防御病毒感染最主要的細(xì)胞因子，在協(xié)助病毒逃逸起到重要作用。

然而PEDV感染可抑制干擾素的表達，PEDV通過抑制TBK1、降解STAT1、阻礙NF-κB、IRF3及IRF1核移位、干擾RIG-I/STING泛素化等信號通路等方式，干擾IFN表達或其功能發(fā)揮，從而協(xié)助病毒免疫逃逸。本文主要闡述PEDV免疫逃逸中IFN應(yīng)答機制研究，旨在為PEDV的疫苗和新型抗病毒藥物研究提供思路。

1 干擾素應(yīng)答概述

1.1 干擾素分型

眾所周知干擾素根據(jù)受體不同可分為三種類型：I型干擾素(IFNα/β)，II型干擾素(IFN-γ)，III型干擾素(IFN-λ)，I型干擾素的IFNα有13個 亞 型，IFNβ、IFNε、IFNκ、IFNω。II型 干擾素在豬中只報道了一個亞型IFN-γ，它可以產(chǎn)生很多免疫細(xì)胞，III型干擾素包括IFN-λ1 (IL-29)，IFN-λ2 (IL-28A)， IFN-λ3 (IL-28B)和IFN-λ4。

1.2 干擾素受體

不同類型的干擾素信號依賴于不同的受體。IFNα/β依 賴 于IFN-α受 體1(IFNAR1)和(IFNAR2)異源二聚體復(fù)合物，此受體在所有有核細(xì)胞中均表達。IFN-γ通過IFN-γ受體（IFNGR）形成同源二聚體復(fù)合物，IFN-λ通過白介素受體2（IL10R2）和IFN-λ受體1（IFNLR1）形成的異源二聚體傳遞信號，IL10R2廣泛分布于不同類型的細(xì)胞中，但是IFNLR1只局限于上皮細(xì)胞中，所以IFN-λ介導(dǎo)的抗病毒功能局限于上皮細(xì)胞內(nèi)。PEDV感染豬小腸上皮細(xì)胞，小腸上皮細(xì)胞表面是宿主抵御腸道病毒感染的第一道防線。由于腸上皮黏膜表面的這種特點，IFN誘導(dǎo)和信號通路在腸黏膜表面是特有的。

2 PEDV抑制干擾素應(yīng)答

2.1 PEDV結(jié)構(gòu)蛋白抑制干擾素應(yīng)答途徑

PEDV抑制干擾素產(chǎn)生，具有逃避宿主IFN免疫應(yīng)答的能力。最新研究發(fā)現(xiàn)，PEDV至少有11種病毒蛋白抑制IFN產(chǎn)生。PEDV蛋白中，ORF3、E、M、N、nsp1、nsp3、nsp5、nsp8、nsp14、nsp15、nsp16通過抑制TBK1、降解STAT1、阻礙NF-κB、IRF3及IRF1核移位、干擾RIG-I/STING泛素化等不同的信號通路抑制IFN活性。

冠狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白拮抗病毒干擾素的方式不盡相同，Yang等研究發(fā)現(xiàn)PEDV S蛋白通過JAK2-STAT3通路誘導(dǎo)表皮生長因子受體EGFR激活從而增強和促進PEDV的復(fù)制。

冠狀病毒的N蛋白結(jié)合RNA，在病毒組裝時將病毒基因組RNA包裹在病毒顆粒的核衣殼中，保護病毒基因組。PEDV基因組編碼的20種蛋白中，N蛋白是含量最多的蛋白，參與病毒基因組織、病毒裝配、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)、宿主應(yīng)激反應(yīng)等。

PEDV N蛋白已被確定為干擾素拮抗劑，通過 阻 礙IRF3和NF-κB激 活 從 而 抑 制IFN-β和ISGs的表達。PEDV N蛋白通過抑制TBK1及其上游RIG-I、MDA-5、VISA和TRAF3從而抑制IFN-β啟動子的激活。進一步的實驗證實，N直接與TBK1相互作用，阻斷了TBK1與IRF3之間的關(guān)聯(lián)，從而抑制了TBK1誘導(dǎo)的IRF3磷酸化和IFN-β的產(chǎn)生。N蛋白通過阻斷NF -κB核移位抑制 poly(I:C)誘導(dǎo)的IFN-λ3的生產(chǎn)，但在IPEC-J2細(xì)胞，不影響poly(I:C)誘導(dǎo)的I型和II型干擾素的生產(chǎn)。

最近的研究表明，SARS-CoV N蛋白通過抑制TRIM25介導(dǎo)的RIG-I泛素化來抑制I型IFN的產(chǎn)生。MERS-CoV N蛋白還通過與TRIM25相互作用阻斷IFN的產(chǎn)生。此外，MHV和SARS-CoV N蛋白均干擾蛋白激酶R (PACT)的細(xì)胞蛋白激活劑功能，該蛋白可與RIG-I和MDA5結(jié)合，激活I(lǐng)FN的產(chǎn)生，從而拮抗I型IFN信號傳導(dǎo)。

2.2 PEDV非結(jié)構(gòu)蛋白抑制干擾素應(yīng)答途徑

PEDV蛋白中，非結(jié)構(gòu)蛋白nsp1是最有效的IFN拮抗劑，nsp1可以調(diào)節(jié)IRF1抑制IFN-λ抗病毒作用，進一步研究表明nsp1不影響IRF3的磷酸化和核易位，而是通過IRF3和CBP相互作用，依賴蛋白酶體降解CBP，從而抑制IFN啟動子激活。

NF-κB的激活對于I型干擾素的生產(chǎn)、促炎細(xì)胞因子、抑制病毒感染至關(guān)重要。然而PEDV nsp1干擾NF-κB激活，它能抑制IκBα的磷酸化和降解，并阻礙p65核移位，從而抑制干擾素和促炎細(xì)胞因子的早期生產(chǎn)。

PEDV nsp1阻斷IRF1的核移位，減少過氧化物酶體的數(shù)量，進而抑制IRF1介導(dǎo)的III型IFNs。PEDV nsp1蛋白的保守殘基對IFN的抑制至關(guān)重要。nsp1在PEDV感染過程中調(diào)節(jié)先天免疫應(yīng)答的多重作用表明，nsp1在PEDV復(fù)制周期中發(fā)揮重要作用。

PEDV nsp3中的木瓜蛋白酶2(PLP2)具有去泛素酶(deubiquitinase，DUB)活性，可以使細(xì)胞質(zhì)K48和K63連接的聚泛素化鏈去泛素化。α-冠狀病毒和β-冠狀病毒的nsp3的PLP2與K48和K63的去泛素化都有關(guān)系。SARS-CoV PLP2可降低STING-TRAF3-TBK1復(fù) 合 物 中RIG-1、STING、TRAF3、TBK1和IRF3泛 素 化 水 平，抑 制I型 干擾素信號通路。同樣，PEDV PLP2與去泛素化的RIG-I和STING相互作用，拮抗IFN反應(yīng)。同樣，PEDV上調(diào)MDM2表達，下調(diào)p53，顯著抑制IRF7表達，提示PEDV PLP2也可能靶向p53通路，逃避先天免疫，抑制p53依賴性的細(xì)胞凋亡。

PEDV的nsp5蛋白是一種3c樣蛋白酶，已被證明可以抑制IFN產(chǎn)生。nsp5的半胱氨酸酶活性裂解NEMO，NEMO是NF-κB通路的調(diào)節(jié)因子，它的裂解阻礙了RIG-1/MDA5信號通路。在PDCoV 感染中nsp5通過裂解STAT2拮抗I型IFN信號通路。

有報道稱nsp7抑制STAT1和STAT2誘導(dǎo)的ISRE激 活。Nsp7與KPNA1競 爭，KPNA1是 介 導(dǎo)ISGF3核移位的適配器，與STAT1一起阻止ISGF3核轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致IFN信號受抑制。而STAT1和STAT2的表達和磷酸化不受PEDV nsp7的影響。

PEDV nsp16負(fù)調(diào)控RLR介導(dǎo)的信號通路激活，抑制IFN刺激的IFIT家族成員(IFIT1、IFIT2、IFIT3)的表達，進而促進PEDV復(fù)制。

PEDV 非結(jié)構(gòu)蛋白推測其在先天免疫逃避方面與人冠狀病毒具有類似的功能，結(jié)果有待實驗驗證。

3 結(jié)語

至今，豬流行性腹瀉雖然在大范圍內(nèi)得以控制，但其最近流行的毒株仍未有有效疫苗預(yù)防，PEDV主要的傳播方式為口糞傳播，豬群一經(jīng)感染，傳播速度快，防治難，在最近研究中，發(fā)現(xiàn)PEDV感染宿主靶細(xì)胞后IFN表達下降，主要表現(xiàn)在抑制I干擾素和III干擾素產(chǎn)生，PEDV的11種蛋白均可以通過抑制或激活不同的蛋白拮抗干擾素的產(chǎn)生，通過抑制TBK1、降解STAT1、阻礙NF-κB、IRF3及IRF1核移位、干擾RIG-I/STING泛素化等信號通路等方式，從而幫助病毒逃避先天免疫中。

參考文獻：略