王爍程，任清丹，陶晨璐，孫 旭

1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉林省畜牧總站，吉林長(zhǎng)春 130051

結(jié)核病是由分枝桿菌感染引起的一種人畜共患慢性傳染病。牛結(jié)核病在我國(guó)被歸類為二類動(dòng)物疫病，據(jù)調(diào)查：山東省2012 年規(guī)模化奶牛場(chǎng)牛結(jié)核病陽(yáng)性率為14.93%；河南省2018 年規(guī)?；膛?chǎng)牛結(jié)核病陽(yáng)性率為8.55%。說(shuō)明我國(guó)的牛結(jié)核病疫情形勢(shì)嚴(yán)峻，給畜牧業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失?；疾∨?huì)形成肺空洞并與支氣管相連，其呼吸道分泌物產(chǎn)生氣溶膠引發(fā)感染。除此之外，患病動(dòng)物體內(nèi)各個(gè)器官均有病灶，病原菌通過(guò)污染飼料、牛奶、飲水、糞便、尿液在其他動(dòng)物之間傳播，因此MTB感染在梅花鹿、馴鹿、豬、猴等動(dòng)物中也常有發(fā)生[3]。隨著人民生活水平的不斷提高，人們對(duì)新鮮牛奶的需求加大，促使我國(guó)的奶牛飼養(yǎng)規(guī)模逐年升高。然而我國(guó)的奶牛飼養(yǎng)目前仍以小規(guī)模農(nóng)場(chǎng)飼養(yǎng)為主，由于MTB 對(duì)外界環(huán)境具有較強(qiáng)的抵抗力，在土壤中可存活7 個(gè)月，奶中存活90 d，因此衛(wèi)生條件差，飼養(yǎng)密度大，飼養(yǎng)管理不良，牛舍潮濕，防疫措施欠缺的飼養(yǎng)環(huán)境易引起牛結(jié)核病的發(fā)生。

感染MTB 的病牛在感染初期時(shí)，可能不出現(xiàn)臨床癥狀，通常呈慢性經(jīng)過(guò)。進(jìn)入活動(dòng)期后，病牛常發(fā)肺結(jié)核，出現(xiàn)易疲勞、逐漸消瘦等癥狀，同時(shí)結(jié)核結(jié)節(jié)與干酪樣鈣化病灶會(huì)出現(xiàn)在多種組織器官上。有的病牛肩前、股前、頜下等體表淋巴結(jié)腫大?？v隔淋巴結(jié)腫大后，壓迫食道，會(huì)出現(xiàn)慢性脹氣癥狀。病勢(shì)惡化后，可能引發(fā)全身性結(jié)核。此外多數(shù)病牛乳房常被MTB 感染侵害，泌乳量減少，乳汁稀薄。生殖器官結(jié)核會(huì)出現(xiàn)性機(jī)能紊亂，發(fā)情頻繁，孕畜流產(chǎn)等現(xiàn)象，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)危害極大。目前牛結(jié)核病的診斷普遍采用結(jié)核菌素（PPD）試驗(yàn)和間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。PPD 的優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便，但其是MTB 的純蛋白衍生物，可能存在交叉反應(yīng)。而ELISA 在檢測(cè)時(shí)如果病原菌的抗原性較弱，則檢測(cè)的準(zhǔn)確率會(huì)受到影響。本文將對(duì)目前研究較少但在MTB 血清學(xué)診斷方面具有潛在價(jià)值的MTB 保護(hù)性抗原蛋白的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。以期對(duì)牛結(jié)核病診斷方面的研究提供參考。

1 PE/PPE 家族

PE 和PPE 是MTB 抗原中兩個(gè)不同家族的蛋白，但卻有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系，均富含脯氨酸（Pro）和谷氨酸（Glu），目前研究證實(shí)PE 家族蛋白只存在于致病MTB 中，推測(cè)該家族蛋白可能與免疫逃逸（病原體通過(guò)其結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)產(chǎn)物，拮抗、阻斷和抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答）相關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)PE/PPE 家族蛋白表達(dá)于細(xì)胞表面，這說(shuō)明該類蛋白在MTB 與宿主的相互作用中發(fā)揮重要功能。PE 家族主要可以分為兩大類：PE 亞家族和PE_PGRS 亞家族。PE 家族都具有由110 個(gè)氨基酸殘基組成的N 端結(jié)構(gòu)域，而PPE 亞家族又分為四個(gè)亞族。其中PE25蛋白（Rv2431c）和PPE41（Rv2430c）由一個(gè)操縱子編碼共同轉(zhuǎn)錄，當(dāng)PE35 和PPE41 分別在大腸桿菌工程菌中重組表達(dá)時(shí)，二者均為包涵體沉淀，而共同表達(dá)時(shí)則形成可溶二聚體，說(shuō)明兩個(gè)家族蛋白間存在相互協(xié)作。PE 家族主要蛋白如PE7 蛋白（Rv0916c）、PE11 蛋白（Rv1169c）、PE22 蛋白（Rv2107）、PE25 蛋白（Rv2431c）均不位于RD區(qū)，且都不是H37Rv 體外生長(zhǎng)所必需的，僅PE35（Rv3872）蛋白和PPE68（Rv3873）蛋白位于RD1 區(qū)。皮下注射MTB H37Rv 感染C57BL/6 小鼠三周后檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)PPE68、PE35 蛋白多肽反應(yīng)產(chǎn)生的INF-γ 水平，發(fā)現(xiàn)PPE68 的免疫原性要高于PE35。眾所周知，RD1 區(qū)是目前MTB 基因組研究較深入的區(qū)域，其中的CFP-10（Rv3874）和ESAT-6（Rv3875）一直被認(rèn)為是MTB 最重要的兩個(gè)保護(hù)性抗原，而對(duì)于PE35 蛋白的研究卻呈現(xiàn)出完全相反的觀點(diǎn)，有研究認(rèn)為PE35 蛋白與CFP-10 和ESAT-6 相比僅具有較弱的血清學(xué)反應(yīng)，但也有相關(guān)研究認(rèn)為PE35 蛋白相比CFP-10 和ESAT-6有更強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)。PE35 蛋白作為抗原會(huì)出現(xiàn)如此相反的結(jié)論，推測(cè)可能是因?yàn)镻E 家族蛋白是表達(dá)于細(xì)胞表面，MTB 在感染和生長(zhǎng)的不同時(shí)期通過(guò)調(diào)節(jié)PE 蛋白的表達(dá)與宿主相互作用，在不同時(shí)期表達(dá)量的差異影響了其在免疫反應(yīng)中的作用強(qiáng)弱；另一方面，通過(guò)對(duì)PE/PPE 蛋白的抗原表位進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，不同菌株BCG 中的PE/PPE 基因家族編碼的抗原表位會(huì)發(fā)生基因水平的變異。由此看來(lái)，PE/PPE 家族蛋白在作為抗原檢測(cè)MTB方面可能存在穩(wěn)定性不足的缺點(diǎn)。實(shí)際上，目前對(duì)于PE/PPE 系列蛋白的研究尚淺，對(duì)于該系列的大部分蛋白的功能有很多假說(shuō)，如PE11（Rv1169c）可能具有能量供應(yīng)方面的功能；PPE46（Rv3018c）功能尚不清楚，可能是MTB 的毒力因子；PPE55（Rv3347c）能在H37Rv 感染后30 d 的豚鼠肺中檢出，但不是H37Rv 生長(zhǎng)所必需。通過(guò)對(duì)PE35、PPE68 在血清學(xué)診斷方面的結(jié)果來(lái)看，PE/PPE 家族系列蛋白可能成為用于TB 診斷的新抗原。

2 RD 區(qū)蛋白

2.1 RD4 區(qū)蛋白

在MTB 的16 個(gè)RD 區(qū)中，RD4 區(qū)僅有3 個(gè)基因（Rv0221、Rv0222、Rv0223c），且該區(qū)域在BCG和牛分枝桿菌中均缺失，說(shuō)明該區(qū)域基因有區(qū)分鑒別牛分枝桿菌和MTB 的價(jià)值，但在蛋白方面Rv0221編碼的蛋白為甘油三酯酶，其參與甘油三酯的合成；Rv0223c 編碼的蛋白為乙醛脫氫酶催化乙醛脫氧生成乙酸，二者均不是MTB 生長(zhǎng)所必需的基因，也不具備血清學(xué)診斷價(jià)值，僅適用于膠體金等分子生物學(xué)診斷方法。而有研究發(fā)現(xiàn)，Rv0222 蛋白（又稱echA1 蛋白）具有較高的血清學(xué)診斷價(jià)值，且不受人類免疫缺陷癥（Human Immunodeficiency Virus,HIV）患者的影響（目前HIV 患者合并TB現(xiàn)象會(huì)直接降低PPD 和痰菌的陽(yáng)性率）。在利用Rv0222/ESAT-6 融合蛋白檢測(cè)HIV 陽(yáng)性的TB 患者的發(fā)現(xiàn)，該融合蛋白的檢出率達(dá)到了61%，說(shuō)明Rv0222/ESAT-6 融合蛋白在診斷HIV 陽(yáng)性TB 患者方面有很高的敏感性。

2.2 RD5（Rv3117）

通過(guò)測(cè)定不同濃度的Rv3117 蛋白刺激TB 患者釋放IFN-γ 水平顯示，重組Rv3117 蛋白并不能刺激患者產(chǎn)生IFN-γ，其并沒有血清學(xué)診斷價(jià)值，但Rv3117 基因僅存在于致病性MTB 中，兩者對(duì)于MTB 的致病性研究具有一定意義。

2.3 RD6（Rv1515c、Rv1508c）

Rv1515c 屬于MTB 中的一個(gè)保守基因，定位在細(xì)胞壁。研究發(fā)現(xiàn)Rv1515c 蛋白能夠提高恥垢分枝桿菌的環(huán)境耐受力，提高其在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活率，Rv1515c 基因會(huì)下調(diào)IL-6、IL-10、TNF-α的mRNA 水平，而IL-10、TNF-α 是分枝桿菌肉芽腫形成的關(guān)鍵因子。說(shuō)明Rv1515c 蛋白與MTB在體內(nèi)肉芽腫的形成相關(guān)，并且參與MTB 的微環(huán)境調(diào)控，但作用機(jī)制尚不明確。對(duì)RD6 區(qū)另一個(gè)基因Rv1508c 研究發(fā)現(xiàn)，該基因只存在于H37Rv 和H37Ra 中，并且該基因會(huì)促使MTB 對(duì)鏈霉素敏感，強(qiáng)化鏈霉素對(duì)MTB 的殺傷作用，說(shuō)明該基因有增強(qiáng)抗結(jié)核藥物敏感性的潛力。

2.4 RD9 區(qū)（Rv3619c）

Rv3619c 蛋白由位于RD9 區(qū)的Rv3619c 基因編碼，通過(guò)對(duì)PE35、PPE68、CFP-10、ESAT-6、Rv 3619c 五種蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，這五種蛋白均能誘發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)（delayed type hypersensitivity,DTH），但PE35、PPE68、CFP-10、ESAT-6 僅在MTB 組中引起DTH 陽(yáng)性反應(yīng)，而Rv3619c 在MTB和BCG 組中均能引起DTH 陽(yáng)性反應(yīng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Rv3619c 蛋白會(huì)與Rv3620c 蛋白形成異源二聚體復(fù)合物，其結(jié)構(gòu)與ESAT-6-CFP-10 的復(fù)合物結(jié)構(gòu)類似，并且在酸性環(huán)境中不穩(wěn)定。使用Rv3619c 重組蛋白注射小鼠發(fā)現(xiàn)，IFN-γ、IL-2、IgG 水平均升高，說(shuō)明發(fā)生了Th1 反應(yīng)，證明Rv3619c 有成為亞單位疫苗的候選物的潛力。

2.5 RD11 區(qū)蛋白（Rv3425、Rv3426、Rv3429）

PPE57(Rv3425）、PPE58（Rv3426）、PPE59（Rv3429）蛋白是前文所提到的P P E 家族蛋白，編碼這三個(gè)蛋白的基因均位于RD11 區(qū)，且這三個(gè)基因在BCG 和環(huán)境分枝桿菌中均缺失，都不是MTB H37Rv 體外生長(zhǎng)所必需，說(shuō)明這三個(gè)蛋白可能與致病性相關(guān)。重組PPE57 蛋白應(yīng)用ELISPOT 檢測(cè) 活動(dòng)性TB 的靈敏度為59%，其能夠誘導(dǎo)強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫，且能夠區(qū)分BCG 免疫者。與PPE57 蛋白相似，重組PPE58 和PPE59 蛋白在血清學(xué)診斷方面均具有較高的靈敏度，在區(qū)分BCG 免疫著方面均具有較高的特異性，說(shuō)明以上三個(gè)蛋白在提高PPD 檢測(cè)準(zhǔn)確率方面具有潛在價(jià)值。

2.6 RD12（Rv2074）

目前對(duì)于RD12 區(qū)蛋白研究較少，一般認(rèn)為RD12、RD13 區(qū)的蛋白可能和TB 的發(fā)病機(jī)理相關(guān)。有研究對(duì)RD12 區(qū)的Rv2074 蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白的晶體結(jié)構(gòu)與大腸桿菌和人的磷酸吡哆醇氧化酶（pyridoxine 5’-phosphate oxidase,PNPO）具有廣泛相似性，說(shuō)明Rv2074 可能參與維生素B6的合成。通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測(cè)血清抗體發(fā)現(xiàn)，Rv2047 蛋白在TB 患者和健康對(duì)照組中并無(wú)顯著差異，說(shuō)明該蛋白不具備血清學(xué)診斷價(jià)值。

2.7 RD13 區(qū)（Rv2645）

有研究對(duì)RD10 ～14 區(qū)的22 個(gè)蛋白的進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，RD13 區(qū)Rv2645 基因編碼的Rv2645 蛋白在免疫小鼠脾細(xì)胞48 h 后，能夠產(chǎn)生能夠產(chǎn)生較高水平的IFN-γ。用該蛋白刺激TB 患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）發(fā)現(xiàn)，在TB 病人中產(chǎn)生的IFN-γ 又高于健康人，并且Rv2645 能夠引發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)，能夠區(qū)分iH37Rv 預(yù)免疫小鼠和BCG 小鼠，說(shuō)明其能夠區(qū)分BCG 免疫和TB 感染人群，而目前PPD 不具備此區(qū)分功能，說(shuō)明該蛋白有提高PPD 診斷效果的價(jià)值。

2.8 RD16（Rv3403c）

通過(guò)對(duì)RD16 區(qū)Rv3403c 編碼的Rv3403c 蛋白進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，Rv3403c 蛋白具有良好的T 抗原優(yōu)勢(shì)表位，該蛋白能使BALB/C 小鼠產(chǎn)生特異性INF-γ，且分泌量顯著高于對(duì)照組，并且能誘導(dǎo)高水平IgG 的產(chǎn)生，說(shuō)明其有很大潛力用來(lái)防止MTB的感染。

3 熱休克蛋白

熱休克蛋白（heat shock protein, HSP），是細(xì)胞在某些應(yīng)激條件下表達(dá)的一類蛋白。HSP 是生物體最古老的一種分子，在各種生物體中均存在該蛋白，且高度保守，并且是一種能夠被免疫系統(tǒng)識(shí)別的重要抗原。

目前發(fā)現(xiàn)HSP16.3 是MTB 潛伏期表達(dá)的主要蛋白之一，其具有抗凋亡的功能，對(duì)于MTB 的生存起調(diào)節(jié)作用。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在MTB 的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期檢測(cè)不到HSP16.3；在穩(wěn)定生長(zhǎng)期其被大量誘導(dǎo)表達(dá)。當(dāng)MTB 進(jìn)入巨噬細(xì)胞后，HSP16.3 的表達(dá)量明顯增加；在敲除Rv2031c 基因后的突變株的生長(zhǎng)情況并未受到影響，但突變株不能在巨噬細(xì)胞中生長(zhǎng)，說(shuō)明HSP16.3 蛋白并不MTB 正常生長(zhǎng)所必須的，該蛋白的主要作用是保證MTB 在宿主免疫系統(tǒng)的攻擊下存活。在MTB 的潛伏感染期間，Rv2031c能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-10，IL-10 通過(guò)抑制T 細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，來(lái)阻斷巨噬細(xì)胞活化，使MTB 在巨噬細(xì)胞中存活。用表達(dá)HSP16.3 的DNA 疫苗免疫BALB/c小鼠，使用 MTB H37Rv攻毒后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，HSP16.3 誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ 水平為對(duì)照組的4.8倍。目前對(duì)于MTB 的潛伏期檢測(cè)尚沒有良好的方法，該蛋白的發(fā)現(xiàn)對(duì)于明確MTB 潛伏期感染的免疫逃逸機(jī)制及其干預(yù)巨噬細(xì)胞凋亡的途徑具有重要意義。

除HSP16.3 外HSP60、HSP65、HSP70 也是MTB的重要免疫學(xué)成分，HSP 系列蛋白其編碼的基因用于制備DNA 疫苗，其抗MTB 感染的免疫保護(hù)力與BCG 相當(dāng)，但該類蛋白在不同物種中均存在，且高度保守，用于制備亞單位疫苗可能具有一定危險(xiǎn)性。

4 非RD 區(qū)蛋白-RV1419

目前接種BCG 是目前TB 防控的基礎(chǔ)手段，然而BCG 屬于減毒活疫苗，其接種效果受個(gè)體差異和BCG 菌株來(lái)源影響，所以目前基因重組BCG 和DNA 疫苗的研究開始受到重視。通過(guò)構(gòu)建表達(dá)MTB Rv1419 抗原的DNA 疫苗（pVAX1-Rv1419）以兩周為間隔三次免疫正常小鼠和TB 模型小鼠，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中小鼠血液中的CD4+T 細(xì)胞比例升高，主要發(fā)生Th1 免疫，且實(shí)驗(yàn)組中的肺和脾中的活菌低于對(duì)照組，肺部的病理變化明顯較少，pVAX1-Rv1419 DNA 能夠有效治療TB，抑制MTB 的生長(zhǎng)。相對(duì)于血清學(xué)檢測(cè)效果明顯的CFP-10、ESAT-6，Rv1419 也是目前研究較少的一種蛋白，通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白可能為凝集素樣分子（一種能凝集紅血球的糖蛋白或結(jié)合糖蛋白），凝集素的特點(diǎn)是其能識(shí)別糖蛋白中復(fù)雜的碳水化合物的結(jié)構(gòu)，即細(xì)胞膜表面的糖基，且一種凝集素只對(duì)一種糖基專一性結(jié)合，其在固有免疫中，尤其是宿主與病原體的相互作用中起重要作用。由此說(shuō)明Rv1419 蛋白應(yīng)該具有較好的免疫原性。通過(guò)對(duì)Rv1419 蛋白的抗原表位預(yù)測(cè)也證實(shí)，該蛋白具有較多的T 細(xì)胞抗原表位，同時(shí)也存在著B 細(xì)胞抗原表位。利用38kDa-Rv1419 重組蛋白檢測(cè)TB 感染者中抗38kDa-Rv1419 抗體發(fā)現(xiàn)，TB 感染組的抗體水平（22 979.1±63 846.9）明顯高于非TB 組（22 987±5024.3），而在血清學(xué)檢測(cè)的靈敏度上38kDa-Rv1419（63.2%）也明顯高于痰涂片（16.2%）。由此可見，Rv1419 蛋白在抗MTB 感染的免疫應(yīng)答中起著重要作用，其可能成為TB 血清學(xué)檢測(cè)的新型候選抗原。

5 目前研究較成熟的蛋白ESAT6/CFP10

CFP-10 和ESAT-6 是目前在研究最深入的兩種蛋白，分別由RD-1 區(qū)Rv3874 和Rv3875 共同轉(zhuǎn)錄表達(dá)，形成緊密的CFP10-ESAT6 復(fù)合物。

其中ESAT-6蛋白不僅存在于早期培養(yǎng)濾液中，還存在于細(xì)胞漿和細(xì)胞壁。通過(guò)PCR、Western blot、Southern 雜交等方法進(jìn)行研究，表明ESAT-6 僅存在于致病性分枝桿菌中，而所有卡介苗菌株和大部分非致病性分枝桿菌的基因組都缺失該基因，不表達(dá)該蛋白，其很有可能具有分枝桿菌的特異功能。吳雪瓊等用ESAT-6 純化蛋白和PPD 作為抗原通過(guò)ELISA 檢測(cè)血清抗結(jié)核抗體，結(jié)果表明，ESAT-6 蛋白的特異性高于PPD 這與Lyashchenko 等報(bào)告的結(jié)果一致。將牛分枝桿菌的毒力株和Rv3875 基因敲除突變株分別感染豚鼠后，觀察其對(duì)PPD 和重組ESAT-6 蛋白的皮膚反應(yīng)，結(jié)果所有豚鼠PPD 皮試均成陽(yáng)性，只有牛結(jié)核桿菌毒力株接種的豚鼠重組ESAT-6 蛋白皮試陽(yáng)性；推論ESAT-6 可能與分枝桿菌的致病性有關(guān)。由此，ESAT-6 具有作為致病性結(jié)核分枝桿菌診斷的抗原潛力，然而該蛋白在早期培養(yǎng)的濾液中含量很低，較難獲得使其實(shí)用價(jià)值大大降低。

CFP-10 蛋白也被稱為M.tb11 或MTSA-10，是一個(gè)早期分泌蛋白。該基因位于編碼ESAT-6 基因的上游，CFP-10 也只存在于致病性分枝桿菌中而不存在于非治病分枝桿菌和卡介苗中。CFP-10 由于與麻風(fēng)分枝桿菌L45 有40%的同源性，因此又名L45 抗原同源性蛋白（LHP），也是一種有效的T細(xì)胞抗原，能夠引發(fā)PPD 陽(yáng)性試驗(yàn)者的外周血單核細(xì)胞的增值反應(yīng)和IFN-γ 的產(chǎn)生，而卡介苗接種的健康人對(duì)該抗原反應(yīng)水平低。沈穎等研究發(fā)現(xiàn)ESAT-6/CFP-10 融合蛋白作為特異性抗原對(duì)外周單核細(xì)胞有很好的活化能力，即能刺激機(jī)體T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性的細(xì)胞因子IFN-γ，此外該融合蛋白作為特異性抗原的優(yōu)勢(shì)在于不受卡介苗的接種干擾，避免假陽(yáng)性。該融合蛋白綜合了單一抗原的優(yōu)勢(shì)，產(chǎn)生的IFN-γ 具有強(qiáng)大的活化能力，比單一抗原更為敏感，且該融合蛋白只存在與致病性分枝桿菌中，對(duì)于牛分枝桿菌、MTB 等檢測(cè)均適用，說(shuō)明該蛋白具有很好的應(yīng)用前景。

目前在MTB 的血清學(xué)診斷方面，很少采用單一蛋白，而是尋找免疫原性較好的多個(gè)蛋白進(jìn)行組合，以期提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率，例如QFT 試劑盒，是應(yīng)用ESAT-6、CFP-10 以及TB 7.7 三種蛋白刺激血液中的T 淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ，然后通過(guò)檢測(cè)并定量分析INF-γ 的濃度來(lái)判斷感染與否；PPD 是MTB的純蛋白衍生物，通過(guò)對(duì)牛進(jìn)行頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)，來(lái)診斷牛是否感染MTB。有研究將牛結(jié)合菌的MPB-70 和ESAT-6 基因利用重疊延伸PCR 技術(shù)來(lái)構(gòu)建表達(dá)載體，獲得MPB70-ESAT6 融合蛋白，該融合蛋白與牛結(jié)核陽(yáng)性血清有良好的反應(yīng)性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)MPB70-MPB83 復(fù)合物ELISA 檢測(cè)赤鹿結(jié)核病有較好的敏感性（99.02%）和特異性（70.1%）。

綜上所述，隨著基因重組和蛋白純化技術(shù)及測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，MTB 的基因和蛋白方面的研究門檻已大大降低，而近年來(lái)，隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，TB 已經(jīng)嚴(yán)重阻礙相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，并威脅相關(guān)公共衛(wèi)生安全，所以尋找合適的特異基因及抗原蛋白對(duì)于MTB 的診斷及防控具有重要意義。