華兆暉　范世航　李俊

摘要：以甘藍型油菜冬性品種中雙11的基因組為模板，克隆了BnaC05g31880D基因起始密碼子上游-1 525 bp的啟動子序列。順式調(diào)控元件的預(yù)測分析表明，該啟動子含有真核生物啟動子必需的核心調(diào)控元件TATA box和CAAT box，同時還存在較多的其他功能元件，如光信號響應(yīng)調(diào)控元件ATCT-motif、Box 4、ACE、I-box、LAMP-element、TCT-motif，厭氧感應(yīng)必需的順式作用元件ARE，茉莉酸甲酯響應(yīng)順式作用元件CGTCA-motif和TGACG-motif，玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控元件O2-site，赤霉素響應(yīng)元件P-box等。為了驗證該啟動子的表達模式，構(gòu)建了由其驅(qū)動GUS報告基因的植物融合表達載體DX2181G-pBnaC05g31880D，并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥（Col-0）。對篩選和鑒定的陽性轉(zhuǎn)基因株系進行GUS組織化學(xué)法染色，結(jié)果表明，GUS活性在擬南芥的各個組織中均有較強表達水平，這表明pBnaC05g31880D具有驅(qū)動GUS報告基因在擬南芥各個組織中組成型表達的特性。這為該啟動子在油菜轉(zhuǎn)基因提高作物品質(zhì)和人工創(chuàng)建種質(zhì)資源等方面的應(yīng)用提供了較好的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甘藍型油菜;啟動子;GUS染色;組成型;克隆;功能

中圖分類號： Q943.2;S634.301

文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）02-0065-08

收稿日期：2019-01-09

作者簡介：華兆暉（1999—），男，湖北武漢人，研究方向為生物技術(shù)。E-mail：hzh302758578@163.com。

通信作者：李 俊，博士，助理研究員，研究方向為功能基因組學(xué)。E-mail：lijun@oilcrops.cn。

啟動子在基因的轉(zhuǎn)錄和表達調(diào)控中起關(guān)鍵性作用，是核酸序列分子上被RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等識別并結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的區(qū)域。組成型表達啟動子、組織/器官特異性表達啟動子和誘導(dǎo)型表達啟動子為啟動子轉(zhuǎn)錄的3種模式[1]。目前在植物基因工程領(lǐng)域，研究和使用最為深入廣泛的是組成型啟動子，組成型啟動子的優(yōu)勢是能夠驅(qū)動目的基因在受體植株中的不同生長時期和不同組織器官中穩(wěn)定表達。其中，在雙子葉植物中，花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動子、細(xì)菌胭脂氨酸合成酶nos啟動子、水稻肌動蛋白Act啟動子、是科研工作普遍使用的啟動子工具[2-4]。在轉(zhuǎn)基因研究工作中，異源表達目的基因使用同源或近源的啟動子更有利于受體細(xì)胞調(diào)控因子的識別，減少甲基化，促進外源基因的整合，提高轉(zhuǎn)化表達效率[5-7]，而來源于病毒的CaMV35S啟動子可能具有生物安全的不確定性。李杰等在轉(zhuǎn)基因鹽藻的研究中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源型啟動子比外源啟動子更有優(yōu)勢[8]。

油菜是十字花科蕓薹屬的重要一員，是四大油料作物之一，位居全球五大經(jīng)濟作物，是食用植物油的重要來源。自1985年首例轉(zhuǎn)基因油菜問世以來[9]，油菜基因工程已經(jīng)發(fā)展較為迅猛，利用分子育種手段改良油菜品種品質(zhì)，較傳統(tǒng)育種更加明確、快速。但至今沒有得到穩(wěn)定高效表達目的基因的油菜內(nèi)源組成型啟動子，使油菜基因工程相對受限，而采用外源病毒啟動子35S等，更加加重了普通消費者對轉(zhuǎn)基因安全的疑慮。因此，在雙子葉植物油菜中研究內(nèi)源組成型啟動子，對于雙子葉植物的遺傳改良分子育種等具有重要的應(yīng)用價值。本研究通過試驗分析，發(fā)現(xiàn)啟動子pBnaC05g31880D呈現(xiàn)出很強的組成型表達特性，在pBnaC05g31880D轉(zhuǎn)基因擬南芥中，其所驅(qū)動的報告基因GUS（β-glucuronidase，β-D-葡萄糖苷酸酶）[10]在轉(zhuǎn)基因擬南芥的根、莖、葉、花、角果、胚珠中都表現(xiàn)出很強的表達水平，這些數(shù)據(jù)充分表明pBnaC05g31880D是一個很強的組成型表達啟動子，在植物轉(zhuǎn)基因育種中具有良好的應(yīng)用前景，也為油菜近源物種的轉(zhuǎn)基因研究提供了良好的啟動子材料。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

目的序列的模版來源為甘藍型油菜品種中雙11 DNA，為筆者所在實驗室提取保存。植物雙元表達載體DX2181G、大腸桿菌感受態(tài)DH5α、野生型擬南芥Arabidopsis thaliana（Columbia）、農(nóng)桿菌感受態(tài)菌株GV3101均為筆者所在實驗室制備保存。紫外分光光度計（NP80）、熒光實時定量PCR儀（ABI sds7500fast）為筆者所在實驗室儀器。一步快速重組試劑盒ClonExpress Entry One Step Cloning Kit購自南京諾唯贊生物科技有限公司，引物合成及單菌落測序為生工生物工程（上海）股份有限公司完成，RNA提取試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen，DNA Marker等購自大連寶生物公司，快速內(nèi)切酶購自Thermo Fisher Scientific。溫室培養(yǎng)條件為22 ℃/24 ℃、8 h/16 h。

1.2 目的片段的序列分析

筆者所在實驗室前期的全基因組測序結(jié)果顯示，BnaC05g31880D基因（Sequence ID：GCF_000686985.2）的轉(zhuǎn)錄區(qū)上游有1 525 bp的基因間隔序列，初步預(yù)測該區(qū)域為基因BnaC05g31880D的啟動子序列[11]，命名為pBnaC05g31880D。啟動子的功能行使依靠的是各種元件，元件的類型、多少決定了其啟動下游目的基因的表達強度、效率和時空性[12]。在線分析軟件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）是預(yù)測啟動子序列功能元件的有效工具，可以對后續(xù)研究起重要指導(dǎo)意義[13]。

1.3 目的片段的克隆

以全基因組測序結(jié)果為參考，在啟動子pBnaC05g31880D序列的N端和C端，利用在線引物設(shè)計軟件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）[14]進行序列特異引物設(shè)計（表1）。之后分別在上下游引物的5′端加上對應(yīng)酶切載體的酶切位點及酶切位點的側(cè)翼序列15 bp，作為融合重組引物，用于后續(xù)的一步重組的載體構(gòu)建工作。

啟動子序列目的片段的克隆按50 μL PCR體系配制：2×Mix 25 μL，P_BnaC05g31880D （Hind Ⅲ）-F 1.5 μL，P_BnaC05g31880D （BamH Ⅰ）-R 1.5 μL，Darmor DNA 2 μL，ddH2O 20 μL。PCR的運行程序：94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，36個循環(huán);72 ℃ 8 min;4 ℃保存。PCR結(jié)束后，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶是否單一，大小是否正確，并切膠回收目的條帶，回收產(chǎn)物用紫外分光光度計檢測其質(zhì)量。

1.4 植物表達載體構(gòu)建

植物雙元表達載體DX2181G的原核抗性為卡那霉素，真核抗性為潮霉素，多克隆酶切位點的下游含有GUS標(biāo)記基因，是研究啟動子功能的良好骨架載體[15]。提取的高質(zhì)量質(zhì)粒按照酶切體系（vector：40 μL;10×buffer：5 μL;Hind Ⅲ：2.5 μL;BamH Ⅰ：2.5 μL），37 ℃反應(yīng)30 min，按照試劑盒說明書純化回收酶切好的質(zhì)粒并檢測回收質(zhì)量。按照一步快速重組試劑盒（ClonExpress Entry One Step Cloning Kit）說明書進行載體構(gòu)建（5×CE Ⅱ Buffer 2 μL，酶切后的載體質(zhì)粒1 μL-100 ng，PCR產(chǎn)物1 μL-50 ng，Exnase Ⅱ 2 μL，ddH2O 4 μL），37 ℃ 恒溫反應(yīng)30 min后至于冰水混合物上靜置 5 min，之后用移液器加入到預(yù)先拿出在冰上融化的大腸桿菌感受態(tài)DH5α。37 ℃恒溫?fù)u床復(fù)蘇45 min后，轉(zhuǎn)入LB固體培養(yǎng)基（含50 mg/L卡那霉素）倒置過夜培養(yǎng)篩選。用測序引物（DX2181-F+DX2181-R）PCR鑒定單菌落并對正確的進行測序，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，陽性單菌落用50%甘油1 ∶1保存于-80 ℃冰箱。

1.5 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及分子鑒定

具有形態(tài)小、生長周期短、閉花授粉等特性的擬南芥，作為模式作物來進行基因工程研究，具備諸多優(yōu)勢。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，在初花期，浸染花絮1 min，1周后進行二次重復(fù)浸染。收獲的種子（T1）用含25 mg/L潮霉素的1/2 MS固體培養(yǎng)基篩選，點播于培養(yǎng)基后，在黑暗條件下培養(yǎng)3 d，再在光照下培養(yǎng)5 d，下胚軸長、葉色發(fā)綠的移栽于培養(yǎng)土中繼續(xù)生長。抽薹前對每一單株編號并提取其葉片DNA，經(jīng)PCR鑒定[DX2181-F/P_ BnaC05g31880D（BamH I）-R]后根據(jù)條帶大小確定陽性單株并收獲成熟后的種子（T2）。依次繼代播種，篩選得到不發(fā)生抗潮霉素分離的純合轉(zhuǎn)基因株系，利用純合株系作為后續(xù)研究的對象。

1.6 轉(zhuǎn)基因株系的GUS組織化學(xué)染色分析

剪取純合株系擬南芥不同時期不同組織樣品進行GUS染色，具體染色組織和器官如下：成熟種子，成熟種子的胚胎，成熟種子的種皮，15 d幼苗，25 d幼苗、根、莖、葉、花、角果、幼嫩胚珠、幼嫩胚胎、幼嫩種皮。取樣后置于2.0 mL離心管或大小合適的容器中，加入適量GUS染色液（50 mmol/L鐵氰化鉀;50 mmol/L亞鐵氰化鉀;50 mmol/L PBS，pH值為7.0;10 mmol/L EDTA、0.001% Triton X-100以及20%甲醇;0.5 mol/L X-Gluc），以全部沒過染色組織為基本量。于37 ℃恒溫孵育反應(yīng)12 h或過夜，之后用75%乙醇脫色12 h，期間更換脫色液2次。脫色完成后，利用體視鏡（Olympus SZX7）進行觀察拍照。組織或器官著色為藍色的即GUS基因表達的部位，也就是啟動子發(fā)揮功能啟動下游基因的部位，染色越深表示啟動子在該部位越強，啟動了下游GUS基因，通過檢測不同時空下GUS基因的表達部位和表達強度來探索pBnaC05g31880D啟動下游基因的時空表達模式。

1.7 油菜內(nèi)源基因BnaC05g31880D表達量及轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS表達量檢測來源于油菜的內(nèi)源基因BnaC05g31880D在油菜自身的表達量一定程度上代表了其上游啟動子的作用模式。啟動子pBnaC05g31880D來源于油菜基因組，其下游的內(nèi)源基因為BnaC05g31880D，研究BnaC05g31880D在油菜不同組織中的表達量可以為研究啟動子pBnaC05g31880D的時空特性提供參考。設(shè)計BnaC05g31880D的半定量PCR引物（q_BnaC05g31880D-F、q_BnaC05g31880D-R），內(nèi)參基因為At_β-actin（q_Bn_β_actin-F、q_Bn_β_actin-R），PCR程序設(shè)置為20個循環(huán)，在油菜的不同組織，即萌發(fā)7 d幼苗、根-三葉期、葉片-三葉期、莖-花期、腋芽-花期、葉片-花期、花蕾-花期、角果-10DAF（花后10 d）、角果皮-25DAF（花后25 d）、胚胎-25DAF、胚乳-25DAF、胚胎-35DAF（花后35 d），檢測其相對表達量。

取樣純合株系轉(zhuǎn)基因擬南芥的不同組織部位（根、莖、葉、花、角果、胚珠），提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后作為模版，以野生型擬南芥WT為對照，內(nèi)參基因為Bn_β-actin（q_Bn_β_actin-F、q_Bn_β_actin-R），進行實時定量PCR檢測，運行結(jié)束后獲得的原始數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進行統(tǒng)計學(xué)分析，反映目的基因GUS的相對表達水平[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 BnaC05g31880D基因的啟動子序列分析

PlantCARE對在線pBnaC05g31880D序列的啟動子功能元件分析結(jié)果（圖1，表2）顯示，該序列所包含的功能元件數(shù)量龐大，種類較多，有啟動子核心元件TATA-box 37個，啟動子和增強子共同的核心元件CAAT-box 28個，光信號響應(yīng)相關(guān)元件ATCT-motif、Box 4、ACE、I-box、LAMP-element和TCT-motif共計10個，厭氧調(diào)控元件ARE 2個，茉莉酸響應(yīng)調(diào)控元件motif 2個，玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控元件O2-site 1個，赤霉素響應(yīng)元件P-box 1個，以及其他功能未知的功能元件25個。

2.2 目的片段的克隆

pBnaC05g31880D序列的大小為1 525 bp，PCR產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果見圖2，對比核酸marker發(fā)現(xiàn)，擴增產(chǎn)物條帶單一，且大小相符，為目的產(chǎn)物。切膠回收后檢測濃度為56 ng/μL。

2.3 載體DX2181G-pBnaC05g31880D的構(gòu)建

經(jīng)Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切后，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（圖3）顯示酶切完全，把目的條帶切膠純化回收并檢測回收質(zhì)量為110 ng/μL。回收的線性化載體和PCR產(chǎn)物按照一步重組法融合構(gòu)建重組載體（圖4），轉(zhuǎn)化后經(jīng)單菌落鑒定為陽性的送測序公司測序，排除突變和方向錯誤，獲得與參考序列完全一致的單菌落，提質(zhì)粒并保存菌液，命名為DX2181G-pBnaC05g31880D。

2.4 pBnaC05g31880D啟動子的功能分析

從61個T1代擬南芥單株樣品中鑒定得到49個陽性的株系（部分PCR鑒定結(jié)果見圖5），陽性率為80.33%。經(jīng)3代篩選得到純合轉(zhuǎn)基因株系，經(jīng)不同組織器官的GUS染色（圖6），在轉(zhuǎn)基因擬南芥的成熟種子萌發(fā)1、3 d幼苗以及35 d幼苗、莖、花、角果、幼嫩胚珠、幼嫩胚胎等不同組織和器官中都有很強的著色結(jié)果，這表明GUS基因在啟動子pBnaC05g31880D的作用下，在不同組織器官中都發(fā)生了轉(zhuǎn)錄表達，且表達強度很高。

2.5 油菜內(nèi)源基因BnaC05g31880D表達量分析及轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS表達量分析BnaC05g31880D在油菜萌發(fā)7 d幼苗、根-三葉期、葉片-三葉期、莖-花期、腋芽-花期、葉片- 花期、花蕾-花期、角果-10DAF、角果皮-25DAF、胚胎-25DAF、胚乳-25DAF、胚胎-35DAF中的半定量結(jié)果（圖7）顯示，該基因在油菜各個組織中的表達穩(wěn)定高效，表明該基因的上游啟動子對于目的基因起泛表達的作用。在轉(zhuǎn)基因pBnaC05g31880D的擬南芥中，實時定量PCR結(jié)果（圖8）顯示，GUS基因在根、莖、葉、花、角果、胚珠各個組織中的表達量都較高，表現(xiàn)為組織間的泛表達特性，即組成型表達。

3 討論與結(jié)論

啟動子序列的功能元件預(yù)測結(jié)果表明，pBnaC05g31880D的1 525 bp的序列中包含了37個啟動子核心元件TATA-box，28個啟動子和增強子共同的核心元件CAAT-box，共計10個光信號響應(yīng)相關(guān)元件 ATCT-motif、Box 4、ACE、I-box、LAMP-element 和TCT-motif，2個厭氧調(diào)控元件ARE，2個茉莉酸響應(yīng)調(diào)控元件motif，1個玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控元件O2-site，1個赤霉素響應(yīng)元件 P-box，以及25個其他功能未知的功能元件，共計106個，平均14個堿基就有1個功能元件，數(shù)量多，且較為密集。特別是其中72個（68%）功能元件位于-1～-760 bp的區(qū)域內(nèi)，這預(yù)示著該啟動子的功能區(qū)在-1～-800 bp 內(nèi)，這樣其序列就縮短了近一半，更加適合應(yīng)用推廣。

油菜在我國的食用植物油中占有很重要的地位，依靠傳統(tǒng)的育種模式提高油菜品質(zhì)已經(jīng)在過去的幾十年內(nèi)到達了一個瓶頸期。而依托于基因工程的分子育種，針對性更強，周期更短，通過基因工程來定向改良作物，是當(dāng)今品質(zhì)改良的重要課題。那么篩選得到油菜內(nèi)源的組成型表達的啟動子就很迫切，也很必要，利用油菜內(nèi)源的組成型表達啟動子表達目的基因，定向改良作物品質(zhì)，也為雙子葉植物的其他近源物種提供了參考。

本研究成功篩選得到1個來源于油菜的啟動子，其驅(qū)動下游GUS基因轉(zhuǎn)化擬南芥的GUS染色結(jié)果顯示，GUS在轉(zhuǎn)基因擬南芥的不同時空不同組織中均有較強的表達效果。這一啟動下游基因組成型表達的啟動子，對分子育種改良作物品質(zhì)具有潛在的應(yīng)用價值。

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