黃瑞芳，王紅玲，施士爭

(1.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院， 江蘇 南京 211153； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺， 江蘇 南京 210014)

隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，重金屬污染對生態(tài)環(huán)境的危害越來越嚴(yán)重。鉛不能被生物代謝所分解，在環(huán)境中滯留的時(shí)間較長，且能通過食物鏈在動(dòng)物和人體內(nèi)富集，對人體的腎臟、血液、神經(jīng)系統(tǒng)等危害極大[1-2]。目前，中國珠江三角洲平原典型區(qū)地下水和長江三角洲典型地區(qū)土壤都受到較嚴(yán)重的鉛污染[3-4]。植物修復(fù)技術(shù)是近10 a發(fā)展起來的利用植物清除土壤污染物的原位修復(fù)技術(shù)，是治理重金屬污染土壤的重要途徑之一，具有投資較小、維護(hù)成本低、操作簡便、不造成2次污染等優(yōu)點(diǎn)[5]。Pb沉積在土壤中，積累到一定程度就會(huì)對植物產(chǎn)生毒害[6]，因此一些生物量大、對污染物吸收能力強(qiáng)的耐性植物，越來越多的受到相關(guān)學(xué)者的關(guān)注和研究。

我國柳樹資源豐富，有257種、122個(gè)變種、33個(gè)變型，在河岸、湖濱綠化中大量使用，廣泛分布在我國各個(gè)地區(qū)。柳樹，尤其是灌木柳，其根系發(fā)達(dá)，適應(yīng)性強(qiáng)，耐水濕，生長速度快，生物量大，且不直接與食物鏈相聯(lián)系，與草本植物相比，因其高積累性，修復(fù)能力高[7]，有研究甚至認(rèn)為柳樹是重金屬的超積累植物[8-9]。因此柳樹是植物修復(fù)的理想材料[10]，適合用于修復(fù)低、中濃度重金屬污染[7,10-11]。柳樹資源豐富，且其種及無性系間修復(fù)能力差異大，因此挖掘、開發(fā)與利用我國豐富的柳樹種質(zhì)資源用于植物修復(fù)，前景廣闊。筆者所在課題組前期已進(jìn)行了柳樹修復(fù)鉛污染的部分研究，研究較多的是柳樹在鉛脅迫下的生長表現(xiàn)，而對柳樹體內(nèi)鉛含量的測定和柳樹鉛富集能力的比較研究較少。本文開展重金屬 Pb 脅迫對7個(gè)灌木柳樹的生長形態(tài)、生物量、耐性指數(shù)、鉛含量以及轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的影響研究，旨在了解鉛對灌木柳生長的影響及灌木柳對Pb的耐性特征，為進(jìn)一步研究柳樹對鉛的累積機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

7個(gè)灌木柳(見表1)試驗(yàn)材料隸屬杞柳(Salixintegra)、簸箕柳(S.suchowensis)和蒿柳(S.viminalis)。所有參試材料均來自于江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院國家柳樹良種基地柳樹種質(zhì)資源圃。

表1 供試無性系

1.2 試驗(yàn)方法

于2019年3月選取長15 cm、直徑1 cm的健壯插穗，于清水中培養(yǎng)，2周后，挑選生長勢一致的柳樹苗，置于200 mL培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每瓶3株，每株插穗沒水深度約10 cm。通過改良Hogland營養(yǎng)液培養(yǎng)2周后進(jìn)行鉛處理，4周之后收獲植株。鉛處理具體設(shè)計(jì)為：以Pb(NO3)2的形式加入Pb2+，處理組質(zhì)量濃度分別為0 (CK), 20 (處理1), 40 mg/L(處理2)和80 mg/L(處理3)。試驗(yàn)設(shè)置重復(fù)4次，過程中每周換營養(yǎng)液1次。為避免鉛產(chǎn)生沉淀，開始鉛脅迫后，營養(yǎng)液中不再加入KH2PO4。

1.3 測定方法

試驗(yàn)分根、莖、葉收集測定材料。先用自來水沖洗植株，然后用去離子水反復(fù)沖洗干凈，并用吸水紙擦干，根部用EDTA洗去表面附著的鉛，于105 ℃殺青30 min后，烘干至恒重，分別稱取其生物量(即干物質(zhì)量，DW)。按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鉛的測定》(GB5009.12-2017)中的方法進(jìn)行植物地上部和地下部鉛含量的測定。并計(jì)算其耐性指數(shù)(Tolerance index，TI)[12]，計(jì)算公式為TI=DW(脅迫)/DW(CK)；生物轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)(Translocation factor，TF)=地上部分的鉛總量/地下部分的鉛總量；以及表性閾值，通常將植物生物量下降50%時(shí)介質(zhì)的重金屬含量稱之為毒性閾值(EC50)。得到的數(shù)據(jù)利用Excel 2010和IBM SPSS Statistics 19分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉛脅迫對柳樹無性系生長和生物量的影響

植物的生物量受生長環(huán)境影響，是耐鉛性的重要評價(jià)因子之一[13]。生物量越大，植物體的蓋度越大，吸收的重金屬量也越多，修復(fù)受污染土壤的效果越好[14]。隨著鉛脅迫質(zhì)量濃度的增大，供試無性系生長整體上呈現(xiàn)下降趨勢：處理1出現(xiàn)黃葉狀況，處理2出現(xiàn)枯葉、部分死亡狀況，處理3出現(xiàn)枯葉掉落、死亡增多的狀況。經(jīng)Pb2+處理4周后，無性系存活率的結(jié)果(見表2)顯示：P681，P1024，P126在各脅迫質(zhì)量濃度下存活率均為100%，其他無性系的存活率在各質(zhì)量濃度鉛脅迫下均出現(xiàn)不同程度的降低。

方差分析表明，各無性系和各處理間生物量差異極顯著(Sig. < 0.01)(見圖1)。生物量(g)及多重比較結(jié)果表明：CK(a)(5.68±0.89)>處理1(b)(3.31±0.67)>處理2(c)(2.55±0.51)>處理3(c)(2.33±0.44)；P681(a)(4.04±1.80)>P336(ab)(3.85±1.34)>P1024(ab)(3.52±1.09)>P61(ab)(3.47±1.78)>P646(ab)(3.28±1.88)>P683(ab)(3.14±1.32)>P63(b)(2.98±0.83)。

表2 不同供試柳樹無性系的存活率 %

圖1 不同質(zhì)量濃度鉛脅迫下各柳樹無性系的生物量

方差分析顯示，P63在3個(gè)處理下生物量均無顯著差異；P1024，P646，P61，P681，P683在處理2與處理3之間無顯著差異，而P336的3個(gè)處理之間差異顯著或極顯著。

在無鉛脅迫時(shí)(CK)，各無性系生物量范圍為4.33—6.86 g，平均值為5.68 g。其中，P63的生物量顯著低于其他無性系，而P681顯著高于除P61外的其他無性系；鉛脅迫質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)，各無性系生物量范圍為2.37-4.06 g，平均值為3.31 g。其中，P63顯著低于除P61外的其他無性系，而P336生物量最高；鉛脅迫質(zhì)量濃度為40 mg/L時(shí)，各無性系生物量范圍為1.90—3.42 g，平均值為2.55 g。其中，P683顯著低于除P646之外的其他無性系，P336顯著高于其他無性系；鉛脅迫質(zhì)量濃度為80 mg/L時(shí)，各無性系生物量范圍為1.61—2.83 g，平均值為2.33 g。其中，P646顯著低于其他無性系，而P1024，P681，P63顯著高于其他無性系。

2.2 鉛脅迫對供試柳樹無性系鉛污染耐性指數(shù)的影響

總體而言，隨著鉛質(zhì)量濃度的升高，各柳樹無性系的耐性指數(shù)總體表現(xiàn)為逐步降低的趨勢(見圖2)。耐性指數(shù)(%)及多重比較顯示，處理1(a)(58.94±2.31)>處理2(b)(45.87±11.36)>處理3(b)(42.32±12.13)；P63(a)(58.79±1.95)>P1024(a)(57.23±3.00)>P336(a)(56.61±4.37)>P683(ab)(50.21±4.70)>P681(bc)(45.07±2.87)>P61(c)(39.01±1.31)>P646(c)(36.39±3.21)。

P336，P646各處理耐性指數(shù)之間的差異顯著，P63各處理之間無顯著差異，P61處理1與處理2之間無顯著差異，P1024，P681，P683處理2與處理3之間無顯著差異。

鉛脅迫質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)，各柳樹無性系的耐性指數(shù)范圍為43.17%—71.14%，平均值為58.94%。P1024，P336，P683顯著高于其他無性系，而P61顯著低于除P646外的其他無性系；鉛脅迫質(zhì)量濃度為40 mg/L時(shí)，各柳樹無性系的耐性指數(shù)范圍為34.74%—61.22%，平均值為45.87%。其中，無性系P336和P63顯著高于其他無性系；鉛脅迫質(zhì)量濃度為80 mg/L時(shí)，各柳樹無性系的耐性指數(shù)范圍為25.66%—60.25%，平均值為42.32%。其中，P646顯著低于其他無性系，而P63，P1024顯著高于其他無性系。

圖2 不同質(zhì)量濃度鉛脅迫下各柳樹無性系的耐性指數(shù)

2.3 不同柳樹無性系對鉛的毒性閾值

使用多項(xiàng)式擬合曲線對柳樹的毒性閾值進(jìn)行模擬，不同柳樹無性系對鉛的毒性閾值(EC50)見表2。其中，P683的EC50最高，達(dá)到215.780 mg/L，而P646的EC50最低，只有22.911 mg/L。

表2 不同柳樹無性系的毒性閾值

2.4 鉛脅迫對柳樹無性系體內(nèi)鉛含量的影響

柳樹體內(nèi)鉛含量的多少直接反映了其對鉛脅迫的耐受力。總體而言，隨著鉛質(zhì)量濃度的升高，各無性系植株體內(nèi)的鉛含量總體上逐步升高(見圖3)。無鉛脅迫時(shí)，各無性系的鉛含量均為0(未檢測到)。鉛含量(mg/kg)及多重比較結(jié)果表明：處理3(a)(2 794.82±202.48)>處理2(b)(1 934.09±177.61)>處理1(c)(1 410.32±157.33)；P683(a)(2 862.07±365.95)>P61(a)(2 776.20±56.74)>P681(ab)(2 497.31±424.13)>P336(bc)(1 790.56±297.00)>P1024(c)(1 611.63.96±180.92)>P63(c)(1 500.53±312.53)>P646(c)(1 286.55±24.42)。

P1024，P336，P63各處理之間鉛含量差異極顯著；P681處理1與2之間無顯著差異，處理3極顯著增高；P61，P683處理2與處理3之間無顯著差異；P646處理之間無顯著差異。

圖3 不同質(zhì)量濃度鉛脅迫下各柳樹無性系的鉛含量

鉛脅迫質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)，各柳樹無性系植株體內(nèi)鉛含量范圍為674.00—2 967.30 mg/kg，平均值為1 410.32 mg/kg。P61顯著高于其他無性系，P63顯著低于其他無性系；鉛脅迫質(zhì)量濃度為40 mg/L時(shí)，各柳樹無性系植株體內(nèi)的鉛含量范圍為1 106.90—3 485.20 mg/kg，平均值為1 934.09 mg/kg。P63顯著低于其他無性系，P683顯著高于其他無性系；鉛脅迫濃度為80 mg/L時(shí)，各柳樹無性系植物體內(nèi)的鉛含量范圍為1 230.10—4 185.07 mg/kg，平均值為2 794.82 mg/kg。P646顯著低于其他無性系，P681，P683顯著高于其他無性系。

2.5 鉛脅迫對柳樹無性系植株體內(nèi)鉛總量的影響

柳樹體內(nèi)吸附鉛總量的多少直接反映了柳樹修復(fù)鉛污染的能力。各柳樹無性系植株體內(nèi)的鉛總量表現(xiàn)如圖4。鉛總量(μg)及多重比較表明，處理3(a)(6 579.41±573.98)>處理2(b)(4 756.57±368.26)>處理1(b)(4 697.22±446.35)；P681(a)(7 432.79±980.72)>P61(a)(6 950.69±377.06)>P683(ab)(6 420.28±577.23)>P336(bc)(5 121.27±318.40)>P1024(cd)(4 608.11±433.91)>P63(cd)(3 887.01±811.81)>P646(d)(2 990.64±335.59)。

P1024，P61，P63，P681各處理之間鉛總量差異極顯著；P336處理1與處理2之間無顯著差異，而處理3鉛總量顯著增加；P646處理1顯著高于其他處理；P683處理1與2之間無顯著差異，處理2與處理3之間無顯著差異。

鉛脅迫質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)，各柳樹無性系植株體內(nèi)鉛總量范圍為1 696.24—8 100.89 μg，平均值為4 697.22 μg。P61，P681顯著高于其他無性系，而P63顯著低于其他無性系；鉛脅迫濃度為40 mg/L時(shí)，各柳樹無性系體內(nèi)鉛總量范圍為2 919.06—6 915.86 μg，平均值為4 756.57 μg。P61顯著高于除P683外的其他無性系；鉛脅迫濃度為80 mg/L時(shí)，各柳樹無性系體內(nèi)鉛總量范圍為2 022.48—11 098.45 μg，平均值為6 579.41 μg。P681顯著高于其他無性系，P646顯著低于其他無性系。

圖4 不同質(zhì)量濃度鉛脅迫下各柳樹無性系體內(nèi)的鉛總量

2.6 鉛脅迫對柳樹無性系轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的影響

轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)越大，證明地上部分的鉛含量越多，反映了柳樹向地上部運(yùn)輸鉛的能力強(qiáng)。不同鉛脅迫下各柳樹無性系的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)如圖5。轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)及多重比較表明，處理1(a)(0.007 6±0.001 2)>處理2(ab)(0.005 2±0.001 1)>處理3(b)(0.003 5±0.000 4)；P1024(a)(0.009 8±0.001 7)>P683(ab)(0.007 6±0.002 5)>P681(bc)(0.005 3±0.001 6)>P336(bc)(0.004 7±0.000 5)>P646(bc)(0.004 3±0.000 7)>P61(bc)(0.003 5±0.000 6)>P63(c)(0.003 1±0.000 7)。P1024，P646處理2顯著高于其他處理，P336處理1和處理2之間無顯著差異，而處理3顯著降低；處理2顯著低于其他處理；P61，P63各處理之間轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)差異極顯著；P681，P683處理1極顯著高于其他處理，處理2與處理3之間無顯著差異。

鉛脅迫質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)，各柳樹無性系轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)范圍為0.001 9—0.017 4，平均值為0.007 60。P683轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)顯著高于其他無性系，P61轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)最低；鉛脅迫質(zhì)量濃度為40 mg/L時(shí)，各柳樹無性系轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)范圍為0.001 8—0.016 1，平均值為0.005 2。P1024轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)顯著高于其他無性系，P646轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)最低；鉛脅迫濃度為80 mg/L時(shí)，各柳樹轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)范圍為0.000 4—0.005 9，平均值為0.003 5。P63轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)顯著低于其他無性系。

圖5 不同質(zhì)量濃度鉛脅迫下各柳樹無性系的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)

3 結(jié)論和討論

目前關(guān)于柳樹修復(fù)重金屬污染的研究越來越多[15-17]，植物修復(fù)的效果主要取決于植物體內(nèi)重金屬的含量、生物量和植物生長速率[18]。本研究選擇了3種質(zhì)量濃度的鉛脅迫處理，根據(jù)各處理灌木柳無性系的表現(xiàn)可以看出：P61在低質(zhì)量濃度鉛脅迫時(shí)，鉛含量較高，隨著鉛脅迫質(zhì)量濃度的增加，體內(nèi)鉛含量不再增加，這可能是因?yàn)镻61啟動(dòng)某個(gè)機(jī)制來保護(hù)自己不再吸收鉛，所以在高質(zhì)量濃度鉛脅迫下，生物量與低質(zhì)量濃度時(shí)生物量相當(dāng)，而其在低質(zhì)量濃度鉛脅迫下，鉛總量顯著高于其他無性系，因此P61適合低質(zhì)量濃度鉛污染修復(fù)；P63和P1024隨著鉛脅迫質(zhì)量濃度的增高，體內(nèi)鉛含量極顯著增加，而生物量在高質(zhì)量濃度鉛脅迫下無顯著降低，存活率均為100%，耐性指數(shù)均在50%以上，因此，較適合高質(zhì)量濃度鉛污染修復(fù)；P646隨著鉛脅迫質(zhì)量濃度的增加，體內(nèi)的鉛含量并無顯著增加，但是生物量卻隨著鉛脅迫的增加而降低，耐性指數(shù)在低質(zhì)量濃度鉛脅迫時(shí)即降至50%以下(48.80%)，高質(zhì)量濃度鉛脅迫時(shí)降低至25.65%，因此P646并不適合進(jìn)行鉛污染修復(fù)。

由以上結(jié)果可以看出，柳樹對鉛脅迫的差異主要表現(xiàn)在無性系間，而并非在種間，這與前人的研究相符[19]。以后要加強(qiáng)無性系間鉛耐受能力的篩選。柳樹地上部積累鉛越多，越有利于進(jìn)行鉛污染的修復(fù)利用。

由轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)結(jié)果可知，柳樹積累的鉛大量都集中在植株的地下部分，地上部分鉛含量極少，這與之前的報(bào)道相符[20]。在后續(xù)的研究中，可通過添加不同濃度外源非蛋白巰基的合成底物，如半胱氨酸(Cys)和谷胱甘肽(GSH)等，有效提高柳樹向地上部分轉(zhuǎn)運(yùn)鉛的能力，來增加柳樹對鉛污染的修復(fù)[21-23]。轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)在種間的一致性較高，這證明不同基因型的柳樹，其轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬的機(jī)制可能較為一致，這也為今后了解柳樹體內(nèi)重金屬的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制提供了依據(jù)。