徐麗麗，鄭華英，徐 明，解春霞，劉云鵬

(江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院， 江蘇 南京 211153)

松乳菇[Lactariusdeliciosus(L.) Gray]屬紅菇科(Russulaceae)乳菇屬，又名雁來蕈等，是松林山地的特產(chǎn)[1]。子實(shí)體中等偏大，乳汁量少，菌蓋半球形，初生時(shí)菌蓋邊緣向下內(nèi)卷，后平展，菌肉蝦仁色，菌褶與菌蓋同色，初略發(fā)白，后呈橘紅色，傷后變綠色[1-2]。肉質(zhì)細(xì)膩，味道鮮美、柔和，具獨(dú)特風(fēng)味，深受廣大食客的喜愛，市場價(jià)格可達(dá)200元/kg[3-4]。松乳菇更是珍貴的藥用真菌，具較高的醫(yī)用價(jià)值[5-6]。具有極高的營養(yǎng)價(jià)值，富含多種人體所需的游離氨基酸、不飽和脂肪酸、粗蛋白、礦物質(zhì)元素等，其根菌提出的松乳菇多糖，具有抗腫瘤、抗病毒、抑菌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等功效[7-9]。

松乳菇在中國廣泛分布，以長江南岸的品質(zhì)、口感最佳。但因其為松、杉、柏等植物根系的外生菌根菌，目前未見成功的人工馴化栽培，因而松乳菇的市場供應(yīng)全依賴于野生人工采摘，這對松乳菇的野外生長環(huán)境破壞極大，致使其產(chǎn)量逐年下降[10]。由于其野外生長受自然因素(降雨量、溫度、坡向)影響較大，松乳菇產(chǎn)量波動(dòng)極大，易造成市場緊缺[11-12]。為保護(hù)食用菌資源的多樣性，規(guī)?；_發(fā)利用松乳菇半人工栽培廣受關(guān)注與研究[13-15]。規(guī)?；囵B(yǎng)松乳菇菌絲體是其開發(fā)利用的先決條件，本文對松乳菇不同株菌進(jìn)行了篩選，并對菌絲固體培養(yǎng)進(jìn)行了初步研究，以期為后期其林下栽培與開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

試驗(yàn)菌株來自中國林業(yè)科學(xué)研究院菌種保藏中心菌種資源庫，分別為cfcc 6592(山東濟(jì)寧)、cfcc 83417(遼寧寬甸)、cfcc 84695(湖北)、cfcc 87505(陜西)、cfcc 6594、cfcc 6593和cfcc 7290。

1.2 菌株選擇試驗(yàn)

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)室原有的松乳菇固體培養(yǎng)基，配方[16-17]組成為KH2PO4(0.3 g)、MgSO4(0.5 g)、蔗糖(19.9 g)、硝酸鈉(0.82 g)、FeSO4(0.5 g)、瓊脂(20 g)、VB1(0.1 g)、蒸餾水(1 000 mL)。將試管斜面培養(yǎng)的7個(gè)松乳菇保藏菌株活化培養(yǎng)，將活化后菌株直徑為 5 mm的菌絲體，接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中央，置于25 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)，每種處理設(shè)重復(fù)5個(gè)。接種1 d后，每天觀察菌絲形態(tài)，使用游標(biāo)卡尺測量并記錄菌落直徑，以確定適宜的松乳菇菌株。

1.3 固體培養(yǎng)基配方篩選

碳元素在真菌細(xì)胞的干質(zhì)量中占有一半，碳源在真菌發(fā)育過程中至關(guān)重要。本試驗(yàn)選取葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖等真菌培養(yǎng)過程中的常用碳源進(jìn)行其最適碳源的選擇[17]。通過相同含碳量換算，分別用蔗糖(19.9 g)、可溶性淀粉(18 g)、麥芽糖(20 g)、葡萄糖(20 g)作為碳源，配制成不同碳源的培養(yǎng)基，其他物質(zhì)較基礎(chǔ)培養(yǎng)基不變。使用篩選出的適宜菌株，取直徑 5 mm的菌絲體，接種到供試培養(yǎng)基中央，置于25 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)，每個(gè)菌株各設(shè)4個(gè)碳源處理，每種處理設(shè)重復(fù)5個(gè)。接種1 d后，每天使用游標(biāo)卡尺測量菌落直徑并記錄，計(jì)算出菌絲覆蓋面達(dá)培養(yǎng)皿培養(yǎng)基表面50%、達(dá)培養(yǎng)皿培養(yǎng)基表面100%的天數(shù)。后續(xù)氮源及松針?biāo)脑囼?yàn)中接種方法、重復(fù)、培養(yǎng)溫度、觀察方法與此相同。

氮源在真菌生長過程中不可缺少。在完成碳源篩選的基礎(chǔ)上，將最適碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的硝酸鈉(0.82 g)分別替用成蛋白胨(1 g)、酒石酸銨(0.89 g)、尿素(0.29 g)、谷氨酸(1.42 g)等氮源[17]，配制成不同氮源培養(yǎng)基，以含硝酸鈉氮源培養(yǎng)基為對照，篩選出最適氮源。

最終培養(yǎng)基：使用適宜的氮源、碳源替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源、氮源，并使用1 000 mL松針?biāo)娲A(chǔ)培養(yǎng)基中等量的蒸餾水，配制最終培養(yǎng)基，接種菌絲體，以未添加松針?biāo)淖钸m碳源、氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同松乳菇菌株菌絲體生長的比較

將供試菌株接種到培養(yǎng)基上，置于恒溫箱25 ℃下培養(yǎng)。觀察結(jié)果如表1所示，cfcc 6594，cfcc 84695，cfcc 6592和cfcc 83417菌株的菌絲體生長速度相對較快，在30 d內(nèi)可以長滿平板培養(yǎng)皿培養(yǎng)基表面，剩余其他菌株的菌絲體未能長滿培養(yǎng)皿培養(yǎng)基表面。因此，選取這4個(gè)菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。接種觀察發(fā)現(xiàn)，不同菌株間菌絲生長速度有所不同，且基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲較為稀薄，生長速度較慢，需要對基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方進(jìn)行改良，使松乳菇菌種菌絲體可以高效生長。

表1 松乳菇不同菌株菌絲體生長時(shí)間比較 d

2.2 不同碳、氮源培養(yǎng)基上松乳菇菌種菌絲體生長的比較

2.2.1 不同碳源對松乳菇菌絲體生長的影響 試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，不同碳源對松乳菇菌種菌絲生長情況的影響前期小于后期，后期差異更為明顯。綜合菌絲生長覆蓋培養(yǎng)基表面達(dá)50%和100%的情況，發(fā)現(xiàn)cfcc 6592，cfcc 83417菌株在蔗糖碳源培養(yǎng)基上生長速度最快，cfcc84695菌株在葡萄糖碳源培養(yǎng)基上的生長速度最快。cfcc 6594菌株在麥芽糖碳源培養(yǎng)基上生長速度最慢，在30 d的觀察期內(nèi)，菌絲生長覆蓋未達(dá)到培養(yǎng)基表面的50%，在蔗糖和可溶性淀粉上的生長速度顯著大于葡萄糖，根據(jù)試驗(yàn)所得數(shù)值大小，以及試劑配制的便利性，選擇蔗糖作為適宜碳源進(jìn)行下一步氮源試驗(yàn)。在上述碳源上各菌株的生長速度大小順序依次為cfcc 6592> cfcc 84695> cfcc 83417> cfcc 6594，而以菌株cfcc6592菌絲體生長最快，在蔗糖碳源培養(yǎng)基上，平均9.3 d可以長滿平板培養(yǎng)皿培養(yǎng)基表面。

表2 不同碳源培養(yǎng)基上菌絲體生長覆蓋培養(yǎng)基表面50%(A)、100%(B)所需時(shí)間 d

2.2.2 不同氮源對松乳菇菌絲體生長的影響 試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，綜合菌絲生長覆蓋至培養(yǎng)基表面50%和100% 這2個(gè)指標(biāo)，cfcc6592菌株菌絲體在以酒石酸銨為氮源的培養(yǎng)基上的生長速度較快，cfcc83417在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上的生長速度最快。cfcc6594，cfcc84695菌株在硝酸鈉氮源培養(yǎng)基上生長速度顯著小于其他4個(gè)不同氮源，其他4個(gè)氮源上的生長速度無顯著差異，但在酒石酸銨上標(biāo)準(zhǔn)誤較小，穩(wěn)定性高于另3個(gè)氮源，因此選擇酒石酸銨為其最適氮源。生長速度大小順序依次為cfcc6594菌株>cfcc6592菌株>cfcc84695菌株>cfcc83417菌株，而cfcc6594菌株菌絲體在酒石酸銨培養(yǎng)基上平均5.8 d可以長滿平板培養(yǎng)皿。

表3 不同氮源培養(yǎng)基上菌絲體生長覆蓋培養(yǎng)表面50%(A)、100%(B)所需的時(shí)間 d

2.2.3 添加松針?biāo)畬λ扇楣骄z體生長的影響 添加松針?biāo)畬λ扇楣骄z體生長的影響如表4所示。從表4中可知，添加松針?biāo)蟾骶甑木z生長速度顯著提升，可以在更短的時(shí)間內(nèi)長滿培養(yǎng)基面積的50%和100%，且添加松針?biāo)畬臃N后期的菌絲生長速度影響更大。其中cfcc 83417菌株的生長速度最快，僅需3.0 d便可以長滿整個(gè)培養(yǎng)基表面，cfcc 83417菌株為最優(yōu)菌株。

表4 添加松針?biāo)畬λ扇楣骄z體生長的影響

3 結(jié)論

(1)不同菌株菌絲生長速度有所不同，其最適碳源、氮源有所不同；添加松針?biāo)梢杂行岣?個(gè)菌株cfcc 6594，cfcc 84695，cfcc 6592和cfcc 83417菌絲的生長速度。其中，碳源和松針?biāo)畬λ扇楣骄z生長速度的影響在接種前期小于后期。

(2)cfcc 83417菌株為最優(yōu)菌株，平均3.0 d便可長滿培養(yǎng)基表面，在最適培養(yǎng)基中生長速度顯著大于其他菌株，其最適碳源為蔗糖，最適氮源為蛋白胨。故確定其最適培養(yǎng)基配方為KH2PO4(0.3 g)、MgSO4(0.5 g)、FeSO4(0.5 g)、蔗糖(19.9 g)、瓊脂(20 g)、蛋白胨(1 g)、VB1(0.1 g)、松針?biāo)?1 000 mL)。

(3)cfcc 6592，cfcc 6594菌株的最適碳源為蔗糖，最適氮源為酒石酸銨，其最適培養(yǎng)基配方為KH2PO4(0.3 g)、MgSO4(0.5 g)、FeSO4(0.5 g)、蔗糖(19.9 g)、瓊脂(20 g)、酒石酸銨(0.89 g)、VB1(0.1 g)、松針?biāo)?1 000 mL)。

(4)cfcc 84695菌株在葡萄糖碳源培養(yǎng)基上生長速度顯著大于其他幾個(gè)碳源培養(yǎng)基，酒石酸銨為其最適氮源，最適培養(yǎng)基配方為KH2PO4(0.3 g)、MgSO4(0.5 g)、FeSO4(0.5 g)、葡萄糖(20 g)、瓊脂(20 g)、酒石酸銨(0.89 g)、VB1(0.1 g)、松針?biāo)?1 000 mL)。