陳 輝，黃惠華

(華南理工大學 食品科學與工程學院， 廣東 廣州 510000)

菠蘿蛋白酶是存在于菠蘿中的一種蛋白水解酶，可以對氨基酸殘基之間的肽鍵進行水解。菠蘿蛋白酶在蛋白質多肽制備、肉類嫩化等領域有重要應用，在消炎、抗水腫，促進抗生素藥物的吸收，預防血小板聚集等方面都被證實具有明顯作用[1]。菠蘿蛋白酶作為生物活性物質發(fā)揮作用時，很容易受外界環(huán)境影響[2]，因此，增強酶的儲存和操作穩(wěn)定性是其實際應用的一個重要因素。和游離酶相比，固定化酶具有穩(wěn)定性好、易回收、可重復利用等優(yōu)點[3]。固定化效果的好壞很大程度上取決于載體材料的選擇，因此選擇一種合適的固定化酶載體尤為重要[4]。纖維素作為一種天然高分子材料，來源豐富、成本低，但由于纖維素在普通溶劑中的難溶解性[5]，將纖維素作為固定化酶載體的研究較少報道。將纖維素在離子液體中溶解并改性不僅能形成水凝膠的三維網絡空間結構，還能賦予纖維素更多的與酶分子結合的功能基團，使其成為理想的固定化酶載體[6-7]；同時，作為一種廢棄資源的利用，將菠蘿皮渣纖維素(pineapple peel cellulose，PPC)作為酶的固定化載體，也具有重要的意義。本實驗擬將菠蘿皮渣纖維素在離子液體中溶解并用L-絲氨酸改性，改性產物用來固定化菠蘿蛋白酶，并對固定化工藝和酶學特性進行研究，希望得到一種良好的固定化酶載體。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菠蘿皮渣，廣州市場收集；離子液體[Bmim]Cl，中科院蘭州化學物理研究所；菠蘿蛋白酶(300 U/mg，CAS:8002-43-5)，上海麥克林生化有限科技公司；L-絲氨酸、氫氧化鈉、氯乙酸鈉、乙酸、戊二醛、L-半胱氨酸和EDTA·2Na、酪蛋白、三氯乙酸，以上試劑皆為化學純或分析純。

1.2 儀器與設備

BSA12MCW型精密分析天平，賽多利斯儀器有限公司；DF- 101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，廣州市星爍儀器有限公司； UV- 1800型紫外/可見分光光度計，日本島津公司；JW- 3021HR型高速冷凍離心機，安徽嘉文儀器裝備有限公司；VECTOR33型傅里變換葉紅外光譜儀，德國Bruker公司。

1.3 實驗方法

1.3.1菠蘿皮渣纖維素的提取

采用Dai等[8]的方法從菠蘿皮渣中提取纖維素。將菠蘿皮渣榨汁，得到的殘渣用清水沖洗后于50 ℃烘箱中干燥，粉碎后過80目篩，得到菠蘿皮渣原纖維。稱取一定量菠蘿皮渣原纖維，加入蒸餾水(料液比為1∶20，g/mL)，于80 ℃水浴鍋中攪拌2.0 h，過濾，濾渣中加入質量濃度為75 mg/mL的亞氯酸鈉溶液(pH值3.8～4.0)(料液比1∶20，g/mL)，于80 ℃水浴鍋中反應5.0 h以除去木質素。將混合物過濾，用蒸餾水沖洗至濾渣為純凈的白色。向濾渣中加入10%氫氧化鈉溶液(料液比1∶15)，室溫下攪拌處理10.0 h，除去半纖維素和其他雜質，過濾。用蒸餾水洗滌至中性，然后用95%乙醇洗滌，冷凍干燥即得PPC，過100目篩備用。

1.3.2L-絲氨酸改性菠蘿皮渣纖維素的制備

稱取10.0 g離子液體[Bmim]Cl于試管中，在110 ℃磁力攪拌油浴鍋中溶解。另稱取一定量提取的PPC添加到溶解的離子液體[Bmim]Cl中，110 ℃磁力攪拌5.0 h，充分溶解PPC。調節(jié)溫度為80 ℃，加入一定質量的L-絲氨酸，繼續(xù)磁力攪拌2.0 h。PPC上被活化的羥基與L-絲氨酸發(fā)生反應，將氨基接枝到PPC上。反應結束后，用蒸餾水充分浸泡以置換出離子液體[Bmim]Cl，得到L-絲氨酸改性菠蘿皮渣纖維素(modified pineapple peel cellulose，MPPC)。將樣品冷凍干燥后粉碎，過60目篩，備用。

1.3.3改性菠蘿皮渣纖維素固定化菠蘿蛋白酶的制備

稱取得到的MPPC粉末20 mg于試管中，加入4 mL菠蘿蛋白酶溶液(用pH值為7.0的磷酸緩沖溶液配制，離心去除不溶物，調節(jié)菠蘿蛋白酶質量濃度為1 mg/mL)。參考Isobe等[9]的方法，將混合物震蕩24.0 h，通過改性纖維素的功能基團與菠蘿蛋白酶分子之間的化學吸附，以及改性纖維素三維網絡結構對菠蘿蛋白酶分子的物理吸附來吸附菠蘿蛋白酶，吸附完成后離心。將下層沉淀置于4 mL戊二醛溶液中進一步交聯(lián)一段時間，再次離心后用蒸餾水清洗數(shù)次，得到改性菠蘿皮渣纖維素固定化菠蘿蛋白酶(modified pineapple peel cellulose immobilized bromelain，MPPC-Br)，冷凍干燥備用。

1.3.4固定化菠蘿蛋白酶制備條件優(yōu)化

分別研究了PPC與離子液體[Bmim]Cl的質量比、L-絲氨酸與PPC的質量比、戊二醛溶液體積分數(shù)以及交聯(lián)時間對固定化菠蘿蛋白酶活性的影響。固定L-絲氨酸與PPC的質量比為1∶1、戊二醛溶液體積分數(shù)為1%、交聯(lián)時間為1.0 h，考察不同PPC與離子液體[Bmim]Cl的質量比對固定化菠蘿蛋白酶活性的影響；固定PPC與離子液體[Bmim]Cl的質量比為3∶100、戊二醛溶液體積分數(shù)為1%、交聯(lián)時間為1.0 h，考察不同L-絲氨酸與PPC的質量比對固定化菠蘿蛋白酶活性的影響；固定PPC與離子液體[Bmim]Cl的質量比為3∶100、L-絲氨酸與PPC的質量比為1∶1、交聯(lián)時間為1.0 h，考察不同戊二醛溶液體積分數(shù)對固定化菠蘿蛋白酶活性的影響；固定PPC與離子液體[Bmim]Cl的質量比為3∶100、L-絲氨酸與PPC的質量比為1∶1、戊二醛溶液體積分數(shù)為1%，考察不同交聯(lián)時間對固定化菠蘿蛋白酶活性的影響。

1.3.5菠蘿蛋白酶活力的測定

菠蘿蛋白酶活性的測定[10]：取1 mL酶液，置于37.2 ℃水浴中預熱10 min，加入同樣在37.2 ℃預熱的酪蛋白溶液2 mL(質量濃度為2 mg/mL，用0.2 mol/L pH值為7.0的磷酸鹽緩沖溶液配制)，混合搖勻后準確反應10 min，加入體積分數(shù)為10%的三氯乙酸溶液3 mL終止反應，將混合物保溫10 min后，在8 000 r/min下離心10 min，取上清液，測定其在275 nm波長下的吸光度。對照組是取1 mL酶液，在37.2 ℃水浴中預熱10 min后，先加入3 mL體積分數(shù)為10%的三氯乙酸溶液，反應10 min；再加入2 mL酪蛋白溶液，保溫10 min。在8 000 r/min下離心10 min，取上清液，測定其在275 nm波長下的吸光度。MPPC-Br的活力測定，是將20 mg MPPC-Br浸入1 mL 0.2 mol/L pH值為7.0的磷酸緩沖溶液中，其余步驟相同。菠蘿蛋白酶活性定義為：1 g(干重)固定化酶或1 mL酶液在上述條件下水解酪蛋白，每分鐘產生1 μg酪氨酸，即為一個酶活力單位，表示為U。

1.3.6結構表征與分析

1.3.6.1 紅外光譜分析

對PPC、MPPC、菠蘿蛋白酶以及MPPC-Br進行紅外光譜分析。測定條件為：在4 000～500 cm-1的頻率范圍內以4 cm-1的分辨率進行FT-IR測量。

1.3.6.2 熱穩(wěn)定性分析

通過熱分析儀(TGA)對PPC、MPPC及MPPC-Br進行熱穩(wěn)定性分析。測定條件為：在N2氛圍下以10 ℃/min的加熱速率從室溫升溫至500 ℃。

1.3.6.3 X射線衍射分析

采用X射線衍射儀對PPC、MPPC及MPPC-Br進行XRD測試，測試條件為：衍射角2θ為4°～ 40°，掃描速度設定為2°/min，管壓和管流分別設置為40 kV和40 mA。

2 結果與分析

2.1 PPC、MPPC、菠蘿蛋白酶以及MPPC-Br的表征結果

2.1.1PPC、MPPC、菠蘿蛋白酶以及MPPC-Br的結構分析

圖2 PPC、MPPC和MPPC-Br的TG 和DTG的分析結果Fig.2 Results of TG and DTG analysis of PPC, MPPC and MPPC-Br

圖1 PPC、MPPC、MPPC-Br及菠蘿蛋白酶的紅外光譜Fig.1 FT-IR spectra of PPC, MPPC,MPPC-Br and bromelain

2.1.2PPC、MPPC及MPPC-Br的熱重分析結果

圖2為PPC、MPPC及MPPC-Br的熱重分析圖。3種物質的熱分解過程都可以分為兩個階段，第一階段發(fā)生在50～80 ℃附近，是由于樣品中的水分蒸發(fā)導致的質量損失；第二階段是樣品的熱降解過程，PPC的失重峰值出現(xiàn)在355 ℃附近，MPPC的峰值出現(xiàn)在308 ℃附近，而MPPC-Br的峰值出現(xiàn)在345 ℃附近。另外，當溫度到達500 ℃時，PPC的殘留質量為19.77%，MPPC的殘留質量為18.00%，MPPC-Br的殘留質量為23.70%。說明PPC經改性后纖維素分子結構發(fā)生了變化，熱穩(wěn)定性降低[15]，用戊二醛將菠蘿蛋白酶分子交聯(lián)到MPPC上后熱穩(wěn)定性又有所上升。

2.1.3PPC、MPPC以及MPPC-Br的XRD分析結果

圖3是PPC、MPPC和MPPC-Br的X衍射圖譜。PPC在2θ為22.2°處有一個很強的吸收峰，在2θ為15.7°和2θ為34.6°處分別有一個較弱的吸收峰，這些都屬于典型的天然纖維素Ⅰ型結構的特征衍射峰[16]。將PPC在離子液體[Bmim]Cl中用L-絲氨酸改性后，在2θ為15.7°和2θ為22.2°處的衍射峰向左偏移，且強度減小，在2θ為34.6°處的衍射峰已經完全消失。這些結果表明，改性后的菠蘿皮渣纖維素晶體結構從纖維素Ⅰ型轉變?yōu)槔w維素Ⅱ型，而纖維素Ⅱ型的晶體結構沒有纖維素Ⅰ型穩(wěn)定，在離子液體中溶解后，結構松散，有利于與氨基酸的接枝共聚反應[17]。另外，MPPC-Br與MPPC比較，其衍射峰沒有明顯變化。

圖3 PPC、MPPC及MPPC-Br的衍射圖譜Fig.3 XRD patterns of PPC, MPPC and MPPC-Br

2.2 菠蘿蛋白酶固定化條件的優(yōu)化結果

2.2.1PPC與離子液體[Bmim]Cl的質量比對固定化酶活性的影響

PPC與離子液體[Bmim]Cl的質量比對固定化酶活性的影響，實驗結果如圖4。圖4中，當PPC與離子液體[Bmim]Cl的質量比為1∶100，此時相對酶活性只有69.6%，這可能是因為MPPC含量太少，形成的凝膠結構不緊密，不能很好地與酶分子結合。隨著PPC與離子液體[Bmim]Cl的質量比增加，相對酶活性顯著增加，當PPC與離子液體[Bmim]Cl的質量比為3∶100時，此時相對酶活性達到最大，為100%。繼續(xù)增加PPC與離子液體[Bmim]Cl的質量比，相對酶活性略有減小，這可能是因為在此PPC與離子液體[Bmim]Cl的質量比值下，溶解的MPPC分子中，與酶的結合位點都得到了充分利用，因此選擇PPC與離子液體[Bmim]Cl的質量比為3∶100。

圖4 PPC與離子液體的質量比對固定化酶活性的影響Fig.4 Effect of mass ratio of PPC to ionic liquid on activity of immobilized enzyme

2.2.2L-絲氨酸與PPC質量比對固定化酶活性的影響

圖5 L-絲氨酸與PPC質量比對固定化酶活性的影響Fig.5 Effect of mass ratio of L-serine to PPC on activity of immobilized enzyme

L-絲氨酸與PPC質量比對固定化酶活性的影響，實驗結果如圖5。圖5中，當L-絲氨酸與PPC質量比為1∶3時，相對酶活性為29.9%；隨著L-絲氨酸與PPC質量比的增加，相對酶活性也顯著增加，當L-絲氨酸與PPC質量比為1∶1時，相對酶活性達到最大，為100%，這是因為隨著L-絲氨酸含量的增加，更多的L-絲氨酸接枝到PPC上，從而增加了與菠蘿蛋白酶的結合位點，酶得以充分的固定化。繼續(xù)增大L-絲氨酸與PPC質量比，相對酶活性不再提高，這可能是因為PPC上活化的羥基及其結合位點已全部飽和。因此選擇L-絲氨酸與PPC質量比為1∶1。

2.2.3戊二醛溶液體積分數(shù)對固定化酶活性的影響

戊二醛溶液體積分數(shù)對固定化酶活性的影響，實驗結果如圖6。圖6中，隨著戊二醛溶液體積分數(shù)的增加，相對酶活性呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，這是因為低濃度的戊二醛的交聯(lián)不夠充分，而濃度過高則會導致酶分子本身的結構發(fā)生改變，從而影響了酶的活性。

圖6 戊二醛體積分數(shù)對固定化酶活性的影響Fig.6 Effect of glutaraldehyde volume fraction on activity of immobilized enzyme

圖7 交聯(lián)時間對固定化酶活性的影響Fig.7 Effect of crosslinking time on activity of immobilized enzyme

2.2.4交聯(lián)時間對固定化酶活性的影響

交聯(lián)時間對固定化酶活性的影響，實驗結果如圖7。圖7中，隨著交聯(lián)時間的增加，固定化酶相對酶活性呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當交聯(lián)時間小于1.0 h時，交聯(lián)程度不夠，不能很好地固定菠蘿蛋白酶。但交聯(lián)時間過長，菠蘿蛋白酶與MPPC緊密結合，導致酶的活性位點不能很好地與底物分子結合，從而影響了酶的相對活性。因此選擇交聯(lián)時間為1.0 h比較合適。

2.3 MPPC-Br的特性分析

2.3.1MPPC-Br的熱穩(wěn)定性

將MPPC-Br和游離酶分別在不同的溫度環(huán)境下(40～80 ℃)放置2.0 h，研究溫度對酶活性的影響，結果如圖8。隨著溫度的升高，MPPC-Br在50 ℃時相對酶活性有所提升，這說明50 ℃是MPPC-Br的最適反應溫度；繼續(xù)升高溫度，相對酶活性緩慢減小，但是到達80 ℃時，相對酶活性依然還有82.0%。而隨著溫度的升高，游離菠蘿蛋白酶的相對酶活性急劇減小，50 ℃時就只剩下48.0%，80 ℃已基本檢測不到活性，這說明MPPC-Br比游離酶具有更好的溫度穩(wěn)定性。這是因為菠蘿蛋白酶和MPPC在形成水凝膠過程中，通過固定化形成了共價鍵或氫鍵，酶活性位點的空間結構發(fā)生了改變，MPPC-Br的熱穩(wěn)定性得以提高，同時水凝膠對酶分子也有一定的保護作用。

圖8 MPPC-Br的熱穩(wěn)定性Fig.8 Thermal stability of MPPC-Br

2.3.2MPPC-Br的酸堿穩(wěn)定性

分別將MPPC-Br和游離酶在不同pH值條件下放置24.0 h，測定其酶活性，結果如圖9。圖9中，pH值為2.0時，MPPC-Br的相對酶活性為80.6%，而游離酶的相對酶活性為55.8%；pH值小于4.0時，游離酶隨著pH值的下降相對酶活性顯著下降，而MPPC-Br相對酶活性變化不大，說明MPPC-Br比游離酶更耐酸性環(huán)境。MPPC-Br在pH值為4.0時穩(wěn)定性最好，而游離酶在pH值為5.0時穩(wěn)定性最好，說明MPPC-Br較游離酶最適反應pH值向酸性移動。

圖9 MPPC-Br的酸堿穩(wěn)定性Fig.9 pH stability of MPPC-Br

3 結 論

本實驗將PPC在離子液體中改性并用于固定化菠蘿蛋白酶。所制備的MPPC-Br活性受PPC與離子液體的質量比、L-絲氨酸與PPC的質量比、戊二醛體積分數(shù)以及交聯(lián)時間的影響。當PPC與離子液體的質量比為3∶100，L-絲氨酸與PPC的質量比為1∶1，戊二醛體積分數(shù)為1.0%，交聯(lián)時間為1.0 h時，MPPC-Br的活性最高。在80 ℃環(huán)境下放置2.0 h后，MPPC-Br仍然具有82.0%的相對酶活，而游離菠蘿蛋白酶在此條件下幾乎失活，說明MPPC-Br具有更好的溫度穩(wěn)定性。MPPC-Br在pH為4.0時穩(wěn)定性較好，而游離酶在pH為5.0時穩(wěn)定性更好，說明MPPC-Br比游離酶更耐酸性環(huán)境。本實驗以菠蘿皮渣為原料，開發(fā)了一種新的固定化酶載體，對廢棄資源的高值化利用具有重要意義。所制備的固定化菠蘿蛋白酶具有較好的溫度穩(wěn)定性和酸環(huán)境穩(wěn)定性，希望能為其他以纖維素為基礎的固定化酶載體的開發(fā)提供理論參考。