申昌軍 張帥 李浩鵬

[摘要] 目的 探討沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）在四氯化碳（CCl4）致小鼠肝纖維化肝臟中的活性變化及姜黃素對(duì)肝纖維化的干預(yù)作用與分子機(jī)制。 方法 選取C57BL/6小鼠24只，隨機(jī)分為正常組、模型組和姜黃素治療組，每組8只。腹腔注射CCl4制備肝纖維化模型，建模后姜黃素治療組給予0.5%羧甲基纖維素鈉姜黃素懸液灌胃;模型組及正常組給予0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃，6周后處死小鼠。HE染色檢測(cè)小鼠肝臟病理變化情況;檢測(cè)各組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、SIRT1活性;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原（CollⅠ）mRNA表達(dá)，及Cleaved-caspase3、CollⅠ蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果 模型組血清中ALT、AST、IL-6、TNF-α的表達(dá)量均顯著高于正常組（均P < 0.01），而治療組血清ALT、AST、IL-6、TNF-α表達(dá)量均低于模型組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）;模型組肝臟組織細(xì)胞中SIRT1的酶活性低于正常組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。治療組SIRT1的酶活性明顯高于模型組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。模型組肝臟組織中TGF-β1、α-SMA的mRNA表達(dá)及CollⅠ表達(dá)量顯著高于正常組，Cleaved-caspase3顯著低于正常組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01），治療組TGF-β1、α-SMA的mRNA表達(dá)及CollⅠ表達(dá)量低于模型組，Cleaved-caspase3顯著高于模型組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。 結(jié)論 姜黃素對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化具有抑制作用，其機(jī)制可能是通過上調(diào)SIRT1活性，減輕炎性反應(yīng)，抑制肝星狀細(xì)胞的活化，拮抗肝臟纖維化。

[關(guān)鍵詞] 肝臟;纖維化;姜黃素;炎性反應(yīng);沉默信息調(diào)節(jié)因子1

[中圖分類號(hào)] R285.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）03（c）-0011-05

[Abstract] Objctive To investigate the activity of silencing information regulator 1 （SIRT1） in the liver of carbon tetrachloride （CCl4） induced liver fibrosis in mice， and to investigate the effect of curcumin on liver fibrosis and its molecular mechanism. Methods Twenty-four C57BL/6 mice were randomly divided into normal group， model group and Curcumin treatment group， with 8 mice in each group. Hepatic fibrosis model was prepared by intraperitoneal injection of CCl4. After the modeling， the curcumin treatment group was given 0.5% Carboxymethyl Cellulose Sodium Curcumin Suspension by gavage. The model group and the normal group were given 0.5% Sodium Carboxymethyl Cellulose by gavage， the mice were killed after 6 weeks. HE staining was used to detect the pathological changes of mouse liver. The levels of serum alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， interleukin-6 （IL-6）， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and activity of SIRT1 were detected. Transforming growth factor β1 （TGF -β1）， α-smooth muscle actin （α-SMA）， collagen typeⅠ （Coll Ⅰ） mRNA expression， and Cleaved - caspase3， Coll Ⅰ protein expression. Results The expression levels of ALT， AST， IL-6 and TNF-α in serum of the model group were all significant higher than those of the normal group （all P < 0.01）. The expression levels of ALT， AST， IL-6 and TNF-α in the treatment group were all lower than those in the model group， and the differences were highly statistically significant （all P < 0.01）. The enzyme activity of SIRT1 in the liver cells of the model group was lower than that of the normal group， and the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. The enzyme activity of SIRT1 in the treatment group was significantly higher than that in the model group， and the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. Model group in the liver tissue， TGF-β1， α-SMA mRNA and Coll Ⅰ expression of amount of expression were significantly higher than those of normal group， Cleaved-caspase3 was significantly lower than that of normal group， with highly statistically significant differences （all P < 0.01）. The mRNA expression of TGF-β1， α-SMA and Coll Ⅰ expression quantity in the treatment group were lower than those in the model group， Cleaved-caspase3 was significantly higher than that of model group， with highly statistically significant differences （all P < 0.01）. Conclusion Curcumin has an inhibitory effect on CCl4-induced liver fibrosis， and the mechanism may be to up-regulate the activity of SIRT1， thereby reducing the inflammatory response， inhibiting the activation of hepatic stellate cells， and antagonizing liver fibrosis.

[Key words] Liver; Fibrosis; Curcumin; Inflammation; Silencing information regulator 1

酒精性肝病、慢性肝炎、自身免疫性肝病等多種慢性肝病，往往導(dǎo)致肝纖維化病變。針對(duì)肝纖維化，目前臨床上尚無特異性治療方法阻斷甚至逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)程。因此，預(yù)防和逆轉(zhuǎn)肝纖維化仍然是眾多肝臟疾病研究的熱點(diǎn)及攻克的主要目標(biāo)。姜黃素是姜黃根莖中提取的一種黃色酸性酚類物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多種藥理活性[1]。近年來，姜黃素的拮抗纖維化作用日益受到人們的關(guān)注，但其拮抗纖維化的分子機(jī)制仍不清楚。本研究擬在已有研究的基礎(chǔ)上，通過CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型，明確姜黃素抑制肝纖維化的作用及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、主要試劑及儀器來源

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠24只，6～8周齡，體重18～20 g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號(hào)：SYXK（軍）2012-0022）。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（貨號(hào)：h052）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）（貨號(hào)：H007）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）（貨號(hào)：C009-2-1）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）（貨號(hào)：C010-2-1）均從南京建成生物工程研究所購買。姜黃素（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20050102）;SYBR Green MasterMix（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，批號(hào)：A8605），Trizol試劑（美國Invitrogen公司，批號(hào)：AHF1813A），7900HT型熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備

C57BL/6小鼠采用22～26℃、SPF級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境，光照控制12 h明暗交替，濕度50%～60%。24只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、姜黃素治療組，每組8只（動(dòng)物倫理批準(zhǔn)號(hào)：XJYYLL-201805023）。模型組、姜黃素治療組小鼠按10 mL/kg給予腹腔注射10% CCl4的油劑溶液（CCl4∶橄欖油為1∶3～4次/周），經(jīng)病理切片證實(shí)肝纖維化模型建立成功。6周后姜黃素治療組采用姜黃素（劑量為40 mg/100 g）與0.5%羧甲基纖維素鈉混懸后按1 mL/100 g灌胃，每周3次，共6周;模型組自第7周起給予0.5%羧甲基纖維素鈉1 mL/100 g灌胃，每周3次，共6周;正常組，前6周給予腹腔橄欖油稀釋液，每周3次，第7周起給予0.5%羧甲基纖維素鈉1 mL/100 g灌胃，每周3次，共6周。灌胃6周后，取小鼠肝臟組織進(jìn)行病理切片及對(duì)血清相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 形態(tài)學(xué)檢測(cè)? 取各組固定的組織標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋，切片，脫蠟后HE染色，鏡下觀察組織形態(tài)。

1.3.2 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)? 小鼠眼球采血后，靜置15 min，4℃低溫離心（離心半徑15 cm，1500 r/min）15 min，分離血清，按試劑盒說明書測(cè)ALT、AST、IL-6、TNF-α水平。

1.3.3 酶活性試劑盒檢測(cè)肝臟組織沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）活性? 肝臟組織低溫裂解離心（4℃低溫離心，離心半徑15 cm，1500 r/min，15 min），收集上清。按照試劑盒說明書檢測(cè)SIRT1酶活性。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)肝臟組織中纖維化相關(guān)分子TGF-β1、Ⅰ型膠原、α-SMA的表達(dá)? 采用Trizol一步法提取肝臟組織中總RNA，定量后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，引物序列分別為：甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）上游5′-TTCCTTCCTGGGCATGGAGTCC-3′，下游5′-TGGCGTAC-AGGTCTTTGCGG-3′;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）上游5′-CCACCTGCAAGACCATCGAC-3′，下游5′-CT-GGCGAGCCTTAGTTTGGAC-3′;Ⅰ型膠原（CollⅠ）上游5′-TGACTGGAAGAGCGGAGAGT-3′，下游5′-AT-CCATCGGTCATGCTCTCT-3′;平滑肌肌動(dòng)蛋白α-SMA上游5′-CCCAGACATCAGGGAGTAATGG-3′，下游TCTATCGGATACTTCAGCGTCA-3′。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火延伸20 s，循環(huán)40次，按照2-△△Ct的相對(duì)定量方法計(jì)算。

1.3.5 蛋白印跡法（Westen blot）檢測(cè)肝臟組織中Cleaved-caspase3、CollⅠ的表達(dá)? 肝臟組織，低溫組織勻漿，進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，分別加入Cleaved-caspase3、Call Ⅰ一抗（1∶1000），4℃孵育過夜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶3000），37℃孵育40 min?；瘜W(xué)發(fā)光，凝膠圖像分析系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，三組間比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用兩樣本獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（LSD-t檢驗(yàn)）。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝臟病理變化情況

HE染色顯示正常組（圖1A）鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，小葉及匯管區(qū)無異常。而模型組（圖1B）小鼠注射CCl4后，光鏡下觀察到明顯的小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞腫脹，氣球樣變可見，明顯腫脹變形，伴點(diǎn)狀、片狀壞死及炎癥細(xì)胞浸潤，大量膠原沉積，在匯管區(qū)之間、匯管區(qū)與中央靜脈之間形成纖維間隔。治療組（圖1C）經(jīng)過干預(yù)后肝細(xì)胞輕度腫脹，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，膠原沉積量降低程度明顯。

A：正常組;B：模型組;C：治療組

2.2 三組小鼠血清中AST、ALT表達(dá)水平的比較

與正常組比較，模型組AST、ALT表達(dá)量明顯高于正常組，治療組AST、ALT表達(dá)量均低于模型組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表1。

2.3 三組小鼠血清中IL-6、TNF-α表達(dá)水平的比較

模型組IL-6、TNF-α表達(dá)量均明顯高于正常組，治療組IL-6、TNF-α表達(dá)量均低于模型組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表2。

2.4 三組小鼠肝臟細(xì)胞中SIRT1活性的比較

正常組小鼠SIRT1相對(duì)活性為（127.62±17.34）%，模型組為（64.80±7.25）%，治療組為（104.72±11.14）%，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 17.36，P = 0.012）。模型組小鼠SIRT1相對(duì)活性明顯低于正常組（t = 13.57，P < 0.01）;治療組小鼠SIRT1相對(duì)活性明顯高于模型組（t = 6.54，P = 0.001）。

2.5 三組小鼠肝臟組織纖維化相關(guān)分子TGF-β1、CollⅠ、α-SMA表達(dá)及Cleaved-caspase3、CollⅠ相關(guān)蛋白表達(dá)的比較模型組中TGF-β1、α-SMA、CollⅠ的mRNA及CollⅠ蛋白表達(dá)明顯高于正常組;治療組TGF-β1、α-SMA、Coll Ⅰ的mRNA及Coll Ⅰ蛋白表達(dá)明顯低于模型組，模型組小鼠肝臟中Cleaved-caspase3的表達(dá)低于正常組，而治療組Cleaved-caspase3的表達(dá)高于模型組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。見表3～4、圖2。

3 討論

損傷后的肝臟在各種刺激下，肝臟內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）產(chǎn)生和降解失衡，導(dǎo)致過度增生與異常沉積，使肝臟結(jié)構(gòu)破壞、功能異常，從而導(dǎo)致肝臟纖維化[2]。目前肝纖維化治療主要是通過抗病因治療，尚無特效的藥物治療。

臨床上無論是肝臟損傷、病毒感染、藥物作用、自身免疫等因素最終都會(huì)經(jīng)過肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）活化發(fā)展成纖維化[3]。當(dāng)肝臟受到損傷后直接或間接激活HSC，使其由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，導(dǎo)致大量ECM的形成。IL-6、TNF-α等促炎介質(zhì)能通過介導(dǎo)炎性反應(yīng)啟動(dòng)纖維化的形成，并可通過促進(jìn)ECM的合成而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[4]。已有研究顯示，TGF-β1能夠刺激ECM合成，抑制其降解，是最強(qiáng)促纖維化細(xì)胞因子[5]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，正常組TNF-α、IL-6、TGF-β1表達(dá)均明顯增多，而治療組可顯著降低TNF-α、IL-6、TGF-β1的表達(dá)。

此外，HSC的活化可促進(jìn)ECM的大量表達(dá)，在此過程中纖維化相關(guān)因子α-SMA的生成被認(rèn)為是HSC活化的主要標(biāo)志物[6]，而CollⅠ是ECM的主要成分，產(chǎn)生大量的CollⅠ是纖維化疾病的共同病理特征。Inagaki等[7]研究顯示，抑制CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠體內(nèi)CollⅠ的表達(dá)，可減輕ECM的過度增生。在本研究中，與模型組比較，治療組可降低ALT、AST活性，減少致纖維化因子α-SMA，CollⅠ的表達(dá)。通過模型驗(yàn)證，治療組顯示出良好的拮抗肝損傷和阻止纖維化的功能，且可能通過抑制HSC的活化發(fā)揮作用。

有研究報(bào)道[8-10]，SIRT1在多種疾病中具有重要的調(diào)節(jié)作用。Cappetta等[11]發(fā)現(xiàn)，激活SIRT1可通過下調(diào)TGF-β/smad3信號(hào)通路發(fā)揮抗心肌纖維化實(shí)現(xiàn)。本研究檢測(cè)了姜黃素對(duì)SIRT1活性表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組SIRT1的酶活性顯著下調(diào)。而治療組可顯著改善CCl4介導(dǎo)的肝臟組織細(xì)胞SIRT1的酶活性水平。提示SIRT1信號(hào)分子可能參與姜黃素對(duì)肝臟纖維化的拮抗作用。

目前研究顯示，在不同器官中，姜黃素拮抗纖維化可能有多種途徑，與細(xì)胞的氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等密切相關(guān)[12-14]。而SIRT1是生物體內(nèi)具有重要意義的去乙?；浮Ｑ芯匡@示，SIRT1可調(diào)控肝臟疾病的多個(gè)環(huán)節(jié)[15]。在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以抑制腫瘤進(jìn)展[16]。此外，SIRT1可顯著抑制高脂飲食導(dǎo)致的肝損傷[17-19]。而脂肪肝、肝纖維化、肝癌本身可能是相互轉(zhuǎn)化[20-21]。本研究顯示，姜黃素可能通過調(diào)控SIRT1進(jìn)而抑制HSC的活化拮抗肝纖維化。姜黃素可以在肝臟病變的多個(gè)環(huán)節(jié)影響疾病的進(jìn)展、改善結(jié)局。因此，深入研究姜黃素-SIRT1調(diào)節(jié)軸的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)多種肝臟疾病的共同調(diào)控通路，可以為臨床治療提供新的思路。

綜上所述，姜黃素可通過抑制HSC的活化拮抗CCl4介導(dǎo)的肝臟纖維化，在此過程中可能通過增加SIRT1的酶活性發(fā)揮作用。

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（收稿日期：2019-09-30? 本文編輯：封? ?華）