張聰 胡娜 李珊 鄭國華 邱振鵬

摘 要 目的：研究馬錢苷對肝癌細(xì)胞HepG2增殖及凋亡的影響，并探討其作用機制。方法：運用CCK-8法檢測不同質(zhì)量濃度（10、25、50、100、150、200、300、400 ?g/mL）的馬錢苷作用24、48 h對HepG2細(xì)胞增殖活性的影響。將HepG2細(xì)胞分為對照組和馬錢苷低、中、高濃度組（50、100、150 μg/mL），加藥作用24 h后，采用Hoechst 33342熒光染色法檢測細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和周期分布情況;采用Western blotting法檢測各組細(xì)胞中G1/S-特異性周期蛋白D1（Cyclin D1）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、活化的Caspase-3（Cleaved-Caspase-3）、Caspase-9、Cleaved-Caspase-9蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：馬錢苷對HepG2細(xì)胞增殖具有抑制作用，且呈濃度依賴趨勢。與對照組比較，馬錢苷低、中、高濃度組細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、碎裂等凋亡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.01）;細(xì)胞主要阻滯于S期;馬錢苷低、中、高濃度組細(xì)胞中Cyclin D1、PCNA、Caspase-3蛋白的相對表達(dá)量均顯著降低、Cleaved-Caspase-3蛋白的相對表達(dá)量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），馬錢苷中、高濃度組細(xì)胞中Cleaved-Caspase-9蛋白的相對表達(dá)量均顯著升高、Bcl-2和Caspase-9蛋白的相對表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：馬錢苷對HepG2細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，并可誘導(dǎo)其凋亡，其作用機制可能與抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，促進Caspase-3、Caspase-9活化有關(guān)。

關(guān)鍵詞 馬錢苷;肝癌細(xì)胞HepG2;增殖;凋亡;機制

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of loganin on the proliferation and apoptosis of liver cancer HepG2 cells， and to explore its mechanism. METHODS： CCK-8 assay was used to detect the effects of different concentrations （10， 25， 50， 100， 150， 200， 300， 400 ?g/mL） of loganin on the proliferation activity of HepG2 cells for 24 and 48 h. HepG2 cells were divided into control group， loganin low-concentration， medium-concentration and high-concentration groups （50， 100， 150 μg/mL）. After treated for 24 h， morphological changes of apoptosis of cells were detected by Hoechst 33342 fluorescence staining. The apoptosis and cycle distribution of cells were detected by flow cytometry. Western blotting was used to detect protein expression of Cyclin D1， PCNA， Bcl-2， Caspase-3， Cleaved-Caspase-3， Caspase-9 and Cleaved-Caspase-9. RESULTS： Loganin inhibited the proliferation of HepG2 cells， in concentration-dependent trend. Compared with control group， apoptosis as pyknosis and fragmentation occurred， and the apoptosis rate increased significantly in loganin low-concentration， medium-concentration and high-concentration groups （P<0.01）; the cell were mainly blocked in S phase; relative protein expression of Cyclin D1， PCNA and Caspase-3 were significantly decreased， while that of Cleaved-Caspase-3 were significantly increased in loganin low- concentration， medium-concentration and high-concentration groups （P<0.05 or P<0.01）; relative protein expression of Cleaved-Caspase-9 were increased significantly， while that of Bcl-2 and Caspase-9 were decreased significantly in loganin medium-concentration and high-concentration groups （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Loganin can significantly inhibit the proliferation and induce apoptosis of HepG2 cells， the mechanism of which may be associated with inhibiting Bcl-2 protein expression and promoting Caspase-3， Caspase-9 activation.

KEYWORDS? ?Loganin; Liver cancer HepG2 cells; Prolifera- tion; Apoptosis; Mechanism

肝癌是臨床上常見的肝臟惡性腫瘤，其發(fā)病率居世界腫瘤發(fā)病率第5位[1]，病死率僅次于肺癌，位居世界惡性腫瘤病死率的第2位[2-3]。流行病學(xué)研究報告顯示，2018年世界癌癥新增病例中，肝癌患者的占比高達(dá)8.2%[4];我國肝癌發(fā)病率居世界首位[5]，每年新增肝癌患者人數(shù)占全球新增肝癌患者人數(shù)的50%以上[6]，現(xiàn)已成為嚴(yán)重威脅國民生命健康的重大問題。肝癌具有惡性程度高、易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)等特點[7]，臨床治療難度大。目前，臨床上肝癌主要以藥物治療為主，但是索拉菲尼等肝癌一線治療藥物長期使用易使患者產(chǎn)生耐受和多種不良反應(yīng)（如高血壓、肝功能異常、腎毒性等）[8-9]，嚴(yán)重影響藥物的療效及患者的預(yù)后。因此，探尋有效防治肝癌的藥物是一個亟待解決的問題。

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸（Cornus officinalis Sieb. et Zucc.）的干燥成熟果實，是被湖北省非物質(zhì)文化遺產(chǎn)“武當(dāng)山道教醫(yī)藥”代表性傳承人陳吉炎教授建議優(yōu)先發(fā)展的道地藥材之一[10]。該藥材主要含有環(huán)烯醚萜苷、鞣質(zhì)、有機酸等化學(xué)成分[11-12]。其中，馬錢苷（Loganin）是山茱萸中主要的環(huán)烯醚萜苷類成分[13]，同時也是山茱萸質(zhì)量控制指標(biāo)之一，其具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理學(xué)作用[14-15]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，山茱萸具有降血糖、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗氧化等作用，對肝癌、肺癌、胃癌等多種惡性腫瘤也具有抑制作用[16-17]。馬錢苷作為山茱萸中主要的活性成分，對結(jié)腸癌細(xì)胞、人惡性黑色素瘤細(xì)胞均具有抑制作用[18-19]，提示該化合物具有開發(fā)成抗腫瘤藥物的潛力。已有研究表明，山茱萸提取物能夠抑制B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）的表達(dá)，同時活化胱天蛋白酶3（Caspase-3）從而誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞凋亡[20-21]。為了進一步證明馬錢苷是否同樣也具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用，本研究以肝癌細(xì)胞HepG2為模型，考察不同濃度馬錢苷對HepG2細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并初步探討其可能的作用機制，以期為馬錢苷防治肝癌提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

MCO-15AC型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）;Trans-Blot? TurboTM型全能型蛋白轉(zhuǎn)膜儀、Power Pac Basic型電泳儀、xMark型酶標(biāo)儀、TC20型細(xì)胞計數(shù)儀（美國Bio-Rad公司）;Allegra 64R型高速冷凍離心機（美國Beckman公司）;NoVoCyte D2060R型流式細(xì)胞儀（艾森生物科技有限公司）;CKX31型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）;XB 220A型分析天平（瑞士Sartorius公司）;G：BOX型成像分析系統(tǒng)（英國Syngene公司）;MK-10型干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

馬錢苷對照品（上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號：4917，純度：>98%）;胎牛血清（美國Gibco公司）;CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司，批號：CK04）;兔G1/S-特異性周期蛋白D1（Cyclin D1）單克隆抗體、小鼠增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）單克隆抗體、小鼠Bcl-2單克隆抗體、兔Caspase-3單克隆抗體、兔活化的胱天蛋白酶3（Cleaved-Caspase-3）單克隆抗體、兔Caspase-9單克隆抗體、兔Cleaved-Caspase-9單克隆抗體、兔β肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG二抗（美國CST公司，批號：2978、2586、15071、9665、9664、9508、7237、4970、7074、7076）;Hoechst 33342熒光染料（北京索萊寶科技有限公司，批號：B8040）;磷脂酰絲氨酸蛋白抗體-熒光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號：KGA107、KGA512）;BCA蛋白定量試劑盒、ECL超敏化學(xué)發(fā)光液、M-PERTM哺乳動物蛋白抽提試劑（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：23227、34580、78501）;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠試劑盒（上海雅酶生物科技有限公司，批號：18D250）;DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2～7.4）、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素均購自美國Hyclone公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

HepG2細(xì)胞株購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（以下簡稱“培養(yǎng)基”），于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（以下細(xì)胞培養(yǎng)條件相同）。

2.2 馬錢苷對照品母液配制

精密稱取馬錢苷對照品20.0 mg，溶于1 mL培養(yǎng)基中，配成質(zhì)量濃度為2×104 μg/mL的馬錢苷對照品母液，經(jīng)0.22 ?m微孔濾膜濾過，置于-20 ℃保存，備用。

2.3 馬錢苷的細(xì)胞毒性考察

采用CCK-8法檢測。取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，按5 000個/孔接種于96孔板中，將細(xì)胞隨機分為對照組和馬錢苷不同濃度組，每組設(shè)6個復(fù)孔。馬錢苷各濃度組細(xì)胞分別加入馬錢苷終質(zhì)量濃度分別為10、25、50、100、150、200、300、400 ?g/mL（濃度設(shè)置參考胡小紅等[22]研究方法）的含藥培養(yǎng)基100 μL，對照組細(xì)胞加入等體積培養(yǎng)基，另設(shè)不含細(xì)胞只含培養(yǎng)基的空白組。分別于培養(yǎng)24、48 h時，各孔加入CCK-8試劑10? μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，隨后使用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定各孔的吸光度（A），計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（A給藥組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%。上述試驗重復(fù)3次。

2.4 馬錢苷對細(xì)胞凋亡的影響考察

采用Hoechst 33342熒光染色法檢測細(xì)胞凋亡形態(tài)變化。取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，按1×106個/孔接種至6孔板中，將細(xì)胞隨機分為對照組和馬錢苷低、中、高濃度組，每組設(shè)3個復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)至單層細(xì)胞密度約90%左右時，棄去培養(yǎng)基，馬錢苷低、中、高濃度組細(xì)胞分別加入馬錢苷終質(zhì)量濃度分別為50、100、150? ??g/mL的含藥培養(yǎng)基5 mL，對照組細(xì)胞加入等體積培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，經(jīng)Hoechst 33342熒光染料避光染色10 min后，用PBS清洗5 min×3次，使用熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。另取HepG2細(xì)胞同上述方法分組、給藥、培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒中的Binding buffer 500 μL重懸，并加入Annexin Ⅴ-FITC和PI染液各5 μL，輕輕混勻，室溫下避光孵育10～15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率：細(xì)胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。上述試驗重復(fù)3次。

2.5 馬錢苷對細(xì)胞周期分布的影響考察

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布。取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，按照“2.4”項下方法分組、給藥，每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞周期試劑盒中的PI染液500 μL重懸，并避光孵育30 min后，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布。上述試驗重復(fù)3次。

2.6 馬錢苷對細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響考察

采用Western blotting法檢測蛋白表達(dá)。取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，按2×106個/皿接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，按“2.4”項下方法分組。細(xì)胞培養(yǎng)至單層細(xì)胞密度約90%時，棄去培養(yǎng)基，馬錢苷低、中、高濃度組細(xì)胞加入含馬錢苷終質(zhì)量濃度分別為50、100、150 ?g/mL的含藥培養(yǎng)基10 mL，對照組細(xì)胞加入等體積培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，用M-PERTM哺乳動物蛋白抽提試劑提取細(xì)胞蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。將提取的細(xì)胞蛋白置于干式恒溫器中于95 ℃變性5 min后即得蛋白樣品。取蛋白樣品40 ?g經(jīng)過SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜（0.45 ?m）上，以5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入兔Cyclin D1單克隆抗體、小鼠PCNA單克隆抗體、小鼠Bcl-2單克隆抗體、兔Caspase-3單克隆抗體、兔Cleaved-Caspase-3單克隆抗體、兔Caspase-9單克隆抗體、兔Cleaved-Caspase-9單克隆抗體、兔β-actin單克隆抗體（稀釋度均為1 ∶ 1 000），于4 ℃下孵育過夜;TBST清洗10 min×3次，再分別加入相應(yīng)二抗（HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗對應(yīng)Cyclin D1、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Caspase-9、Cleaved-Caspase-9、β-actin蛋白，HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG二抗對應(yīng)PCNA、Bcl-2蛋白，稀釋度均為1 ∶ 10 000），室溫孵育1 h;用TBST清洗10 min×3次，經(jīng)ECL試劑顯色后采用成像分析系統(tǒng)成像，使用Image J 1.8.0圖像軟件處理，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參（β-actin）條帶的灰度值比值作為目標(biāo)條帶的相對表達(dá)量。上述試驗重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 馬錢苷對細(xì)胞增殖的影響

與對照組比較，不同濃度馬錢苷作用24、48 h后，細(xì)胞的存活率均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且呈濃度依賴趨勢。當(dāng)馬錢苷質(zhì)量濃度為50 ?g/mL、作用24 h時的細(xì)胞存活率為（73.10±2.23）%，提示該條件下馬錢苷具有明顯的細(xì)胞毒性，故以50 ?g/mL作為后續(xù)試驗中馬錢苷給藥的最低濃度，依次選擇100、150 ?g/mL作為馬錢苷給藥的中濃度和高濃度，并選擇24 h為作用時間。不同濃度馬錢苷對HepG2細(xì)胞增殖的影響詳見表1。

3.2 馬錢苷對細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst 33342染色結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞核完整，邊緣清晰，未見亮藍(lán)色細(xì)胞核（核固縮）。經(jīng)不同濃度馬錢苷作用24 h后，各組細(xì)胞中細(xì)胞數(shù)均減少，且均出現(xiàn)不同程度的核固縮、碎裂等凋亡現(xiàn)象，其中高濃度組細(xì)胞此現(xiàn)象最顯著。各組細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的顯微鏡圖詳見圖1（圖中箭頭所指為凋亡細(xì)胞）。

與對照組比較，馬錢苷低、中、高濃度組細(xì)胞的凋亡率均顯著升高，且呈濃度依賴趨勢（P<0.01）。各組細(xì)胞凋亡的散點圖詳見圖2，凋亡率詳見表2。

3.3 馬錢苷對細(xì)胞周期分布的影響

經(jīng)不同濃度馬錢苷作用24 h后，馬錢苷低、中、高濃度組的S期細(xì)胞百分比均較對照組顯著升高，G2/M期細(xì)胞百分比均較對照組顯著降低（P<0.05或P<0.01）;而G0/G1期細(xì)胞百分比與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組細(xì)胞周期分布的流式細(xì)胞圖詳見圖3，細(xì)胞周期分布百分比詳見表2。

3.4 馬錢苷對細(xì)胞中Cyclin D1、PCNA蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，馬錢苷低、中、高濃度組細(xì)胞中Cyclin D1、PCNA蛋白的相對表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且呈濃度依賴趨勢。各組細(xì)胞中Cyclin D1、PCNA蛋白表達(dá)的電泳圖詳見圖4，相對表達(dá)量詳見表3。

3.5 馬錢苷對細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，馬錢苷低、中、高濃度組細(xì)胞中Cleaved-Caspase-3蛋白的相對表達(dá)量均顯著升高、Caspase-3蛋白的相對表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;馬錢苷中、高濃度組細(xì)胞中Cleaved-Caspase-9蛋白的相對表達(dá)量均顯著升高、Bcl-2和Caspase-9蛋白的相對表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖詳見圖5，相對表達(dá)量詳見表4。

4 討論

肝癌惡性程度高，但早期癥狀輕微，不易察覺，故臨床上肝癌早期診斷率較低，即使在發(fā)達(dá)國家，肝癌早期診斷患者也僅占30%左右，大部分肝癌患者在確診時已進入晚期，這造成肝癌臨床治療難度大，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量[23-24]。雖然隨著科學(xué)技術(shù)的進步，近年來我國肝癌發(fā)生率有所降低，但肝癌依然嚴(yán)重威脅人類生命健康。腫瘤細(xì)胞異常增殖和抗凋亡在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，因此針對腫瘤細(xì)胞的異常增殖和凋亡失衡對其進行干預(yù)性調(diào)節(jié)成為了干預(yù)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要治療策略。

有研究表明，馬錢苷在體外對人惡性黑色素瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性增殖均具有一定抑制作用[18-19，25]，但是關(guān)于馬錢苷抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡的相關(guān)研究較少。本研究結(jié)果表明，不同濃度馬錢苷對HepG2細(xì)胞增殖均具有抑制作用，且其抑制作用隨馬錢苷濃度增加呈現(xiàn)增大的趨勢。通過Hoechst 33342熒光染色法與流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，不同濃度的馬錢苷均能顯著誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，同時將細(xì)胞周期阻滯于S期。

Cyclin D1是高度保守的細(xì)胞周期家族基因，能夠調(diào)控細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）從而協(xié)調(diào)細(xì)胞增殖[26]，其在細(xì)胞周期過程中主要調(diào)控細(xì)胞周期G1/S期[27]。有研究表明，Cyclin D1在肝癌、乳腺癌、膀胱癌中呈過表達(dá)[28-29]，從而改變細(xì)胞周期進程，促使腫瘤發(fā)生。PCNA是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)，能夠促進腫瘤細(xì)胞的異常增殖[30]。本研究結(jié)果表明，馬錢苷能夠通過抑制Cyclin D1、PCNA基因蛋白的表達(dá)水平將細(xì)胞阻滯于S期，從而抑制HepG2細(xì)胞增殖。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個復(fù)雜過程，在腫瘤形成過程中激活抗凋亡信號通路和/或抑制促凋亡信號能夠促進細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，加速腫瘤形成[31]。目前研究得較為深入的與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的凋亡相關(guān)基因主要有Bcl-2家族、Caspases家族等，其中Bcl-2是重要的抗凋亡因子，能夠增強細(xì)胞抵抗力，是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中重要的抗凋亡基因;而Caspases家族則是重要的誘導(dǎo)凋亡因子，其中Caspase-9是誘發(fā)凋亡的主要基因，Caspase-3是參與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要基因[32]。Caspase-3、Caspase-9能夠降解DNA修復(fù)酶聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP），從而直接參與細(xì)胞凋亡[33-34]。Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9是Caspase-3、Caspase-9活化后的剪切形式，在細(xì)胞凋亡過程中Caspase-3、Caspase-9活化為其剪切形式進而發(fā)揮誘發(fā)細(xì)胞凋亡的作用。有研究指出，激活Caspases、抑制Bcl-2的表達(dá)能夠促進腫瘤細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用[35]。因此，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)可作為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的一種策略。本研究結(jié)果表明，不同濃度的馬錢苷能夠抑制Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9等蛋白的表達(dá)，促進Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9蛋白的表達(dá)，提示馬錢苷誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的作用可能與抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，促進Caspase-3、Caspase-9活化有關(guān)。山茱萸在我國多地均有分布，自然資源豐富，山茱萸既可食用又是中醫(yī)臨床上應(yīng)用廣泛的藥物，具有巨大藥用價值和功能食品開發(fā)潛能。馬錢苷作為山茱萸中的主要活性成分，本研究為山茱萸抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)研究和應(yīng)用開發(fā)提供了理論依據(jù)。接下來，本課題組將在動物實驗中進一步研究馬錢苷抑制肝癌的作用并探討其作用機制，為馬錢苷及山茱萸防治肝癌提供更多的理論依據(jù)。

參考文獻

[ 1 ] SUN X，LI L，MA H，et al. Bisindolylmaleimide alkaloid BMA-155Cl induces autophagy and apoptosis in human hepatocarcinoma HepG2 cells through the NF-κB p65 pathway[J]. Acta Pharmacologica Sinica，2017，38（4）：524-538.

[ 2 ] ARE C，MEYER B，STACK A，et al. Global trends in the burden of liver cancer[J]. J Surg Oncol，2017，115（5）：591-602.

[ 3 ] ZHOU J，SUN H，WANG Z，et al. Guidelines for diagnosis and treatment of primary liver cancer in China：2017 edition[J]. Liver Cancer，2018，7（3）：235-260.

[ 4 ] BRAY F，F(xiàn)ERLAY J，SOERJOMATARAM I，et al. Global cancer statistics 2018：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin，2018，68（6）：394-424.

[ 5 ] WANG F，F(xiàn)AN J，ZHANG Z，et al. The global burden of liver disease：the major impact of China[J]. Hepatology，2014，60（6）：2099-2108.

[ 6 ] FU J，WANG H. Precision diagnosis and treatment of liver cancer in China[J]. Cancer Letters，2018.DOI：10.1016/j.canlet.2017.10.008 .

[ 7 ] HIROKAWA F，HAYASHI M，ASAKUMA M，et al. Risk factors and patterns of early recurrence after curative hepatectomy for hepatocellular carcinoma[J]. Surg Oncol，2016，25（1）：24-29.

[ 8 ] SANTONI M，CONTI A，DE GIORGI U，et al. Risk of gastrointestinal events with sorafenib，sunitinib and pazopanib in patients with solid tumors：a systematic review and meta-analysis of clinical trials[J]. Int J Cancer，2014，135（4）：763-773.

[ 9 ] RANDRUP HC，GRIMM D，BAUER J，et al. Effects and side effects of using sorafenib and sunitinib in the treatment of metastatic renal cell carcinoma[J]. Int J Mol Sci，2017.DOI：10.3390/ijms18020461.

[10] 陳吉炎，王雪芹，安志斌，等.武當(dāng)山地區(qū)道地藥材的發(fā)展模式研究[J].中國藥房，2011，22（43）：4123-4125.

[11] 冀麟麟，王欣，鐘祥健，等.山茱萸的化學(xué)成分及其抗氧化活性[J].現(xiàn)代食品科技，2019，35（5）：137-143.

[12] 葉賢勝，赫軍，張佳琳，等.山茱萸的化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志，2016，41（24）：4605-4609.

[13] 雷小小，蘇艷瑩，李美云，等.山茱萸環(huán)烯醚萜苷中馬錢苷和莫諾苷的研究進展[J].上海中醫(yī)藥雜志，2018，52（1）：104-108.

[14] HE K，SONG S，ZOU Z，et al. The hypoglycemic and synergistic effect of loganin，morroniside，and ursolic acid isolated from the fruits of cornus officinalis[J]. Phytother Res，2016，30（2）：283-291.

[15] KIM MJ，BAE GS，JO IJ，et al. Loganin protects against pancreatitis by inhibiting NF-kappaB activation[J]. Eur J Pharmacol，2015.DOI：10.1016/j.ejphar.2015.09.019.

[16] HWANG K，HWANG Y，SONG J. Antioxidant activities and oxidative stress inhibitory effects of ethanol extracts from Cornus officinalis on raw 264.7 cells[J]. BMC Complem Altern M，2016.DOI：10.1186/s12906-016-1172-3.

[17] HUANG J，ZHANG Y，DONG L，et al. Ethnopharmacology，phytochemistry，and pharmacology of cornus officinalis sieb. et zucc[J]. J Ethnopharmacol，2018.DOI：10.1016/j.jep.2017.11.010.

[18] 黨文軍.馬錢苷抑制人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞的作用及機制研究[D].哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

[19] 胡小紅，王美玲，諶江城，等.馬錢苷對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖的影響及機制初探[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2015，31（1）：80-83.

[20] HOSSEINPOUR-JAGHDANI F，SHOMALI T，GHOLIPOUR-SHAHRAKI S，et al. Cornus mas：a review on traditional uses and pharmacological properties[J]. J Complement Integr Med，2017.DOI：10.1515/jcim-2016-0137.

[21] 趙建龍，李世朋.山茱萸果核醇提取物誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的研究[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2015，31（13）：1276-1278.

[22] 胡小紅，王美玲，諶江城，等.馬錢苷對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖的影響及機制初探[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2015，31（1）：80-83.

[23] FU J，WANG H. Precision diagnosis and treatment of liver cancer in China[J]. Cancer Letters，2018.DOI：10.1016/j.canlet.2017.10.008.

[24] DELLA CORTE C，TRIOLO M，IAVARONE M，et al. Early diagnosis of liver cancer：an appraisal of international recommendations and future perspectives[J]. Liver International，2016，36（2）：166-176.

[25] KHAN M，GARG A，SRIVASTAVA SK，et al. A cytotoxic agent from Strychnos nux-vomica and biological evaluation of its modified analogues[J]. Med Chem Res，2012，21（10）：2975-2980.

[26] QIE S，DIEHL JA. Cyclin D1，cancer progression，and opportunities in cancer treatment[J]. J Mol Med，2016，94（12）：1313-1326.

[27] 林宇靜，郭瑞珍，王海青.細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)相關(guān)因子Cyclin D1-CDK4-p21在瘢痕癌中的表達(dá)及意義[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2014，27（9）：923-927.

[28] QIU Z，ZHANG C，ZHOU J，et al. Celecoxib alleviates AKT/c-Met-triggered rapid hepatocarcinogenesis by suppressing a novel COX-2/AKT/FASN cascade[J]. Mol Carcinog，2019，58（1）：31-41.

[29] BURANDT E，GRUENERT M，LEBEAU A，et al. Cyclin D1 gene amplification is highly homogeneous in breast cancer[J]. Breast Cancer，2016，23（1）：111-119.

[30] JURIKOVA M，DANIHEL L，POLAK S，et al. Ki67，PCNA，and MCM proteins：markers of proliferation in the diagnosis of breast cancer[J]. Acta Histochemica，2016，118（5）：544-552.

[31] WANG Y，LI YJ，HUANG XH，et al. Liensinine perchlorate inhibits colorectal cancer tumorigenesis by inducing mitochondrial dysfunction and apoptosis[J]. Food Funct，2018，9（11）：5536-5546.

[32] 楊濤，費振海，鐘興明. Caspase家族與細(xì)胞凋亡的研究進展[J].浙江醫(yī)學(xué)，2018，40（18）：2083-2087.

[33] MOYA A，SAKAMAKI K，MASON BM，et al. Functional conservation of the apoptotic machinery from coral to man：the diverse and complex Bcl-2 and caspase repertoires of Acropora millepora[J]. BMC Genomics，2016.DOI：10.1186/s12864-015-2355-x.

[34] CHOUDHARY GS，AL-HARBI S，ALMASAN A. Caspase-3 activation is a critical determinant of genotoxic stress-induced apoptosis[J]. Methods Mol Biol，2015.DOI：10.1007/978-1-4939-1661-0_1.

[35] LI WH，WU HJ，LI YX，et al. MicroRNA-143 promotes apoptosis of osteosarcoma cells by caspase-3 activation via targeting Bcl-2[J]. Biomed Pharmacother，2016.DOI：10.1016/j.biopha.2016.03.001.

（收稿日期：2019-10-08 修回日期：2019-12-29）

（編輯：鄒麗娟）