盧森華 甘洋縈 唐蓮 張鳳懿 蘇本偉

摘 要 目的：評價不同寄主來源的桑寄生藥材質量，建立具有寄主針對性的桑寄生藥材質量評價方法。方法：采用高效液相色譜（HPLC）法測定，色譜柱為CAPCELL PAK C18 MGⅡ，流動相為甲醇-0.2%磷酸水溶液，流速為1.0 mL/min（梯度洗脫），測定波長為254 nm，柱溫為30 ℃。以16批不同寄主來源的桑寄生藥材為樣品（桑樹寄主、柳樹寄主、茶樹寄主、楓香樹寄主的桑寄生各4批），采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A 版）生成HPLC特征圖譜并進行相似度評價，再通過與對照品比對進行色譜峰的指認。采用IBM SPSS 19.0軟件對結果進行聚類分析和主成分分析。結果：從建立的共有特征圖譜中標定出了11個共有峰，并指認了8、10、11號峰分別為蘆丁、槲皮苷和槲皮素;16批樣品的相似度均大于0.9，不同寄主來源的桑寄生在化學成分種類上基本一致（各共有峰相對保留時間的RSD為0.03%～0.40%），但同一成分的含量差異較大（各共有峰相對峰面積的RSD為27.00%～64.20%）。聚類分析將16批不同寄主來源的桑寄生分成3類;主成分分析結果提示，槲皮苷、槲皮素和蘆丁對桑寄生品質有明顯的影響，可作為桑寄生質量評價指標，且楓香樹寄主桑寄生樣品的整體質量最好（綜合評分最高）。結論：HPLC特征指紋圖譜結合化學計量的方法可作為不同寄主來源的桑寄生藥材質量評價和控制的技術方法。

關鍵詞 桑寄生;不同寄主;高效液相色譜法;指紋圖譜;聚類分析;主成分分析;質量評價

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a host specific method for the quality evaluation of Taxillus chiueusis by evaluating the quality of T. chiueusis from different hosts sources. METHODS： HPLC was adopted with CAPCELL PAK C18 MGⅡ column， mobile phase consisted of methanol-0.2% phosphoric acid， volume flow 1.0 mL/min （gradient elution）， detection wavelength of 254 nm， column temperature of 30 ℃. Totally of 16 batches of T. chiueusis from different hosts sources were collected as sample （4 batches from tea host， maple host， willow host and mulberry host respectively）. HPLC characteristic chromatogram was established with TCM Chromatogram Fingerprint Similarity Evaluation System （2004A edition）， and similarity evaluation was performed. The peak was identified by comparison with the reference substance. IBM SPSS 19.0 software was used for cluster analysis and principal component analysis. RESULTS： Totally 11 common peaks were demarcated， peak No. 8， 10， 11 were identified as rutin， quercetin and quercitin. The similarity of 16 batches of samples was more than 0.9. The chemical components of T. chiueusis from different hosts sources were basically the same（RSDs of relative time of commom peaks were 0.03%-0.40%）， but the contents of the same component were quite different（RSDs of relative peak area of commom peaks were 27.00%-64.20%）. By cluster analysis， 16 batches of T. chiueusis from different hosts sources were divided into 3 types. The results of principle component analysis showed that quercetin， quercitin and rutin had significant effect on the quality of T. chiueusis， which could be used as the quality evaluation index， and the whole quality of maple host was the best （the highest comprehensive score）. CONCLUSIONS： HPLC fingerprint combined with chemometrics can be used to evaluate the quality of T. chiueusis from different hosts sources.

KEYWORDS? ?Taxillus chiueusis; Different hosts; HPLC;Fingerprint; Cluster analysis; Principal component analysis; Quality evaluation

桑寄生又稱廣寄生，為桑寄生科鈍果寄生屬植物桑寄生[Taxillus. chinensis （ DC.） Danser]的枝葉，其味苦、甘，性平，具有祛風濕、補肝腎、強筋骨、安胎等功效，常用于治療風濕痹痛、腰膝酸痛、頭昏目眩、筋骨痿弱、肢體偏枯、崩漏下血、便血、產(chǎn)后乳汁不下、胎動不安等癥[1-2]。現(xiàn)代藥理研究表明，桑寄生具有顯著的抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老以及降血脂、降血壓、降血糖等生物活性[3]。桑寄生屬于半寄生性植物藥材，常寄生于桑樹（即桑樹寄主桑寄生）、柳樹（即柳樹寄主桑寄生）、茶樹（即茶樹寄主桑寄生）、楓香樹（即楓香樹寄主桑寄生）等植物上。2015年版《中國藥典》（一部）對桑寄生藥材的寄主沒有明確規(guī)定，只要藥材基源為桑寄生[T. chinensis（DC.） Danser]均可入藥[4]。

寄主植物的復雜多樣性構成了桑寄生藥材重要的生物學特征，是影響桑寄生質量最直接的因素[5]。多項研究表明，寄主植物通過寄主與桑寄生藥材之間在化學成分、藥理作用等方面的特殊關系影響著桑寄生的藥材質量[6-7]。同時，因不同寄主來源的桑寄生藥材在藥理和藥效方面存在差異，可能在不同程度上影響桑寄生藥材質量的安全性和有效性[8]。因此，必須要對桑寄生寄主進行規(guī)范，才能實現(xiàn)對桑寄生藥材質量的有效控制。但目前不同寄主來源的桑寄生藥材質量有何差異還缺乏系統(tǒng)性研究報道。中藥指紋圖譜是運用高效液相色譜（HPLC）等技術對中藥化學信息以圖形的方式進行表征并加以描述，能夠成為中藥自身的“化學條形碼”，是一種綜合分析多種成分的有效手段[9]。再加上化學計量學（聚類分析和主成分分析等）在處理中藥指紋圖譜等多維數(shù)據(jù)的分析中具有明顯優(yōu)勢[10]。基于此，本文擬建立HPLC特征指紋圖譜，并結合化學計量學方法評價不同寄主來源的桑寄生的藥材質量，為不同寄主來源桑寄生藥材的質量評價提供一種科學的技術方法。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate3000型HPLC儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）;HH-S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）;Synergy?UV型超純水機（美國Millipore公司）;KQ- 500GDV型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;XS-205Du型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）;CX-200型高速多功能粉碎機（上海緣沃工貿(mào)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

16批不同寄主來源的桑寄生樣品均采集自廣西各地，藥材來源主要是采購和野外采集，所有樣品經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學李永華研究員鑒定均為桑寄生科鈍果寄生屬植物桑寄生[T. chinensis （DC.） Danser]的干燥帶葉莖枝;蘆丁對照品（批號：100080-201409，純度：91.9%）、槲皮苷對照品（批號：111538-201606，純度：90.6%）、槲皮素對照品（批號：100081-201509，純度：98.1%）均購自中國食品藥品檢定研究院標準物質和標準化管理中心;乙腈、甲醇（德國默克股份兩合公司，色譜純）;磷酸（天津市光復精細化工研究所，優(yōu)級純）;其余試劑均為分析純，水為超純水。不同寄主來源桑寄生藥材的基源信息見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK C18 MGⅡ（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液（B）（V/V），梯度洗脫（0～5 min，20%A;5～49 min，20%A→80%A;49～50 min，80%A→20%A）;流速：1.0 mL/min;檢測波長：254 nm;柱溫：30 ℃;進樣量：5 ?L。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取槲皮苷對照品11.36 mg、蘆丁對照品10.25 mg、槲皮素對照品11.15 mg，分別置于不同20 mL量瓶中，加適量甲醇超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz）5 min使溶解，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得各單一對照品溶液。再分別精密量取上述單一對照品溶液各1.0 mL，置于同一10 mL量瓶中，再用甲醇定容，搖勻，即得混合對照品溶液（每1 mL溶液中含槲皮苷51.5 ?g、蘆丁47.1 ?g、槲皮素54.7 ?g）。

2.2.2 供試品溶液 取桑寄生樣品約2.0 g，精密稱定，置于250 mL具塞平底燒瓶中，精密加入25%鹽酸-甲醇（1 ∶ 4，V/V）溶液25 mL，稱定質量，在恒溫（90 ℃）水浴鍋中水浴加熱回流提取2 h，冷卻后再次稱定質量，并用25%鹽酸-甲醇（1 ∶ 4，V/V）溶液補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 分別精密吸取“2.2.2”項下同一供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色圖譜。以11號峰（槲皮素峰）作為參照峰計算樣品中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積[10]。結果顯示，11個共有峰相對保留時間的RSD為0.01%～0.40%（n=6）、相對峰面積的RSD為0.05%～1.80%（n=6），表明本方法精密度較好。

2.3.2 重復性試驗 取桑寄生樣品（編號：S1）6份，每份約2.0 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以11號峰（槲皮素峰）作為參照峰計算樣品中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積[10]。結果顯示，11個共有峰相對保留時間的RSD為0.05%～0.50%（n=6）、相對峰面積的RSD為1.30%～5.60%（n=6），表明該方法重復性較好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液，分別于室溫下放置1、2、4、6、12、24 h后，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以11號峰（槲皮素峰）作為參照峰計算樣品中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積[10]。結果顯示，11個共有峰相對保留時間的RSD為0.05%～0.50%（n=6）、相對峰面積的RSD為0.10%～3.00%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩(wěn)定性較好。

2.4 HPLC特征指紋圖譜的建立與分析

2.4.1 HPLC特征指紋圖譜的生成 取16批不同寄主來源的桑寄生樣品各約2.0 g，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將16批不同寄主來源桑寄生樣品的圖譜及數(shù)據(jù)在Chromeleon變色龍7色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)中生成后綴為.cdf的文件，將此文件數(shù)據(jù)導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A 版）中，建立16批不同寄主來源桑寄生的HPLC疊加色譜圖[11]。以編號S1的樣品圖譜作為參照圖譜，設置時間窗寬度為0.1 min，進行多點校正和自動譜峰匹配生成桑寄生樣品的共有模式，并采用中位數(shù)法生成對照指紋圖譜（SR）[11]。16批不同寄主來源的桑寄生樣品HPLC疊加色譜圖見圖1，對照指紋圖譜見圖2。

2.4.2 相似度評價 以對照指紋圖譜為參照，進行16批不同寄主來源桑寄生樣品的整體相似度評價。結果，16批不同寄主來源桑寄生樣品的圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.9，表明構建的桑寄生對照指紋圖譜具有一定的代表性，也表明不同寄主來源桑寄生樣品之間差異不大，主要化學成分具有一致性。16 批不同寄主來源桑寄生樣品相似度評價結果見表2。

2.4.3 共有峰的指認及相關分析 在16批不同寄主來源桑寄生樣品的圖譜中共標定了11個共有峰。通過與混合對照品溶液的HPLC色譜圖（按“2.1”項下色譜條件進樣）對比，指認了8號峰為蘆丁、10號峰為槲皮苷、11號峰為槲皮素。槲皮素是2015年版《中國藥典》（一部）中桑寄生的含量測定指標[4]，加之槲皮素峰在色譜圖中保留時間適中、響應值較大、對稱因子及分離度等均符合要求[12]，且為所有桑寄生樣品共有，因此本研究選用槲皮素峰（11號峰）作為參照峰（S），計算16批不同寄主來源桑寄生樣品中11個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，16批桑寄生樣品中11個共有峰相對保留時間的RSD僅為0.03%～0.40%，相差較小;而相對峰面積的RSD為27.00%～64.20%，相差較大。由此可知，不同寄主來源的桑寄生樣品在化學成分種類上具有一致性，但同一成分的含量差異明顯。混合對照品溶液的色譜圖見圖3;16 批不同寄主來源的桑寄生樣品共有峰相對保留時間測定結果見表3，相對峰面積測定結果見表4。

2.5 化學計量學分析

2.5.1 聚類分析 運用IBM SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件，以16批不同寄主來源桑寄生樣品的11個共有峰的峰面積作為變量，采用組間連接聚類方法，以平方Euclidean距離為度量標準進行系統(tǒng)聚類分析[13]。結果，當分類距離d=15時，16批次不同寄主來源的桑寄生樣品可聚為3類：編號為S1～S4的樣品聚為第一類，均為桑樹寄主桑寄生樣品;編號為S9～S15的樣品聚為第二類，為茶樹寄主桑寄生和楓香樹寄主桑寄生樣品;編號為S5～S8和S16的樣品聚為第三類，除編號為S16的樣品為楓香樹寄主桑寄生樣品外其余均為柳樹寄主桑寄生樣品。16批不同寄主來源的桑寄生樣品聚類分析樹狀圖見圖4。

2.5.2 主成分分析 以主成分的特征根和貢獻率作為選擇主成分的依據(jù)，將16批不同寄主來源桑寄生樣品的11個共有峰的峰面積（16×11階原始數(shù)據(jù)矩陣）導入IBM SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件進行因子分析[14]。結果，提取到3個主成分因子，其特征根>0.9，累積方差貢獻率為83.664%，表明前3個主成分因子即可以代表樣品80%以上的信息;主成分因子1、2、3可作為桑寄生藥材的評價指標，適用于主成分分析。3個主成分因子的特征值和方差貢獻率見表5。

以主成分因子為變量繪制公因子碎石圖。結果顯示，最先提取到的3個主成分因子的斜率最大，表明所提取的3個主成分可以最大程度地反映桑寄生藥材的品質。然后將得到的成分矩陣進行正交旋轉，得到11個指標在3個主成分中的旋轉矩陣。結果顯示，第一主成分的信息主要來自于色譜峰5、6、7、3、2;第二主成分的信息主要來自于色譜峰10（槲皮苷）、11（槲皮素）、8（蘆?。┖?，此類峰的峰面積較大，表示成分含量較高，對桑寄生品質有明顯的影響;第三主成分的信息主要來自色譜峰4、1。根據(jù)旋轉成分矩陣可推測，槲皮苷、槲皮素和蘆丁對桑寄生品質有明顯的影響，可作為桑寄生質量評價指標。公共因子碎石圖見圖5，旋轉成分矩陣見表6。

以X1、X2、X3代表3個主成分來作為16批桑寄生樣品成分所表達的信息，以其11個共有峰的峰面積（A）為變量（標準化處理后峰面積，并非原始峰面積），建立品質評價模型[15]。得到第一主成分的線性關系表達式為：X1=-0.246A1+0.738A2-0.838A3-0.199A4+0.899A5+0.891A6+0.846A7-0.099A8+0.159A9-0.113A10+0.242A11;第二主成分的線性關系表達式為：X2=0.166A1+0.016A2-0.195A3+0.377A4-0.168A5-0.116A6+0.211A7+0.890A8+0.716A9+0.933A10+0.890A11;第三主成分的線性關系表達式為：X3=0.784A1-0.382A2+0.232A3+0.810A4-0.295A5+0.189A6-0.083A7+0.401A8+0.541A9+0.322A10-0.110A11。將上述表達式與所對應的3個主成分的方差貢獻率作內積后，得到桑寄生質量綜合評價函數(shù)的表達式為：X（綜合得分）=（41.497%X1+33.379%X2+8.788%X3）/83.664%，綜合得分越高表示藥材樣品的整體質量越好[15]。結果顯示，3批楓香樹寄主桑寄生樣品（S13～S15）的綜合得分位列前3名，表明這3批樣品的整體質量較好。16批不同寄主來源桑寄生主成分得分、綜合得分及排名見表7。

3 討論

在前期研究中，筆者參考文獻方法[6-8]分別考察了提取溶劑（甲醇、70%甲醇、甲醇-25%鹽酸溶液等）、提取方法（超聲和回流）和提取時間（30、60、120 min）等對桑寄生化學成分溶出的影響。結果發(fā)現(xiàn)，以甲醇-25%鹽酸（4 ∶ 1，V/V）為溶劑回流2 h提取時，桑寄生樣品溶液色譜圖中峰數(shù)最多，且峰面積較大。此外，筆者還考察了測定波長（220、254、330 nm）、色譜柱（ZORBAX SB-C18、CAPCELL PAK C18 MGⅡ）、柱溫（25、30 ℃）、進樣體積（5、10 ?L）、流動相體系（甲醇/乙腈-水/0.2%磷酸水溶液不同比例梯度洗脫）對桑寄生HPLC指紋圖譜分離效果的影響。結果，在本試驗確定的色譜條件下，HPLC特征指紋圖譜基線平穩(wěn)，分離度及峰形均良好。

本試驗中選擇每種寄主來源樣品各4批為代表，建立了不同寄主來源桑寄生的HPLC指紋圖譜。相似度評價結果顯示，16批不同寄主來源的桑寄生樣品在化學成分種類上基本一致，但含量差異較大。聚類分析結果顯示，16批次不同寄主來源的桑寄生樣品可共聚為3類（d=15時）。但當分類距離d=5時，第一類又可聚為2小類，S2～S4聚為一小類（桑樹寄主桑寄生），S1單獨聚為另一小類（桑樹寄主桑寄生）;第二類又可聚為2小類，S9～S12聚為一小類（茶樹寄主桑寄生），S13～S15聚為另一小類（楓香樹寄主桑寄生）;第三類又可聚為3小類，S7、S8聚為一小類（柳樹寄主桑寄生），S5、S6聚為另一小類（柳樹寄主桑寄生），S16單獨聚為一小類。這表明聚類分析（d=5）基本可識別不同寄主來源的桑寄生。主成分分析結果提示，槲皮苷、槲皮素和蘆丁對桑寄生品質有明顯的影響，可作為桑寄生質量評價指標，并且以楓香樹寄主桑寄生樣品的整體質量最好。

中藥指紋圖譜是對現(xiàn)行中藥質量控制方法的有益補充和提高[9]，雖然尚無法完全確定中藥物質群體的化學組成，但對于中藥質量控制具有積極的促進作用[16]。本研究建立了以相似度評價、聚類分析和主成分分析為核心的化學模式識別方法，對不同寄主來源的桑寄生質量進行研究，可為該藥材的質量評價提供參考，也可為提高其質量控制標準提供一定的方法支持。

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（收稿日期：2019-12-14 修回日期：2020-03-04）

（編輯：林 靜）