李蜜 高程海 姜舒 韋娟 劉思萍 戴恩枝 易湘茜

摘 要：該文設(shè)計(jì)9種分離培養(yǎng)基，采用稀釋涂布法從14份真紅樹植物的46份組織樣品中分離純化內(nèi)生細(xì)菌。并基于菌株形態(tài)學(xué)特征和16S rRNA基因序列確定分離菌株的種屬及分析其物種多樣性，采用秀麗隱桿線蟲模型篩選菌株延緩衰老活性。結(jié)果表明：（1）通過基因序列去重復(fù)后從46份真紅樹植物組織樣品中獲得32株海洋細(xì)菌，基于菌株16S rRNA基因序列信息分析，覆蓋12科17屬，其中芽孢桿菌屬（Bacillus）為優(yōu)勢菌屬，并獲得1株疑似橙單胞菌屬（Aurantimonas）新種，16S rRNA基因序列相似性低于97%;（2）經(jīng)過秀麗隱桿線蟲粗篩發(fā)現(xiàn)3株海洋細(xì)菌具有顯著延緩線蟲衰老的活性（P<0.05）。以上結(jié)果表明海南西海岸真紅樹內(nèi)生細(xì)菌具有物種多樣性，部分菌株具有延緩線蟲衰老活性。

關(guān)鍵詞：真紅樹植物，內(nèi)生細(xì)菌，物種多樣性，延緩衰老活性

Abstract：The bacteria were isolated and purified from 46 tissues of 14 true mangrove plants used nine kinds of isolation media by dilution coating method. The bacteria were isolated from strains，and the species and genus diversities were analyzed by bacteria morphological characteristics and 16S rRNA gene sequences. The anti-aging activities of the bacteria were tested by Caenorhabditis elegans screening models. The results were as follows：（1） The 32 marine bacteria were obtained from 46 tissues of true mangrove plants without repeatitions. The 32 bacteria to comparison of 16S rRNA gene sequences which could be classified into 12 families and 17 genera. The dominant genus were Bacillus. It was discovered that a novel strain of suspected genus Aurantimonas，which 16S rRNA gene sequence similarities were less than 97%; （2） The three cultured marine bacteria could significantly delay Caenorhabditis elegans developing and had dominant anti-aging activities（P<0.05）. All the above results indicate that the true mangrove plants collected from the west coast of Hainan have high species diversity and part strains are rich in anti-aging activity.

Key words：true mangrove plants，endophytic actinobacteria，species diversity，anti-aging activity

全世界紅樹植物共有24科30屬83種，主要分布在美洲、非洲和東南亞的熱帶和亞熱帶經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)（Holguin et al.，2001）。中國紅樹林主要分布于福建、海南、廣東和廣西等省（區(qū)）的沿海地區(qū)，其中真紅樹植物有11科24種（廖寶文等，2014）。林鵬等（1997）認(rèn)為真紅樹植物是指專一地生長于潮間帶的木本植物。紅樹林生長于缺氧、高養(yǎng)分和高鹽等特殊環(huán)境，可產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)豐富和活性顯著的次級(jí)代謝產(chǎn)物（袁獻(xiàn)溫等，2009;沈明曦等，2011）。而生活在其組織內(nèi)部的微生物，受特殊環(huán)境的影響易產(chǎn)生遺傳變異從而使物種多樣性豐富，代謝產(chǎn)物藥理活性獨(dú)特。近年來，從紅樹林植物中發(fā)現(xiàn)大量儲(chǔ)藏在植物內(nèi)部的微生物，主要活性有抗菌（李家怡等，2017）、抗病毒和細(xì)胞毒（李菲等，2016）等。李家怡等（2017）從廣西山口紅樹林自然保護(hù)區(qū)采集的紅海欖中分離得到17株內(nèi)生細(xì)菌，其中3株對(duì)副溶血弧菌具有較強(qiáng)的抑菌活性。劉月廉等（2010）從秋茄、白骨壤、無瓣海桑三種真紅樹植物的540 塊組織中分離到內(nèi)生細(xì)菌90株，其中菌株AC2對(duì)致皮膚病真菌具有較強(qiáng)的拮抗性。李菲等（2016）采用稀釋涂布法，從無瓣海桑中分離得到38株內(nèi)生細(xì)菌，其中5株具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。李菲等（2017）從廣西北海金海灣紅樹植物秋茄中得到50株內(nèi)生細(xì)菌，并篩選出37株細(xì)菌對(duì)甘蔗黑穗霉菌有抑制作用。由此可見，真紅樹細(xì)菌資源豐富，且藥理活性獨(dú)特，其多樣性值得我們深入研究。

當(dāng)代社會(huì)，人類生活水平與上個(gè)世紀(jì)相比較顯著提高，但人口老齡化趨勢日趨顯著（曾爾亢等，2012）。人口老齡化的加劇使得抗衰老不容忽視，同時(shí)也是急需解決的問題。紅樹林生態(tài)資源豐富，其中滋養(yǎng)著多樣性豐富的微生物，從紅樹林微生物中發(fā)現(xiàn)延緩衰老藥物是我們研究的關(guān)鍵問題。紅樹林位于海陸交界處，兼具有海洋和陸地的特征又存在區(qū)別。據(jù)資料顯示，真紅樹內(nèi)生微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的化學(xué)和藥理活性研究報(bào)道很多，但關(guān)于微生物代謝產(chǎn)物粗提物延緩衰老的藥理研究相對(duì)偏少。國內(nèi)外利用秀麗隱桿線蟲模型主要研究中藥提取物和保健產(chǎn)品的抗衰老，海洋微生物發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)線蟲延緩衰老的研究鮮有報(bào)道。陳亮穩(wěn)等（2013）發(fā)現(xiàn)蜜環(huán)菌菌索多糖能顯著延長秀麗隱桿線蟲的生存期，并對(duì)其生殖力無損害。Petrascheck et al.（2007）利用秀麗隱桿線蟲篩選抗衰老藥物，共篩選了8.8萬個(gè)化合物，發(fā)現(xiàn)115個(gè)化合物能延長線蟲的壽命。本課題組（李蜜等，2018）利用秀麗隱桿線蟲模型發(fā)現(xiàn)2株具有延緩衰老的海洋放線菌，能有效延遲線蟲的死亡時(shí)間。

海南西海岸位于北部灣灣區(qū)，其紅樹林物種多樣性豐富，并且滋生豐富的微生物資源。因此發(fā)掘其中真紅樹內(nèi)生細(xì)菌多樣性差異對(duì)海洋細(xì)菌資源的開發(fā)利用具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以海洋真紅樹植物為研究對(duì)象，采用稀釋涂布法對(duì)其展開內(nèi)生細(xì)菌多樣性研究;利用秀麗隱桿線蟲衰老模型對(duì)其代謝產(chǎn)物粗提物進(jìn)行延緩衰老活性篩選。為挖掘更多潛在新物種以及真紅樹細(xì)菌潛在的藥理活性、為研究新型抗衰老藥物提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

真紅樹植物樣品：14份真紅樹植物樣品于2017年7月采集于海南西海岸區(qū)域，具體樣品信息如表1，根部位5份樣品，莖14份，葉13份，花2份和胚軸12份，共46份真紅樹植物組織。其中，H1-H7真紅樹植物地理位置為109°59′37″ E、19°55′07″ N，H8-H14地理位置為109°31′50″ E、19°51′26″ N。樣品用無菌水沖洗其表面以去除表面雜質(zhì)，立即裝入自封采樣袋，置于采樣冰盒中24 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室，置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。野生型秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）、OP50尿嘧啶缺陷型大腸桿菌（Escherichia coli）均由廣西科學(xué)院汪斌博士提供。

1.2 方法

1.2.1 分離培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基參考李飛娜等（2017）設(shè)計(jì)如下9種，AGG：改良的高氏培養(yǎng)基;M4：海藻糖-天冬酰胺培養(yǎng)基;M5：海藻糖-脯氨酸培養(yǎng)基;M7：改良ISP5培養(yǎng)基;M9：精氨酸-天冬酰胺培養(yǎng)基;M10：改良淀粉-水解酪素培養(yǎng)基;P7：酪氨酸-天冬酰胺培養(yǎng)基;P3：燕麥培養(yǎng)基;M11：棉籽糖-組氨酸培養(yǎng)基。詳細(xì)配方信息如表2所示，每種培養(yǎng)基加入1 L海水、10 mL的復(fù)合鹽溶液和20 g的瓊脂，調(diào)節(jié)pH7.2，均于121 ℃下滅菌20 min（復(fù)合鹽溶液：KNO3 1.0 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，NH4NO3? 0.1 g，F(xiàn)eSO4 0.01 g，MnCl2·H2O 0.001 g，ZnSO4·7H2O 0.001 g和去離子水10 mL）。待培養(yǎng)基溫度降至50 ℃時(shí)加入抑制劑重鉻酸鉀使其終濃度為25 mg·L1，混勻。

純化及保藏培養(yǎng)基：改良ISP2固體培養(yǎng)基，酵母提取物2.0 g，麥芽提取物2.0 g，葡萄糖2.0 g，瓊脂20.0 g和海水1 000 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：ISP2液體培養(yǎng)基。

1.2.2 紅樹植物樣品的處理 參考李家怡等（2017）方法，對(duì)紅樹植物樣品進(jìn)行表面除雜和消毒，5%次氯酸鈉溶液浸泡8 min，無菌水沖洗至沒有殘留;75%的酒精溶液浸泡5 min，無菌水沖洗至無酒精。取大約2 g的新鮮樣品進(jìn)行研磨，吸取2 mL無菌水與樣品混勻，該濃度液作為樣品原液，再用無菌水依次稀釋到103和104組織懸液，置于4 ℃冰箱暫存。

1.2.3 菌株的分離純化及保藏 取103和104組織懸液0.2 mL，分別涂布于9種不同成分的分離培養(yǎng)基中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)14～30 d;通過形態(tài)觀察，挑選表面光滑的單菌落在ISP2培養(yǎng)基上進(jìn)行三區(qū)劃線純化，如有雜菌則進(jìn)行二次純化或多次純化，直至得到單一純凈的菌落，同時(shí)記錄菌落數(shù)及菌落的形態(tài)特征。純化好的菌株制成20%（V/V）甘油管保藏于-80 ℃。

1.2.4 PCR擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育樹分析 采用Chelex-100 Resin法（周雙清等，2010）提取基因組DNA;并參照Walsh et al.（1991）的方法進(jìn)行PCR梯度擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，Bio-RAD凝膠成像儀成像觀察電泳結(jié)果。凝膠成像儀檢驗(yàn)條帶合格后委托上海美吉生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司廣州分公司進(jìn)行測序。

測序結(jié)果經(jīng)DNA Star軟件整理，利用數(shù)據(jù)庫EzBioCloud（https：//www.ezbiocloud.net/）（Kim et al.，2009）進(jìn)行在線比對(duì);對(duì)16S rRNA基因序列進(jìn)行相似性比對(duì)搜索，從中選取相似性較高且是有效描述的典型菌株的16S rRNA基因序列作為參比對(duì)象。

1.3 延緩衰老活性實(shí)驗(yàn)

1.3.1 紅樹林細(xì)菌粗提物的制備 參考覃媚等（2016）的方法：將32株對(duì)數(shù)生長期的菌株接種于200 mL液體培養(yǎng)基中發(fā)酵7 d，離心收集發(fā)酵液，發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯層濃縮備用;收集粗提物，置于干燥器中低溫保存。

1.3.2 NGM （nematode growth medium）培養(yǎng)基的配制 參考Brenner（1974）的方法：加入3 g NaCl、2.5 g蛋白胨、17 g瓊脂、1 mol·L1 K2HPO4-KH2PO4 Buffer （pH=6.0） 25 mL、975 mL蒸餾水進(jìn)行滅菌。滅菌后加入抽濾除菌的5 mg·mL1膽固醇溶液1 mL、1 mol·L1 MgSO4 1 mL、1 mol·L1的 CaCl2 1 mL。

1.3.3 秀麗隱桿線蟲延緩衰老活性測試方法 真紅樹內(nèi)生細(xì)菌代謝產(chǎn)物粗提物樣品分兩批次進(jìn)行線蟲壽命實(shí)驗(yàn)，第一批次總共采集得到11個(gè)樣品的壽命數(shù)據(jù)，樣品詳情如表4所示，第二批次總共采集得到8個(gè)樣品的壽命數(shù)據(jù)，具體數(shù)據(jù)如表5所示。

實(shí)驗(yàn)步驟：用M9緩沖液將蟲體洗凈離心棄上清液，以1∶3的比例加入裂解液（1 mL 5 mol·L1的NaOH和0.5 mL 5%的NaClO混勻使用），震蕩離心后，分別加入20 μL大腸桿菌發(fā)酵液、30 μL線蟲pellet、150 μL M9 Buffer于96孔板的各個(gè)孔中，設(shè)置陰性對(duì)照。 置于 20 ℃ 生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h 后可得L4期線蟲。將培養(yǎng)好的L4期線蟲挑至加有藥液（藥液濃度500 μg·mL1，每次加50 μL）的NGM培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，每組2板，每板20條，此時(shí)培養(yǎng)天數(shù)記為0 d。此后，隔天對(duì)培養(yǎng)基的線蟲進(jìn)行計(jì)數(shù)，每天觀察并記錄線蟲生存、死亡及剔除的數(shù)量，將線蟲每2 d轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿，直至線蟲全部死亡。得出平均壽命和最大壽命值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用軟件SPSS Statistics 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用軟件Excel 2013做表、繪圖，通過DNA Star軟件進(jìn)行序列整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅樹植物內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析

根據(jù)菌落特征進(jìn)行初步排重后，選擇58株菌進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增和序列分析，結(jié)果表明32株為細(xì)菌，分布于4個(gè)綱10個(gè)目12個(gè)科17個(gè)屬，其物種組成多樣性分布如表3所示。32株紅樹林植物內(nèi)生細(xì)菌在17個(gè)屬的多樣性分布如圖1所示，其中橙單胞菌屬（Aurantimonas）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、無色桿菌屬（Achromobacter）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、鹽單胞菌屬（Kushneria）、Salinicola、沙雷氏菌屬（Serratia）、 根瘤菌屬（Rhizobium）、弧菌屬（Vibrio）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）分別含1個(gè)種;不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）分別含2個(gè)種;泛菌屬（Pantoea）含3個(gè)種;芽孢桿菌屬（Bacillus）為優(yōu)勢菌屬含11個(gè)種占分離細(xì)菌的34.37%。從分離得到的海洋細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)1株細(xì)菌的全長16S rRNA基因序列與其最近緣的典型菌株序列相似性低于97%，基于系統(tǒng)發(fā)育分析認(rèn)為全長序列相似性低于98.65%的菌株代表潛在新屬或新種（Kim et al.，2014）。IMDGX 6574與有效發(fā)表菌株Aurantimonas coralicida DSM （14790）T的最高相似性為94.65%，為潛在的新種或新屬。

2.2 32株內(nèi)生細(xì)菌在植物樣品、植物組織及培養(yǎng)基中的分布

32株真紅樹內(nèi)生細(xì)菌在14份植物樣品、5種植物組織及9種分離培養(yǎng)基中的分布情況如圖2、圖3和圖4所示。其中，圖2樣品H4（1號(hào)采樣點(diǎn)的白骨壤）和H9（2號(hào)采樣點(diǎn)木果楝）分離得到的菌株數(shù)量最多，其次是樣品H2紅海欖，分離得到12株細(xì)菌。從不同組織分離得到的細(xì)菌種屬多樣性與數(shù)量結(jié)果如圖3所示，如從葉子獲得的菌株數(shù)量最多（22株），相應(yīng)地其種屬多樣性也最豐富（12個(gè)屬），根中分離得到的菌株數(shù)量最少（6株），相應(yīng)地其種屬多樣性也較少（3個(gè)屬）。根據(jù)9種分離培養(yǎng)基的分離效果可知，圖4中M7培養(yǎng)基（改良ISP5培養(yǎng)基）分離得到的菌株數(shù)量和多樣性均最多，其主要營養(yǎng)成分為酵母粉與L-天冬酰胺;M10培養(yǎng)基（改良淀粉-水解酪素培養(yǎng)基）分離得到菌株數(shù)量和多樣性較高;M9培養(yǎng)基（精氨酸-天冬酰胺培養(yǎng)基）分離得到菌株數(shù)量和多樣性均最少。因此，M7（改良ISP5培養(yǎng)基）與M10（改良淀粉-水解酪素培養(yǎng)基）培養(yǎng)基可為今后分離純化細(xì)菌工作提供培養(yǎng)基成分參考。

2.3 真紅樹植物內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物延緩衰老活性分析

內(nèi)生細(xì)菌的延緩衰老活性數(shù)據(jù)，采用 SPSS Statistics 17.0 軟件進(jìn)行分析，采用方差分析進(jìn)行兩兩比較。由表4第一批研究結(jié)果可知編號(hào)IMDGX 6198寡養(yǎng)單胞菌屬的Stenotrophomonas rhizophila與空白對(duì)照相比P<0.01，差異極顯著，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表5所示，第二批次樣品中編號(hào)IMDGX 6121-1不動(dòng)桿菌屬的Acinetobacter soli與對(duì)照組比較（P<0.01），IMDGX 6355泛菌屬的Pantoea anthophila與對(duì)照組比較（P<0.05）具有顯著差異，能顯著延長線蟲壽命。

研究結(jié)果分析顯示IMDGX 6198、IMDGX 6355和IMDGX 6121-1，3株真紅樹內(nèi)生細(xì)菌能顯著延緩線蟲衰老，分別與相對(duì)應(yīng)批次的空白組比較平均壽命可分別達(dá)到（19.62±1.04）、（19.63±6.72）和（22.70±0.94）d，最大壽命可達(dá)到21.68、21.37和24.57 d。據(jù)Huang et al.（2004）研究可知壽命長短是衰老過程研究中的一個(gè)主要依據(jù)，線蟲的衰老過程伴隨著生理功能的衰減。因此，研究線蟲的壽命可評(píng)價(jià)微生物代謝產(chǎn)物的延緩衰老活性。

3 討論與結(jié)論

隨著普通環(huán)境下篩選新化合物的幾率逐漸下降，人們開始把注意力轉(zhuǎn)向了特殊生境的微生物資源（李文均等，2003）。海南西海岸紅樹林資源豐富、生長環(huán)境獨(dú)特，同時(shí)也為其內(nèi)生菌提供了特殊的生態(tài)環(huán)境。為豐富海南西海岸真紅樹內(nèi)生細(xì)菌的多樣性及生物活性，本研究選擇14份真紅樹植物的46份組織樣品，利用9種不同營養(yǎng)成分的分離培養(yǎng)基分離純化其中的內(nèi)生細(xì)菌，共分離培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌32株，隸屬于12科17屬，其中11株芽孢桿菌（Bacillus）（占34.37%），為優(yōu)勢菌群。

可見，芽孢桿菌在真紅樹內(nèi)生微生物中占統(tǒng)治地位，這與李菲等（2017）研究結(jié)果相同。本研究從真紅樹植物的13份葉子中分離到22株內(nèi)生細(xì)菌，數(shù)量最多，其次從14份莖中分離到17株，12份胚軸樣品中得到15株，2份花中得到7株和5份根部位樣品得到6株。葉子中分離得到的細(xì)菌種類最多，其次是莖和胚軸，花與根部位最少，此研究結(jié)果與其他學(xué)者相比較存在差異（陳振明等，2006;魏玉珍等，2010;李家怡等，2017）。推測原因可能是采樣地點(diǎn)和季節(jié)、采集樣品的老嫩程度和采集樣品部位的數(shù)量、樣品處理方式和外部環(huán)境所致。因此，海南西海岸同一種真紅樹內(nèi)生細(xì)菌的分布及其生物學(xué)特性是否具有組織特異性，還需進(jìn)一步深入探索。

利用秀麗隱桿線蟲模型篩選內(nèi)生細(xì)菌的延緩衰老活性。檢測結(jié)果顯示，3株真紅樹內(nèi)生細(xì)菌Stenotrophomonas rhizophila、Pantoea anthophila和Acinetobacter soli皆具有顯著延緩線蟲衰老的活性，分別隸屬于寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、泛菌屬（Pantoea）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）?；钚跃闟tenotrophomonas rhizophila曾被報(bào)道從石油污染的土壤上分離得到（Kumar et al.，2015）。Acinetobacter soli能高效降解食物中的聚山梨酸酯（Nguyen，2018），該屬細(xì)菌可分泌表面活性劑，能有效降解石油烴以降低石油烴的生物毒性（劉玉華等，2016）。由此可見，篩選到的兩株活性菌株具有開發(fā)成為藥物、保健食品及化工產(chǎn)品的潛力。在本次研究中，菌株Stenotrophomonas rhizophila從紅海欖根（H2）、白骨壤莖（H4）、紅樹根（H12）、木欖胚軸（H13）中均分離得到，Pantoea anthophila于木果楝葉子（H9）中分離得到，Acinetobacter soli可從木果楝莖（H9）以及瓶花木胚軸（H10）中分離得到。由此可見，同一海域不同采集地點(diǎn)和不同植物組織均可分離到相同的菌株。

就新穎性而言，從海南西海岸桐花樹葉子中發(fā)現(xiàn)1株Aurantimonas sp.的潛在新種，其與已發(fā)表的菌株Aurantimonas coralicida DSM 14790T（ATXK01000033）的16S rRNA基因序列相似性低于97.00%。因此，下一步將對(duì)潛在新菌開展多相分類鑒定及對(duì)3株具有延緩衰老活性的菌株進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，并分析其發(fā)酵代謝產(chǎn)物的化學(xué)組成及其抗衰老機(jī)理，以期為海洋延緩衰老藥物的開發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）