李菲 黃庶識 胡文進 李喆 黃媛林 王巧貞 潘信利

摘 要：紅樹植物內(nèi)生菌在紅樹共生體的物質(zhì)循環(huán)、能量傳遞和健康維護等方面起著重要作用。為探究紅樹植物內(nèi)生菌的多樣性，進一步揭示內(nèi)生菌在紅樹共生體的功能多樣性提供菌種資源，該研究選擇6種分離培養(yǎng)基和采用傳統(tǒng)稀釋涂布法對從廣西北海灘涂上采集的桐花樹組織和根際土壤樣品進行分離，對獲得的可培養(yǎng)細菌進行多樣性分析，并通過體外溶栓實驗篩選出具有抗血栓活性的菌株。結(jié)果表明：（1）基于16S rRNA基因序列系統(tǒng)進化分析，從桐花樹組織和根際土壤中共獲得125株細菌;分布于變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）3個門27個科39個屬74個種中，芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌屬，菌株數(shù)量占13.5%。（2）抗血栓活性實驗表明，初篩獲得18株具有抗血栓活性細菌，總陽性率為24.32%;將初篩有活性的菌株進行復(fù)篩和重復(fù)驗證實驗，進一步驗證其活性，結(jié)果復(fù)篩出3株細菌B1850、B1989和B2632具有很強抗血栓活性。綜上所述，廣西北海灘涂上紅樹植物桐花樹中存在豐富的可培養(yǎng)細菌資源，具有從中挖掘新的纖溶酶和開發(fā)溶血栓藥物的潛力。

關(guān)鍵詞：桐花樹，內(nèi)生細菌，根際細菌，多樣性，抗血栓活性

血栓性疾病是一類嚴重威脅人類健康的常見病、多發(fā)病，常表現(xiàn)為心絞痛、心肌梗死、腦栓塞和腦梗死等，多以中老年人為主要發(fā)病群體，現(xiàn)發(fā)病人群逐漸趨于年輕化，且發(fā)病率與死亡率在不斷上升（喬德水等，2009;Jremo et al.，2013）。血栓性疾病的起因主要是血管腔中形成血栓使其變得狹窄或閉塞，導(dǎo)致主要器官缺血或梗死。而血栓是人體內(nèi)血液組成成分在血管或心臟內(nèi)形成的凝塊，可脫落凝塊隨血液流至遠端，從而堵塞血管腔（Sun et al.，2008）。目前臨床上主要有三大類治療血栓性疾病的藥物，即抗血小板類、抗凝血類和溶血栓藥物。傳統(tǒng)的溶血栓藥物在臨床上雖具有確切的療效和良好的安全性，但其存在的半衰期短、纖維蛋白特異性低和價格貴等缺點也不容忽視（翁郁華等，2010）。因此，尋找能解決上述問題的溶血栓藥物具有廣泛的應(yīng)用前景。

近年來，海洋微生物是新型纖溶酶的重要來源之一。Lakshmi et al.（2013）從海洋沙雷菌（Serratia sp. RSPB11）分離到一種具有纖維蛋白水解活性和高熱穩(wěn)定的堿性金屬蛋白酶。李占強等（2009）從南海沉積物中分離到的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus B5815），其纖溶酶活性好且產(chǎn)酶量高。Huang et al.（2013）從海洋枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis HAS-3）分離到一種纖維蛋白水解酶。劉晨光等（2001）分離到一株海洋假單胞菌（Pseudomonas sp.）可產(chǎn)生較強的直接溶解纖維蛋白和具有抗血栓活性的堿性蛋白酶MPAP。這些為從海洋微生物來源尋找抗血栓的藥物提供了很好的依據(jù)。桐花樹系紅樹林中廣布種之一，廣泛分布于亞洲至大洋洲熱帶海岸，在我國的廣東、廣西、福建和海南等?。▍^(qū)）均有分布（繆紳裕等，2007）。我國的桐花樹由于受到常年全日潮水的浸淹，使之生長狀況、營養(yǎng)發(fā)育、生物量分配、激素水平和相關(guān)酶系等方面的生理生態(tài)性質(zhì)表現(xiàn)出梯度性反應(yīng)（何斌源等，2007），其內(nèi)生菌長期生活于植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中并與之協(xié)同進化。植物體為其提供生長所必需的能量和營養(yǎng)的同時，內(nèi)生菌又會通過自身的代謝、信號傳導(dǎo)對植物體產(chǎn)生響應(yīng)（文才藝等，2004）。本研究以廣西北海灘涂的桐花樹中分離、培養(yǎng)和鑒定出的植物內(nèi)生和根際細菌為樣本，旨在篩選出具有高效抗血栓活性的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣本來源 桐花樹于2018年8月在廣西北海灘涂（108°50′42″ E、 21°55′25″ N）采集。樣品裝于密封袋，4 ℃低溫保藏帶回實驗室，盡快完成前處理和分離工作。

1.1.2 羊血實驗試劑 無菌脫纖維羊血（初篩羊血）和抗凝羊血（復(fù)篩羊血），均購買于南寧茂接微生物科技有限公司。陽性對照藥物：血塞通片（云南維和藥業(yè)股份有限公司），購買于一心藥業(yè)。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1）分離培養(yǎng)基：AGG、M5、P7、M10、M4和P3，詳情信息見表1。

1.2 菌株的分離純化

1.2.1 樣品預(yù)處理 參照李菲等（2018）預(yù)處理方法，代表性地選擇桐花樹各組織進行細菌的分離實驗。首先，用5%次氯酸鈉溶液浸泡3～5 min，用無菌水沖洗多次;其次，用0.2%吐溫20溶液浸泡10 min，用無菌水沖洗多次;最后，用75%的酒精溶液浸泡5 min，用無菌水沖洗多次。消毒后的組織樣品，分別用無菌手術(shù)刀進行切碎;取約1 g的樣品進行充分研磨，加入9 mL無菌水與樣品混勻，即為初始的組織懸液，再依次稀釋到103和104的組織懸液，待用。

桐花樹根際樣品的收集，輕輕刮下根須表面附著的土壤，平鋪于無菌平皿中，經(jīng)65 ℃熱風(fēng)干燥30 min。稱取2.0 g樣品裝于20 mL無菌水中搖勻;制成102和103稀釋度的樣液，待涂布處理。

1.2.2 細菌的分離純化 取200 μL梯度稀釋的樣液接種于6種復(fù)合營養(yǎng)培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)數(shù)周，并及時觀察菌株的生長情況，挑取肉眼可見菌落進行純化培養(yǎng)，記錄其形態(tài)特征和相同菌落數(shù)，以30%（V/V）甘油-ISP2混合液作為保護劑，將純化好的菌株制成凍存管保藏于-70 ℃。

1.3 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析

采用Chelex-100樹脂（周雙清等，2010）快速提取細菌的DNA作為PCR模板，并根據(jù)Walsh（1991）的方法對其進行PCR擴增。引物為27F和1522R，參照李菲等（2018）的方法設(shè)定PCR反應(yīng)條件。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖-TAE凝膠電泳檢測合格后，委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行測序分析。序列經(jīng)BioEdit Sequence Alignment Editor軟件整理后，利用EzTaxon服務(wù)器進行在線比對（Kim et al.，2009）;以同源性最高菌株的有效序列作為參比對象，構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支置信值檢測設(shè)為Boostrap1 000次，對各菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位進行分析（Li et al.，2017）。

1.4 細菌對抗血栓活性的篩選

1.4.1羊血培養(yǎng)基制備 以改良ISP2固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，121 ℃高溫蒸汽滅菌20 min。待培養(yǎng)基冷卻至55 ℃，添加10%脫纖維無菌羊血，搖勻后倒入無菌平皿中，待平皿靜置冷卻2 h后，待用。

1.4.2 初篩 首先將排重后的74株細菌，分別接種至ISP2固體培養(yǎng)基上，取生長對數(shù)后期的細菌劃線至羊血培養(yǎng)基上，每板劃4株細菌，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。然后于24 h后觀察平板上微生物的生長情況，觀察是否有透明圈，顏色變化等。再將產(chǎn)生明顯透明圈的菌落劃線至ISP2固體培養(yǎng)基上，供復(fù)篩用。

1.4.3 復(fù)篩 參考辛宏等（2018）的方法制備人工血栓，取300 μL脫纖維無菌羊血，至于滅菌西林瓶底部，加入9 μL 1 mol·L1的CaCl3溶液，放置10 min，待血液凝固使用。

將初篩結(jié)果良好的16株細菌，分別接種于50 mL改良的ISP2液體培養(yǎng)基上，28 ℃，180 r·min1搖床培養(yǎng)7 d;取出發(fā)酵液，8 000 r·min1離心10 min，收集上清液，用0.22 μm微孔濾膜除菌，獲得抗血栓活性待測液;取2 mL待測液沿壁緩慢加入凝固的人工血栓中，以2 mL ISP2液體培養(yǎng)基和2 mL 0.7%生理鹽水作陰性對照，以2 mL 0.173 g·mL1血塞通片（含三七總皂苷含量為100 mg）為陽性對照。放入28 ℃培養(yǎng)，每隔24 h觀察一次血凝塊溶解情況，并輕微晃蕩，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 桐花樹中內(nèi)生及根際細菌多樣性分析

根據(jù)菌落的形態(tài)、顏色和大小等特征進行排重，選取125株細菌進行測序?qū)Ρ确治觯@得74種細菌，其中桐花樹各組織中獲得34種內(nèi)生細菌，隸屬于18科22屬;根際細菌44種，隸屬于20科27屬。分別對桐花樹的內(nèi)生細菌和根際細菌構(gòu)建N-J系統(tǒng)進化樹（圖1和圖2）。

2.2 不同培養(yǎng)基對內(nèi)生和根際細菌的分離效果

采用6種培養(yǎng)基，從桐花樹中分別獲得內(nèi)生和根際細菌71株和64株;經(jīng)形態(tài)法和16S rRNA基因序列對比排重后，獲得74株細菌在6種培養(yǎng)基上分離效果（圖3）。根據(jù)其分離效果分析：P3和P7培養(yǎng)基分離到細菌種類最多，均有17個菌屬;AGG培養(yǎng)基分離的細菌種類最少，包含4個菌屬，究其原因可能是AGG培養(yǎng)基主要成分為淀粉，較適合優(yōu)勢放線菌群（鏈霉菌屬）。由菌落數(shù)統(tǒng)計結(jié)果可知，M10、M5、AGG、 M4、P7和P3培養(yǎng)基上菌落數(shù)分別為4.3、3.1、1.2、7.3和7.2（×105 cfu·mL1）。P3和P7培養(yǎng)基分離效果相近，獲得的細菌均隸屬于17屬，其菌種數(shù)和多樣性均較高;而AGG培養(yǎng)基獲得的細菌均隸屬于5屬，故其獲得較少的細菌數(shù)和多樣性。

2.3 內(nèi)生及根際細菌的屬級水平上的韋恩圖分析

在屬級水平上對桐花樹各組織和其根際來源細菌進行venn分析，結(jié)果顯示，從桐花樹各組織和根際中獲得細菌種類存在較大的差異，桐花樹內(nèi)生細菌和根際細菌共有10個相同的菌屬，分別為Novosphingobium sp.、Sphingomonas sp.、Gordonia sp.、Micrococcus sp.、Streptomyces sp.、Pseudomonas sp.、Mycolicibacterium sp.、Mycobacterium sp.、Bacillus sp.和Microbacterium sp.。對桐花樹各組織與根際來源的細菌分別進行venn分析，僅有一個共同的芽孢桿菌屬（圖4：A）;根部分離的細菌與根際細菌有8個共同菌屬（圖4：B），其他各組織分離的細菌與根際細菌的種屬相差較大。

2.4 細菌抗血栓活性初篩

將初篩的羊血平板放置28 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察細菌生長和暈圈情況。結(jié)果顯示，篩選74種細菌的抗血栓活性，有18種細菌顯示出良好的抗血栓活性，總陽性為24.32%;分別隸屬于Bacillus sp.、Curtobacterium sp.、Demequina sp.、Kineococcus sp.、Pseudomonas sp.和Sphingomonas sp.。圖5顯示，B2061、B2635和B1820顯示無暈圈，即判定為無溶血活性;B1502、B1500和B1850顯示出深色暈圈，B1989、B2634和B2632表現(xiàn)為透明圈，兩者均判定為具有溶血活性。

2.5 細菌上清液對體外血栓的影響

根據(jù)上述抗血栓活性初篩結(jié)果，對18株有活性菌株進行抗血栓活性復(fù)篩。圖6結(jié)果顯示，24 h后，B1850、B1989和B2632的上清發(fā)酵液將凝血塊全部溶解。其余細菌的上清液與血凝塊均有明顯分層，凝血塊較空白對照組的均有變小，上層溶液呈現(xiàn)出紅色，故展示出微弱的溶血活性，ISP2培養(yǎng)基和生理鹽水空白組中凝血塊均維持原樣，下層為凝血塊，固液分界線清晰。

3 討論與結(jié)論

紅樹植物是生長在熱帶和亞熱帶潮間帶河口地帶的耐鹽植物，分布在30° S與30° N之間。面對高度鹽漬化、土壤缺氧、高光輻射、高礦物組成、強還原性和頻繁的潮汐等生境特征，紅樹植物對生長所需營養(yǎng)和空間的競爭變得十分激烈，這一特殊生境豐富了紅樹林植物內(nèi)生菌多樣性，也必然能代謝出區(qū)別于其他生態(tài)系統(tǒng)的良好生物活性物質(zhì)（周婧等，2019）。據(jù)報道，紅樹植物內(nèi)生菌具有良好的抑菌、殺蟲、細胞毒、胞外酶活、抗腫瘤、抗病毒和抗氧化等生物活性（劉偉等，2012;魏華等，2012;李菲等，2016）。桐花樹作為傳統(tǒng)的中藥，其樹皮和樹葉均有治療哮喘、糖尿病和風(fēng)濕等疾病功效，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有明顯的抗植物病原菌和細胞毒活性等作用（徐佳佳等，2006），故研究桐花樹內(nèi)生菌的多樣性和生物活性獲得不少研究工作者的青睞。為了完善桐花樹中內(nèi)生細菌分布情況、物種多樣性及其生物活性等信息，本研究選擇廣西北海灘涂上紅樹植物桐花樹各組織和根際進行細菌多樣性分析。采用6種分離培養(yǎng)基，對桐花樹組織中獲得的內(nèi)生細菌進行定量分析，共獲得34種細菌，隸屬于18科22屬;從根際中分離可培養(yǎng)細菌44種，隸屬于20科27屬。從桐花樹各組織中獲得內(nèi)生細菌在種類和數(shù)量均有明顯差異，其中，根部和皮部中分離的細菌種類和數(shù)量最多，花和葉中分離到的細菌均較少;而根部來源的內(nèi)生細菌與根際細菌存在較多相同屬。研究發(fā)現(xiàn)，根際微生物的分布與沿根的可溶性碳的分布距離有關(guān)，其生物量的積累有賴于根系分泌物的釋放，從而影響著根際微生物的代謝和生長發(fā)育（朱麗霞等，2003）。

采用無菌脫纖維羊血，通過體外溶栓實驗篩選出具有抗血栓活性菌株。結(jié)果顯示，初篩得到18種具有抗血栓活性的菌株，總陽性為24.32%;通過抗血栓活性復(fù)篩，從中獲得3株具有良好抗血栓活性菌株。該3株強抗血栓活性菌株B1850、B1989和B2632分別隸屬于Microbacterium sp.、Stenotrophomonas sp.和Bacillus sp.。據(jù)報道，目前已從芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、鏈球菌屬、單胞菌屬及葡萄球菌屬等細菌中分離出抗血栓活性物質(zhì)（Lack，1948;張艷等，2000），但對海洋來源的微生物在抗血栓活性研究領(lǐng)域上的報道寥寥可數(shù)，本文開展海洋來源細菌中抗血栓活性研究，發(fā)現(xiàn)兩個未見報道的具有良好抗血栓活性菌株Microbacterium sp. B1850和Stenotrophomonas sp. B1989，這豐富了海洋微生物在抗血栓活性研究上的認識，也為尋找新的纖溶酶和研發(fā)抗血栓活性藥物等下游工作奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）