陶士博,李鳴曉,徐 銓

（1 遼寧省重要技術(shù)創(chuàng)新與研發(fā)基地建設(shè)工程中心，沈陽 110168；2 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 水稻研究所，沈陽 110866）

水稻為全球超過50%的人口提供主食，是最重要的糧食作物之一（萬建民，2010）。隨著長期的馴化過程，水稻分化形成了不同的亞種，粳稻 （O.sativa ssp.japonica） 和秈稻 （O.sativa ssp.indica）［1－5］。 秈粳亞種在生物學(xué)特性上存在顯著差異，尤其是兩個(gè)亞種在水稻品質(zhì)性狀上的差異尤為顯著。隨著人們生活水平的提高，水稻品質(zhì)的提高也逐漸成了育種家和生物學(xué)家的目標(biāo)， 秈粳之間的品質(zhì)差異也成了研究的重中之重。 Nakamura Yasunori（2017）對水稻淀粉基因進(jìn)行了全面的分析［6］，我們選擇幾個(gè)重要的淀粉合成酶進(jìn)行分析：水稻的蠟質(zhì)基因（Wx）位于第6 染色體，其淀粉合成酶為存在秈粳特異性及突變型waxy （gbss1），且僅存在于水稻的支鏈淀粉中， 含有該基因的水稻外觀表現(xiàn)為純白色［7－9］；SBE3 基因位于第 2 染色體且存在秈粳特異性， 其支鏈淀粉鏈長分布在6～13 范圍內(nèi)， 有利于該淀粉合成酶的合成，在17～34 和大于39 范圍內(nèi)，不利于該淀粉合成酶的合成， 含有該酶的水稻重量下降且稻米外觀品質(zhì)存在堊白現(xiàn)象［10］；FLO5 位于第 8 染色體，存在突變型，其基因型為 ss3a （e1）或者 floury－5，其支鏈淀粉鏈長分布在10～15 范圍內(nèi)， 有利于該淀粉合成酶的合成，在6～9 和30～60 范圍內(nèi)，不利于該淀粉合成酶的合成，外觀品質(zhì)存在白核現(xiàn)象，且該酶的存在可以使 SSI 、GBSSI、AGPase 水平上升［11，12］； 另一重要的淀粉合成酶 UGP1 位于第 9 染色體，在外觀品質(zhì)存在堊白現(xiàn)象，且可能雄性不育［13］。 為了進(jìn)一步研究秈粳之間遺傳差異對水稻淀粉的影響，本文以重組自交系群體（RILs）為試驗(yàn)材料，結(jié)合高通量測序，分析遺傳因素對水稻淀粉特性的影響， 同時(shí)也分析本文涉及的淀粉合成酶基因型， 并分別探究淀粉特性及秈型位點(diǎn)頻率（Fi）與品質(zhì)性狀的相關(guān)性，加深對水稻淀粉的研究機(jī)理，從而選育出更適合人民需求的水稻品種，提供了遺傳學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)選取了典型粳稻品種沈農(nóng)265（SN265）與典型秈稻品種滬恢99（R99）雜交構(gòu)建的重組自交系，重組自交系使用一粒傳法構(gòu)建，自交10 代后得到155 個(gè)株系。 其中， 粳稻品種沈農(nóng) 265（SN265）作為“中國超級稻育種”項(xiàng)目實(shí)施以來育成的第一個(gè)粳型超級稻品種，具有直立穗、穗短及抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)， 尤其是在稻瘟病的抗性表現(xiàn)上極為顯著（陳溫福，2004）。秈稻品種瀘恢 99（R99）作為秈稻的重要恢復(fù)系，具有彎曲穗、穗長的形態(tài)特點(diǎn)。 重組自交系和親本種植于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所德陽育種基地（N32°， E104°）。 155個(gè)株系按隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)排列，每個(gè)株系種植3 行，每行種植 10 株， 栽植規(guī)格均為行距 30.0 cm，株距為 13.3 cm，并設(shè) 2 次重復(fù)。 栽培方法如下：在播種前分別測定了各地的土壤自然肥力， 按基礎(chǔ)肥力施用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)為每公頃150 kgN， 150 kgP，150 kgK 進(jìn)行補(bǔ)施，并在移栽7 d 后施用返青肥，返青肥施用量為每公頃75 kgN。

1.2 水稻淀粉特性測定方法及數(shù)據(jù)分析

成熟期每個(gè)株系去除邊株后，取中間的20 株的稻穗，單獨(dú)進(jìn)行脫粒。 稻谷脫粒后，在室溫環(huán)境下自然風(fēng)干保存三個(gè)月后， 通過精米機(jī)將所收獲的稻谷碾磨成精米，將精米放入Foss 旋風(fēng)磨中打粉，通過100 目篩子篩選，取精細(xì)米粉試樣留取備用。運(yùn)用Nakamura 全波段紫外分光光度計(jì)法測定鏈長分布，使用日立（Hitachi）U3900 紫外分光光度計(jì)進(jìn)行200～900 nm 波長下進(jìn)行掃描。 每個(gè)株系的淀粉特性測定重復(fù)兩次。

1.3 秈型位點(diǎn)頻率（Fi）的劃分

秈型位點(diǎn)頻率，又稱Fi，我們定義親本粳稻品種沈農(nóng)265（SN265）的秈型位點(diǎn)頻率為0，親本秈稻品種滬恢99（R99）的秈型位點(diǎn)頻率為1，試驗(yàn)材料的秈型位點(diǎn)頻率指的是水稻株系偏向于秈稻親本即R99 的頻率， 篩選親本間有多態(tài)性、均勻分布12 條染色體的秈粳特異SNP 標(biāo)記， 計(jì)算每個(gè)株系整個(gè)染色體組秈粳成分比例， 進(jìn)而求得每個(gè)株系的秈型位點(diǎn)頻率， 從而更好地分析出其秈粳屬性與水稻淀粉特性間的關(guān)系， 對于秈型位點(diǎn)頻率 （Fi） 的具體劃分， 我們將秈型位點(diǎn)頻率（Fi） 小于 0.4 的劃分為偏粳型，0.4 到 0.6 為中間型，0.6 以上的為偏秈型。

1.4 QTL分析

QTL 區(qū)間作圖的方法最早提出于1989 年（Lander ES et al，1989），隨后王建康（2009）提出了大麥品種更為全面的數(shù)量性狀基因的完備區(qū)間的作圖方法， 對于水稻淀粉特性的QTL 分析，同樣適用，我們采用這種方法進(jìn)行QTL 定位。 LOD閥值設(shè)為2.50 （不同環(huán)境下同時(shí)檢測到時(shí)LOD＞2.40），當(dāng)實(shí)際求得的 LOD 值大于 LOD 閥值時(shí)，就認(rèn)為該區(qū)段存在1 個(gè)QTL，同時(shí)估算每個(gè)QTL 的加性效應(yīng)值和貢獻(xiàn)率大小。

1.5 淀粉合成基因型分析

采用的是全基因重測序技術(shù)，對四個(gè)地區(qū)，每個(gè)地區(qū)155 個(gè)株系， 分析過程為先對已知的水稻基因組序列進(jìn)行不同個(gè)體的基因組測序， 并在此基礎(chǔ)上， 對本次試驗(yàn)材料個(gè)體或群體進(jìn)行差異性分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2010 軟件處理數(shù)據(jù)和繪制圖表， 使用 SPSS 23.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析。 四個(gè)地區(qū)的所有的樣品都測兩次重復(fù)， 數(shù)據(jù)結(jié)果使用2016 年的試驗(yàn)數(shù)據(jù)用于下面的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 秈型位點(diǎn)頻率（Fi）與水稻淀粉特性的關(guān)系

我們將重組自交系群體通過秈粳特異 SNP標(biāo)記得到的秈型位點(diǎn)頻率結(jié)果列于圖1。 由圖可知： 由于秈型位點(diǎn)頻率劃分界限導(dǎo)致部分株系早分界線處出現(xiàn)重疊，但我們可以看到，超過60%的株系處于中間型， 偏粳型的株系數(shù)略大于偏秈型的株系數(shù)。 由于秈型位點(diǎn)頻率（Fi）與淀粉特性之間相關(guān)性并不顯著， 于是我們進(jìn)一步將不同地區(qū)按各自生態(tài)環(huán)境下， 用圖1 所列出的三種類型偏秈型、中間型、偏粳型作為SPSS 軟件多因素方差分析中的固定因子， 用淀粉特性的四個(gè)指標(biāo)AAC、Fa、Fb3、RS 作為因變量（表1）。 結(jié)果表明秈型血緣并不顯著影響淀粉特性。

表1 秈粳類型間淀粉特性的差異

2.2 淀粉特性的QTL分析

我們依據(jù)水稻淀粉特性的四個(gè)指標(biāo)AAC、Fa、Fb3及 RS 進(jìn)行 QTL 定位， 得到以下數(shù)據(jù) （表2），結(jié)果表明：對表觀直鏈淀粉（AAC）進(jìn)行 QTL定位， 我們共找到2 個(gè)表觀直鏈淀粉 （AAC）的QTL， 位于第 1、7 染色體上，LOD 值介于 2.60～4.28， 加性效應(yīng)值為－0.84～0.72， 單個(gè)貢獻(xiàn)率為11.58～15.55；對短支鏈淀粉（Fa）進(jìn)行 QTL 定位，我們共找到1 個(gè)短支鏈淀粉（Fa）的QTL，位于第7 染 色體 上，LOD 值介于 2.92， 加性效應(yīng)值為0.25，單個(gè)貢獻(xiàn)率為 7.70；對長分支支鏈淀粉（Fb3）進(jìn)行QTL 定位，我們共找到5 個(gè)長分支支鏈淀粉（Fb3）的 QTL，位于第 1、3、4、5、6 染色體上，LOD值介于 3.43～41.11， 加性效應(yīng)值為－1.25～1.45，單個(gè)貢獻(xiàn)率為 0.96～22.23； 對抗性淀粉 （RS） 進(jìn)行QTL 定位， 我們共找到 2 個(gè)抗性淀粉 （RS）的QTL， 位于第 1、6、7 染色體上，LOD 值介于 2.80～3.23， 加性效應(yīng)值為－0.19～0.15， 單個(gè)貢獻(xiàn)率為6.39%－12.68%。 第 1 染色體上的 2 位點(diǎn)能在表觀直鏈淀粉（AAC）、長分支支鏈淀粉（Fb3）、抗性淀粉（RS）都被檢測到，貢獻(xiàn)率在 1.69%～15.55%，加性效應(yīng)為0.15～0.72，該位點(diǎn)可能是一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的 QTL 區(qū)域（Block1835—Block1841），控制著表觀直鏈淀粉（AAC）、長分支支鏈淀粉（Fb3）、抗性淀粉（RS）含量；四川地區(qū)位于6 染色體上的62位點(diǎn)能在短支鏈淀粉（Fa）、長分支支鏈淀粉（Fb3）被檢測到， 貢獻(xiàn)率在 0.96%～7.70%， 加性效應(yīng)為－0.30～0.25，該位點(diǎn)可能是一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的QTL區(qū)域（Block13997—Block13994），控制著短支鏈淀粉（Fa）、長分支支鏈淀粉（Fb3）含量。

表2 淀粉特性的QTL 定位

2.3 淀粉合成相關(guān)酶的基因型分析

涉及水稻淀粉合成過程中的目標(biāo)同工酶或調(diào)節(jié)因子共計(jì)28 個(gè)， 將這28 個(gè)淀粉合成過程中的目標(biāo)同工酶或調(diào)節(jié)因子在本試驗(yàn)中進(jìn)行分析 （表3），結(jié)果表明在28 個(gè)涉及到水稻淀粉合成過程中的酶中，只有三個(gè)基因在雙親之間存在差異，它們分別是 SBE3、SSIIIa、UGP1，分別位于試驗(yàn)材料的第2、8、9 染色體上。 針對于這三個(gè)淀粉合成相關(guān)酶的基因型， 我們將事先通過基因重測序得到的三個(gè)基因型的秈粳屬性以親本秈稻品種滬恢99（R99）和粳稻品種沈農(nóng) 265（SN265）的淀粉特性為基準(zhǔn)， 將除親本外的其他所有株系的淀粉特性同樣按照秈稻品種滬恢99（R99）淀粉特性接近、與粳稻品種沈農(nóng)265（SN265）的淀粉特性接近以及與兩者都不接近的雜合型分為偏秈型Preindica、偏粳型 Pre－japonica、中間型 Intermediate，從而得到三種淀粉合成相關(guān)酶基因型秈粳屬性頻次分布圖（如圖2）。 結(jié)果表明：對于SBE3 基因型來說，偏粳型＞偏秈型＞中間型，SSIIIa 基因型偏秈型＞偏粳型＞中間型，UGP1 基因型偏粳型＞偏秈型＞中間型。為了更加深層次的研究在上述三種秈粳屬性下的三個(gè)淀粉基因型與水稻淀粉特性之間的關(guān)系， 我們將SPSS 22.0 處理下的多因素方差分析表匯總到表4。 結(jié)果表明：三個(gè)淀粉基因型與水稻淀粉特性之間均表現(xiàn)出極顯著的差異性，接下來單獨(dú)分析每個(gè)淀粉基因型， 我們發(fā)現(xiàn)SBE3基因型下， 不同秈粳屬性的株系與AAC、Fa、Fb3、RS 未達(dá)到顯著水平；SSIIIa 基因型下， 中間型的AAC 含量顯著高于偏秈型和偏粳型株系，中間型的Fa 含量顯著低于偏秈型和偏粳型株系，中間型的Fb3含量略高于偏秈型株系， 顯著高于偏粳型株系；UGP1 基因型下， 不同秈粳屬性的株系與AAC、Fa、Fb3、RS 未達(dá)到顯著水平。

表3 淀粉合成相關(guān)酶的基因型

表4 不同淀粉基因型與淀粉特性差異性分析

3 討論

作為水稻精米胚乳中最主要的成分， 淀粉的研究日益深入。但目前來說，對于淀粉的研究多以不同生態(tài)環(huán)境背景或針對某一特定的淀粉基因型進(jìn)行研究， 而涉及到水稻秈粳屬性與淀粉特性之間相關(guān)性的研究，目前還無相關(guān)研究。 我們發(fā)現(xiàn)，秈型頻率（Fi）與水稻淀粉特性之間的相關(guān)性雖有著一定的趨勢， 但其相關(guān)性并不顯著。 李修平等（2014）通過元分析的方法進(jìn)一步分析了水稻直鏈淀粉含量的 QTL 及其連鎖圖譜標(biāo)記［14］， 孫春龍（2013）研究發(fā)現(xiàn)水稻抗性淀粉受基因加性效應(yīng)控制，已知的蠟質(zhì)基因（Wx）QTL 定位在水稻第6 染色體上［15］。為了更好的了解水稻淀粉特性，我們進(jìn)行QTL 分析，發(fā)現(xiàn)位于第1 染色體上的2 位點(diǎn)能在表觀直鏈淀粉（AAC）、長分支支鏈淀粉（Fb3）、抗性淀粉 （RS） 都被檢測到， 貢獻(xiàn)率在 1.69%～15.55%，加性效應(yīng)為 0.15～0.72，該位點(diǎn)可能是一個(gè) 穩(wěn) 定 表 達(dá) 的 QTL 區(qū) 域 （Block1835—Block1841）， 控制著四川地區(qū)的表觀直鏈淀粉（AAC）、長分支支鏈淀粉（Fb3）、抗性淀粉（RS）含量。 Chen M H et al（2008）認(rèn)為在水稻淀粉特性中，表觀直鏈淀粉（AAC）是一個(gè)復(fù)雜的特征，受多種基因和環(huán)境的影響， 而最主要就是蠟質(zhì)基因Wx［16］。 Wx 基因編碼顆粒結(jié)合的是淀粉合成酶 I（GBSSI），從而催化表觀直鏈淀粉（AAC）的合成。導(dǎo)致表觀直鏈淀粉（AAC）改變可能受到蠟質(zhì)基因（Wx） 的表達(dá)的影響［17，18］。 除了淀粉特性中的AAC 外，其他淀粉特性指標(biāo) Fa、Fb3、RS 與淀粉合成酶之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。 關(guān)于水稻淀粉基因型的分析，我們從28 個(gè)與淀粉合成過程中相關(guān)的淀粉合成酶進(jìn)行篩選符合條件的三個(gè)重要淀粉合成酶基因SBE3、SSIIIa、UGP1 進(jìn)行分析。其中SBE3、、UGP1 都表現(xiàn)出偏粳型株系略大于偏秈型，SSIIIa 表現(xiàn)出偏秈型略大于偏粳型，中間型表現(xiàn)不明顯。在此基礎(chǔ)上，我們更加需要了解在該分類下， 三種淀粉基因型與淀粉特性之間的差異性，結(jié)果顯示：三個(gè)淀粉基因型以親本淀粉特性為依據(jù)下， 與水稻淀粉特性之間均表現(xiàn)出極顯著的差異性，其中SBE3、UGP1 淀粉基因型，不同秈粳屬性的株系與 AAC、Fa、Fb3、RS 未達(dá)到顯著水平；SSIIIa 基因型， 中間型的AAC 含量顯著高于偏秈型和偏粳型株系，中間型的Fa 含量顯著低于偏秈型和偏粳型株系， 中間型的Fb3含量略高于偏秈型株系，顯著高于偏粳型株系，AAC、Fb3含量變化趨勢一致，與Fa 含量變化趨勢相反，再次印證了淀粉特性指標(biāo)間的關(guān)系。 位于第8 號染色體上的SSIIIa 淀粉合成酶基因型對試驗(yàn)材料中雜合型株系表觀直鏈淀粉 （AAC）、長分支支鏈淀粉（Fb3）含量有正向作用，對秈型株系和粳型株系短支鏈淀粉（Fa）含量有正向作用。 其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。