劉 云,王 偉,郭金玲,任立偉,羅華軍,余華順,戴秋紅,姚 鵑,龔大春*

(1.三峽大學 湖北省生物酵素工程技術研究中心，湖北 宜昌 443002；2.安琪酵母股份有限公司酶制劑事業(yè)部，湖北 宜昌 443002)

生物催化中常用的有機體是微生物，其本質是利用微生物細胞內的酶進行催化[1-3]。生物催化法反應條件溫和，催化過程具有高度的區(qū)域、化學和立體選擇性，是國內外手性制備的主要方法[4-9]。近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)整細胞或其來源的羰基還原酶(carbonyl reductase)在消旋體醇類化合物的去消旋化、前手性酮或烯胺的不對稱還原、消旋體醇類物質的動力學拆分等方面的手性羥基或手性胺藥物研究與開發(fā)中得到廣泛應用[10-11]。Chadha等[12]高度評價了近平滑假絲酵母的生物催化應用價值，把近平滑假絲酵母及其來源的酶作為有機合成中生物催化的一種“試劑”。在合適的反應介質中，近平滑假絲酵母ATCC 7330羰基還原酶(CpCR)能夠不對稱催化乙酮類物質還原生成R或S型甲基醇[12-18]。CpCR的蛋白質空間結構已經被解析，其蛋白編號為4OAQ，其結構如圖1所示。

圖1 CpCR的結構

目前，國內對近平滑假絲酵母ATCC 7330整細胞催化的底物研究較少[19-20]。鑒于此，作者設計10種不同取代基的乙酮類底物，通過計算機模擬預測和實驗驗證，研究近平滑假絲酵母ATCC 7330整細胞催化的底物適應性，以期為該菌株更好應用于生物催化領域奠定基礎。

1 實驗

1.1 菌株、試劑與儀器

近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)ATCC 7330，實驗室保藏。

葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨，北京奧博星生物技術有限責任公司；蔗糖、乳糖、木糖，天津科密歐化學試劑有限公司；標準品：1-苯乙醇、1-(1H-茚-4-基)乙醇、1-(1-萘基)乙醇、對氯苯乙醇、鄰氯苯乙醇、對氨基苯乙醇、鄰氨基苯乙醇、環(huán)丙基乙醇、環(huán)戊基乙醇、1-環(huán)己基乙醇、苯乙酮、1-(1H-茚-4-基)乙酮、1-萘乙酮、對氯苯乙酮、鄰氯苯乙酮、對氨基苯乙酮、鄰氨基苯乙酮、環(huán)丙基乙酮、環(huán)戊基乙酮、環(huán)己基乙酮，武漢藥明康德公司。所有試劑均為分析純。

VS-1300L-U型超凈工作臺，蘇凈安泰；UV1800型紫外分光光度計，日本島津；ZQLY-180型振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器；4L發(fā)酵罐，上海保興生物設備工程有限公司；DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g·L-1)：蔗糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20。

固體培養(yǎng)基(g·L-1)：蔗糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20，瓊脂15。

斜面保藏培養(yǎng)基(g·L-1)：蔗糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20，瓊脂20。

1.3 方法

1.3.1 CpCR與不同取代基乙酮類底物對接的仿真模擬與預測

利用Discovery Studio 2017版軟件，將CpCR分別與自行設計的10種不同取代基乙酮類底物(圖2)進行CDOCKER對接，計算這些乙酮類底物和CpCR的結合能和相互作用能，用于預測近平滑假絲酵母ATCC 7330整細胞的底物適應性和催化能力。

1.3.2 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

平板培養(yǎng)：接種后的斜面置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

種子培養(yǎng)：平板培養(yǎng)液接種到裝液量20%的搖瓶中，于28 ℃培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：種子液以10%接種量接種至搖瓶或發(fā)酵罐中，于28 ℃振蕩培養(yǎng)。

圖2 10種不同取代基乙酮類底物的化學結構式

1.3.3 整細胞催化劑的制備

將長勢良好的斜面菌種挑取 1 環(huán)，接種于固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h；經多次轉接活化后挑選生長良好的單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng) 24 h；將種子液以10%的接種量接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)48 h；將發(fā)酵液于4 ℃、4 500 r·min-1離心，并用生理鹽水洗滌3次后收集細胞，即得整細胞催化劑。

1.3.4 整細胞催化過程

反應介質和萃取劑根據(jù)底物和產物的極性特點來確定。將6.5 g濕細胞置于32.5 mL磷酸緩沖溶液(pH值6.5,10 mmol·L-1)中，制得細胞懸浮液；取0.1 g底物用1.5 mL丙酮溶解，加入到細胞懸浮液中；28 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)一定時間后，用3×50 mL乙酸乙酯(環(huán)丙基乙酮用3×50 mL乙醚)萃取，無水硫酸鈉干燥，旋轉蒸發(fā)濃縮，定容在容量瓶中，備用。

1.3.5 整細胞催化產物的分離

1-(1H-茚-4-基)乙醇、環(huán)丙基乙醇、環(huán)戊基乙醇、1-環(huán)己基乙醇采用氣相色譜柱DB-wax分離(汽化室溫度250 ℃,檢測器溫度250 ℃,柱溫350 ℃,氮載氣流速1.0 mL·min-1)。紫外吸收比較強的物質1-苯乙醇、1-(1-萘基)-乙醇、對氯苯乙醇、鄰氯苯乙醇、鄰氨基苯乙醇、對氨基苯乙醇等采用高效液相色譜柱OB-H分離(流動相為正己烷∶異丙醇=9∶1，柱溫30 ℃，紫外檢測波長254 nm，進樣量10 μL)。

1.3.6 化學收率、光學收率和催化劑周轉數(shù)的計算

化學收率和光學收率：采用外標法定量檢測醇類產物。

催化劑周轉數(shù)：1 mol整細胞催化劑1 s催化轉化底物的摩爾數(shù)。用來表征催化劑的催化能力，催化劑周轉數(shù)越大，催化能力越強。

以苯乙酮轉化為苯乙醇為例，化學收率、光學收率、催化劑周轉數(shù)的計算如下：

(1)

(2)

(3)

式中：酶(CpCR)分子量為41 kDa，酶用量為10 mg。

2 結果與討論

2.1 CpCR與10種不同取代基乙酮類底物結合能力的模擬計算

近平滑假絲酵母ATCC 7330整細胞作為一種生物催化劑，能夠催化還原各種有機酮類化合物生成手性羥基化合物。利用Discovery Studio 2017版軟件，將CpCR分別與自行設計的10種不同取代基乙酮類底物進行模擬對接，計算結合能和相互作用能，結果見表1。

表1 CpCR與10種不同取代基乙酮類底物的結合能和相互作用能/(kJ·mol-1)

Tab.1 The docking energy and interaction energy of CpCR combined with ten ethyl ketone substrates with different substituted groups/(kJ·mol-1)

項目芳環(huán)取代基ⅠⅡⅢ帶不同取代基的苯環(huán)取代基ⅣⅤⅥⅦ脂環(huán)取代基ⅧⅨⅩ結合能-13.9220.17-1.39-14.34-12.43-19.41-12.730.760.9114.74相互作用能-16.66-15.87-17.27-17.06-19.9-23.68-14.18-9.45-20.3-2.62

從表1可以看出：

(1)CpCR與3類10種不同取代基乙酮類底物模擬對接的結合能差異較大。除了受空間位阻影響的1-(1H-茚-4-基)乙酮(Ⅱ)外，電子云密度高的芳環(huán)取代(包括帶不同取代基的苯環(huán)取代)乙酮類底物的結合能比電子云密度低的脂環(huán)取代乙酮類底物低得多，前者結合能為負值，比較容易發(fā)生催化還原反應；而后者結合能為正值，催化還原難度加大。表明近平滑假絲酵母ATCC 7330整細胞對芳環(huán)取代乙酮類物質的光學選擇性優(yōu)于脂環(huán)取代乙酮類底物。

(2)CpCR與同類不同取代基乙酮類底物模擬對接的對接能差異也較大。對于芳環(huán)取代基，其與CpCR的結合能大小依次為Ⅱ>Ⅲ>Ⅰ，可以預測在CpCR大基團口袋區(qū)域中苯乙酮(Ⅰ)最容易被還原，而1-(1H-茚-4-基)乙酮(Ⅱ)由于空間位阻效應較難與CpCR結合，被還原的難度最大；對于帶不同取代基的苯環(huán)取代基，其與CpCR的結合能大小依次為Ⅴ>Ⅶ>Ⅳ>Ⅵ，對位取代苯乙酮比鄰位取代苯乙酮更容易被還原，其中對氨基苯乙酮(Ⅵ)最容易被還原；對于脂環(huán)取代基，結合能均為正值，說明脂環(huán)取代乙酮類底物電子云密度大大降低，使得CpCR對其適應性大大降低，導致光學選擇性降低。

(2)CpCR與3類10種不同取代基乙酮類底物模擬對接的相互作用能均為負值，可以預測近平滑假絲酵母ATCC 7330整細胞對10種不同取代基乙酮類底物均有一定的催化能力。

2.2 近平滑假絲酵母ATCC 7330對10種不同取代基乙酮類底物的催化效果(表2)

表2 近平滑假絲酵母ATCC 7330對10種不同取代基乙酮類底物的催化效果

Tab.2 Catalytic effect ofCandidaparapsilosisATCC 7330 on ten ethyl ketone substrates with different substituted groups

編號底物名稱分子量最佳轉化時間/h化學收率/%光學收率/%催化劑周轉數(shù)/s-1Ⅰ 苯乙酮120.07292.9799.991.56×105Ⅱ1-(1H-茚-4-基)乙酮158.048100.00 98.80 1.88×105Ⅲ1-萘乙酮170.01298.7999.906.96×105Ⅳ對氯苯乙酮154.61299.0099.008.80×105Ⅴ鄰氯苯乙酮154.61299.0099.008.80×105Ⅵ對氨基苯乙酮135.02495.12100.004.40×105Ⅶ鄰氨基苯乙酮135.04887.0079.221.92×105Ⅷ環(huán)丙基乙酮84.012064.1863.000.92×105Ⅸ環(huán)戊基乙酮112.248100.0057.002.68×105Ⅹ環(huán)己基乙酮126.22453.1285.112.52×105

從表2可以看出：

(1)對于3種芳環(huán)取代乙酮類底物(Ⅰ～Ⅲ)，近平滑假絲酵母ATCC 7330整細胞催化產物構型均為R型，可實現(xiàn)較高的化學收率和光學收率，其中1-(1H-茚-4-基)乙酮的化學收率最高；近平滑假絲酵母ATCC 7330對3種芳環(huán)取代乙酮類底物的催化能力大小依次為Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ，與底物的芳環(huán)電子云密度大小順序正好一致，說明芳環(huán)取代乙酮類底物的電子云密度越大，整細胞的催化效果越好；從光學收率看，苯乙酮和1-萘乙酮均能得到99.90%以上的光學純度，與結合能預測一致。

(2)對于4種帶不同取代基的苯環(huán)取代乙酮類底物(Ⅳ～Ⅶ)，近平滑假絲酵母ATCC 7330整細胞對氯取代苯乙酮的催化效果較對氨基取代苯乙酮的催化效果好，這可能是因為，氯對苯環(huán)的共軛效應貢獻較大，使得羰基上氧的電子云密度較大，從而提高了整細胞催化效率；近平滑假絲酵母ATCC 7330整細胞對鄰氨基取代苯乙酮的催化效果較差，光學收率也較低，這可能與鄰氨基取代苯乙酮與CpCR模擬對接時的相互作用能較高有關；對氨基苯乙酮、對氯苯乙酮、鄰氯苯乙酮與CpCR模擬對接時的結合能均較低，其產物光學收率均達到99.00%以上，與結合能預測一致，但鄰氨基苯乙酮表現(xiàn)出中等的化學收率和光學收率，其原因還在進一步研究中。

(3)對于3種脂環(huán)取代乙酮類底物(Ⅷ～Ⅹ)，光學收率均較低(57.00%～85.11%)，說明近平滑假絲酵母ATCC 7330對脂環(huán)取代乙酮類底物的適應性較差，與預測的結合能較高(為正值)一致；從化學收率和催化劑周轉數(shù)來看，近平滑假絲酵母ATCC 7330對環(huán)戊基乙酮的催化效果較好。

3 結論

從近平滑假絲酵母ATCC 7330對3類10種不同取代基乙酮類底物的催化效果可以看出，近平滑假絲酵母ATCC 7330整細胞催化對芳環(huán)取代乙酮類底物的光學選擇性優(yōu)于脂環(huán)取代乙酮類底物，對氨基苯乙酮的光學選擇性最高，與模擬對接預測的結合能大小一致；從催化劑周轉數(shù)來看，近平滑假絲酵母ATCC 7330整細胞對10種不同取代基乙酮類底物的催化能力大小依次為對氯苯乙酮=鄰氯苯乙酮>1-萘乙酮>對氨基苯乙酮>環(huán)戊基乙酮>環(huán)己基乙酮>鄰氨基苯乙酮>1-(1H-茚-4-基)乙酮>苯乙酮>環(huán)丙基乙酮，與對接模擬預測有一定差距，說明近平滑假絲酵母ATCC 7330整細胞的催化能力除了與結合能有關外，還與細胞的滲透性、反應溶劑等因素有關，需要做進一步研究。