宋紹征，于康英，張婷，陸睿，潘生強，周鳴鳴，成勇

研究報告

/雙基因轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細胞表達分析

宋紹征1，于康英1，張婷2，陸睿2，潘生強1，周鳴鳴1，成勇2

1. 無錫太湖學(xué)院護理學(xué)院，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，無錫 214000 2. 揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇省轉(zhuǎn)基因動物制藥工程研究中心，揚州 225009

人組織纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogen activator, tPA)是一種被廣泛應(yīng)用于臨床的溶栓藥物。雙基因共整合入生物體內(nèi)能夠產(chǎn)生協(xié)同作用，從而提高目的基因的表達水平。但是目前，利用基因與基因共整合以期提高tPA表達水平的相關(guān)研究較少。為篩選獲得tPA高表達的/雙基因整合的單克隆轉(zhuǎn)基因山羊乳腺上皮細胞株，本研究以基因作為調(diào)控序列，構(gòu)建乳腺特異性表達載體PCL25/gGH，并通過電轉(zhuǎn)染將和雙基因共轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細胞；通過G418篩選獲得抗性細胞株，經(jīng)PCR檢測獲得轉(zhuǎn)基因單克隆細胞株；利用催乳素誘導(dǎo)tPA表達，收集48 h后細胞誘導(dǎo)液進行ELISA()和Western blotting檢測并分析其tPA表達水平。結(jié)果表明，共獲得142株抗性單克隆細胞，其中有53株單基因整合細胞株，34株/雙基因整合細胞株，雙基因整合率達23.9% (34/142)。共檢測出29株細胞能夠表達tPA，其中單基因表達細胞為12株，表達率為22.6% (12/53)；雙基因表達細胞為17株，表達率為50.0% (17/34)；且單基因細胞表達tPA含量為7.5~52.0 μg/mL，而雙基因細胞表達tPA含量為40~360 μg/mL，明顯高于單基因表達水平。本研究通過電轉(zhuǎn)染的方式成功獲得了/雙基因整合的單克隆山羊乳腺上皮細胞株，并證明雙基因整合的細胞株表達tPA水平明顯提高，為后期制備高表達轉(zhuǎn)基因山羊奠定了基礎(chǔ)。

tPA；雙基因；轉(zhuǎn)基因；山羊乳腺上皮細胞；表達

自20世紀以來，血栓性疾病一直是危害人類健康和生命安全的頭號因素，溶栓療法是目前臨床上使用最廣泛而有效的一種治療方法[1~3]。人組織纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogen activator, tPA)是由血管內(nèi)皮細胞合成并分泌的一種絲氨酸蛋白酶，能夠高效特異地溶解血栓，是一種較好的溶栓藥物[4]。1991年，Ebert等[2]首次報道了轉(zhuǎn)基因山羊乳腺表達tPA含量為3 μg/mL；2006年，徐寒梅等[5]以β乳球蛋白基因為調(diào)控序列，制備的轉(zhuǎn)基因山羊乳腺表達tPA含量為8.5 μg/mL；本實驗室于2015年在山羊乳腺上皮細胞水平也進行了tPA表達研究，但其tPA表達水平一直相對較低[6]。山羊生長激素(goat growth hormone, gGH)是由垂體前葉分泌的一種蛋白質(zhì)，與催乳素有著類似的結(jié)構(gòu)，控制αs-casein和β-casein的激活，具有促進乳腺生長發(fā)育及維持泌乳的作用[7,8]。

有研究證明，通過雙基因共整合獲得的轉(zhuǎn)基因生物能夠在體內(nèi)同時表達兩種不同的基因，而且雙基因產(chǎn)生協(xié)同作用會促進其中一種基因表達水平的提高[9]。例如韓操等[10]通過慢病毒介導(dǎo)和雙基因轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細胞的研究，bFGF和BMP-2蛋白表達量明顯增加，促進了細胞的增殖水平。王林楠等[11]通過慢病毒介導(dǎo)及雙基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞，NEP1-40和NT-3 mRNA相對表達量及蛋白表達量均顯著高于單基因轉(zhuǎn)染。陳寧等[12]將與雙基因轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，雙基因轉(zhuǎn)染組的目的蛋白表達量明顯高于對照組。但是，將和雙基因共整合到生物體內(nèi)以期提高tPA表達量的相關(guān)研究較少見報道，尤其是在山羊乳腺上皮細胞中的研究更少。

由于動物乳腺生物反應(yīng)器的研制周期長、前期投資大、涉及技術(shù)難點多及乳蛋白特異性調(diào)控機制復(fù)雜等問題[13]，因此在細胞水平對其前期表達研究至關(guān)重要。山羊乳腺上皮細胞具有誘導(dǎo)表達功能[6]，是一種前期細胞水平驗證研究的良好選擇。本研究主要在前期PCL25/tPA乳腺特異性表達載體(以基因作為調(diào)控序列)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了PCL25/gGH乳腺特異性表達載體，/雙基因共轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細胞，研究目的基因的表達水平，為將來制備高表達轉(zhuǎn)基因動物提供新思路、新方法，也為轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器和轉(zhuǎn)基因育種建立新的技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

薩能奶山羊常規(guī)飼養(yǎng)于揚州大學(xué)實驗農(nóng)牧場，處于泌乳中后期。PCL25/tPA乳腺特性表達載體為本實驗室構(gòu)建、保存(圖1A)，是以β-casein為調(diào)控元件、CMV為啟動子的哺乳動物表達載體，已在山羊()細胞、小鼠()和兔()等得到表達驗證[6,14]；基因由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(兩端含I酶切位點)；宿主菌DH5α由本實驗室保存。

1.2 引物的設(shè)計與合成

PCR引物設(shè)計借助于Primer Premier 5.0軟件完成，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

1.3 PCL25/gGH乳腺特異性表達載體的構(gòu)建

應(yīng)用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建PCL25/gGH乳腺特異性表達載體，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成山羊生長激素()基因，I酶切PCL25/tPA載體，經(jīng)T4 DNA連接酶(寶生物工程(大連)有限公司)連接基因片段，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，AMP抗性篩選，提取質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序鑒定，正確的菌株命名為PCL25/gGH。

1.4 山羊乳腺上皮細胞的分離、純化

無菌手術(shù)切取大約5 g左右的泌乳期山羊乳腺實質(zhì)組織，D-hanks’緩沖溶液反復(fù)沖洗直至干凈無血跡和乳汁，將腺泡組織剪成約1 mm3大小，添加30 mL I型膠原酶消化液(含I型膠原酶200 IU/mL，透明質(zhì)酸酶100 IU/mL)振蕩消化1 h，收集懸液，300目的篩網(wǎng)過濾，收集濾液離心后，用D-hank’s離心洗滌3次，細胞計數(shù)并用培養(yǎng)液(含DMEM/F12，購自美國Thermo公司；10% FBS，購自美國Hyclone公司；乙酸鈉5 mmol/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白5 μg/mL，乙醇胺0.5 mmol/L，胰島素10 μg/mL，氫化可的松5 μg/mL，均購自美國Sigma公司)調(diào)整密度至5×105個/mL接種于六孔板中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。待貼壁細胞匯合至80%時，用0.05%胰蛋白酶 + 0.04% EDTA消化2 min后，棄去含脫壁成纖維細胞的消化液，重新加入培養(yǎng)液培養(yǎng)，重復(fù)兩次可獲得較純的乳腺上皮細胞。

表1 PCR擴增引物序列

1.5 PCL25/tPA與PCL25/gGH雙基因共轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細胞

PCL25/tPA與PCL25/gGH載體經(jīng)I和I雙酶切而分別線性化，用QIAGEN試劑盒回收后溶于超純水中，?20℃保存。收集對數(shù)生長期的山羊乳腺上皮細胞，用電轉(zhuǎn)染液洗滌離心后重懸細胞密度至1×106個/mL，加入DNA使終濃度為20 μg/mL，以2.0 KV/cm，200 μs的條件電擊一次(Multiporator電轉(zhuǎn)染儀，購自德國Eppendorf公司)。48 h后加入500 μg/mL G418 (美國Amesco公司)篩選，每2 d換一次液，10~14 d后挑取克隆細胞于48孔細胞培養(yǎng)板，以200 μg/mL G418篩選擴增傳代至12孔板，收集部分細胞用DMEM/F12 + 10% DMSO + 20% FBS的冷凍液凍存，另一部分用于后續(xù)檢測。

1.6 PCR檢測單克隆細胞株

使用0.05%胰蛋白酶 + 0.04% EDTA消化吹打收集部分細胞懸液，2000 r/min離心5 min，棄上清，加入10 μL細胞裂解液，重懸細胞，45℃孵育45 min、96℃孵育15 min后可直接作為PCR模板，進行和基因整合檢測，引物序列見表1。

1.7 ELISA表達檢測

待12孔板中細胞匯集至80%左右，棄去舊培養(yǎng)液，添加含5 μmol/L催乳素的新鮮培養(yǎng)液進行誘導(dǎo)表達，48 h后收集細胞誘導(dǎo)液，進行ELISA檢測，使用鼠抗tPA單克隆抗體作為一抗(sc-59721，美國Santa Cruz公司)、羊抗鼠單克隆抗體IgG-HRP作為二抗(sc-2005，美國Santa Cruz公司)，顯色后酶標(biāo)儀測定450值，并繪制標(biāo)準曲線、計算tPA表達量，比較/雙基因整合和單基因整合的山羊乳腺上皮細胞誘導(dǎo)表達水平。

1.8 Western blotting檢測

按照常規(guī)方法對細胞誘導(dǎo)液進行12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)[13]。使用轉(zhuǎn)移緩沖液(1.93 g/L Tris, 9 g/L Glycine)將丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，250 mA，轉(zhuǎn)印3.5 h。超純水沖洗后，37℃封閉(20 mmol/L Tris, 137 mmol/L NaCl, 0.1% Tween- 20, 10% Fetal bovine serum, pH 7.6)，2.5 h。加入一抗稀釋液(1∶2000稀釋，鼠抗tPA單克隆抗體，sc-59721，美國Santa Cruz公司)，37℃孵育2 h。TTBS (20 mmol/L Tris, 137 mmol/L NaCl, 1% Tween-20, pH 7.6)洗滌3次后，加入二抗-HRP稀釋液(1∶2000稀釋，羊抗鼠單克隆抗體IgG-HRP，sc-2005，美國Santa Cruz公司)中，37℃孵育2 h。取出PVDF膜，PBS洗凈后，添加顯色液(DAB 50 mg, 0.05 mol/L TB 100 mL, 30 μL 30% H2O2, pH7.6)，室溫15 min，晾干后拍照、記錄并保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCL25/gGH乳腺特異性表達載體鑒定

在實驗室原有的PCL25/tPA乳腺特異性表達載體(圖1A)基礎(chǔ)上，通過常規(guī)分子生物學(xué)手段，以基因置換基因，重新構(gòu)建的PCL25/gGH質(zhì)粒經(jīng)I酶切后，分別擴增出約670 bp和21 261 bp大小的條帶(圖1B)，與目標(biāo)條帶大小一致。

2.2 tPA/gGH雙基因整合乳腺上皮細胞分析

純化后的未轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細胞生長旺盛、形態(tài)均一、細胞之間排列緊密，其形狀呈現(xiàn)典型的短梭狀或鵝卵石狀(圖2)。經(jīng)篩選，本研究共獲得142株單克隆抗性細胞株，進一步利用CMV/tPA-F/R引物進行PCR擴增，經(jīng)檢測，獲得87株整合外源基因細胞株，能擴增出561 bp大小的目標(biāo)條帶(圖3A)；利用gGH-F/R引物對這87株細胞進行基因整合檢測，共獲得34株整合基因的細胞株，擴增出670 bp大小的目標(biāo)條帶(圖3B)。因此，本研究共獲得53株單基因整合入乳腺上皮細胞的細胞株，整合效率為37.3% (53/142)；34株/雙基因整合乳腺上皮細胞株，雙基因整合效率達到23.9% (34/142)，具體詳見表2。

圖1 乳腺特異性表達載體PCL25/gGH構(gòu)建示意圖

A：PCL25/tPA和PCL25/gGH載體結(jié)構(gòu)示意圖；B：PCL25/gGH載體Ⅰ酶切鑒定。M1：DL2000 digest DNA Marker；M2：λ-T14 digest DNA Marker。

圖2 純化后的乳腺上皮細胞

2.3 tPA在單克隆細胞株中的誘導(dǎo)表達分析

分別對整合單基因、/雙基因的山羊乳腺上皮細胞進行催乳素誘導(dǎo)tPA表達，收集48 h后的細胞誘導(dǎo)液進行ELISA檢測，重復(fù)一次，取平均值。結(jié)果顯示，共有29株細胞能夠表達tPA，表達率為33.3% (29/87)，其中單基因表達細胞有12株，表達率為22.6% (12/53)，雙基因表達細胞有17株，表達率為50.0% (17/34) (表2)。以tPA標(biāo)準品(阿替普酶)濃度(μg/mL)作為縱坐標(biāo)、450 nm值作為橫坐標(biāo)，制作相應(yīng)的標(biāo)準曲線(圖4)，計算乳腺細胞誘導(dǎo)表達tPA的水平，其中單基因細胞表達tPA含量為7.5~52.0 μg/mL，而雙基因細胞表達tPA含量為40~360μg/mL，明顯高于單基因整合細胞株的表達量。

2.4 Western blotting對表達蛋白的鑒定

以鼠抗tPA單克隆抗體作為一抗，利用Wes-tern blotting檢測收集的細胞誘導(dǎo)液表達tPA的，結(jié)果如圖5所示。表達細胞誘導(dǎo)液和陽性對照(tPA標(biāo)準品)均出現(xiàn)約39.0 kDa大小的條帶，與目標(biāo)蛋白tPA的大小一致，而未表達細胞誘導(dǎo)液和陰性對照均未出現(xiàn)條帶，這說明與ELISA檢測結(jié)果一致，初步判斷整合外源基因的山羊乳腺上皮細胞經(jīng)催乳素誘導(dǎo)表達的蛋白為tPA目標(biāo)蛋白。

圖3 轉(zhuǎn)tPA/gGH雙基因山羊乳腺上皮細胞PCR檢測結(jié)果

A：轉(zhuǎn)基因的PCR檢測結(jié)果。1～22：乳腺上皮細胞單克隆；M：λ-T14 digest DNA Marker；23：陰性對照(正常細胞基因組)；24：陽性對照(PCL25/tPA質(zhì)粒)。B：轉(zhuǎn)gGH基因的PCR檢測結(jié)果。1～22：乳腺上皮細胞單克隆；M：DL2000 digest DNA Marker；23：陰性對照(正常細胞基因組)；24：陽性對照(PCL25/gGH質(zhì)粒)。

表2 tPA/gGH雙基因轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細胞情況統(tǒng)計表

圖4 轉(zhuǎn)基因單克隆乳腺上皮細胞株表達tPA的檢測結(jié)果

tPA標(biāo)準品的濃度分別是0、6.25、12.5、25、50、100、200和400 μg/mL；34#、121#分別是單基因整合的山羊乳腺上皮細胞株誘導(dǎo)表達tPA的最高量和最低量；7#、62#分別是/雙基因整合的山羊乳腺上皮細胞株誘導(dǎo)表達tPA的最高量和最低量。

圖5 轉(zhuǎn)基因單克隆乳腺上皮細胞株表達tPA的western blotting檢測結(jié)果

M：蛋白分子量標(biāo)準；1~3：表達細胞誘導(dǎo)液(62#、34#、7#)；4：未表達細胞誘導(dǎo)液；5：陰性對照(未誘導(dǎo))；6：空白對照(H2O)；7：陽性對照(tPA標(biāo)準品)。

3 討論

隨著人們生活水平的不斷提高，飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的不斷改變，血栓疾病在我國已呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢，并有著向中青年人發(fā)展的趨勢[3,15]。人組織纖溶酶原激活劑(tPA)作為一種溶栓藥物，在臨床上治療血栓類疾病發(fā)揮著重要作用[16]，但如何高效、低成本、簡便地生產(chǎn)tPA一直困擾著科學(xué)界。自20世紀90年代，Wright等[17]在羊乳腺中成功地表達了人α-抗胰蛋白酶基因以來，乳腺生物反應(yīng)器得到了長足的發(fā)展，為生產(chǎn)tPA類溶栓藥物提供了較大的可能性。利用動物乳腺生物反應(yīng)器來生產(chǎn)tPA等溶栓藥物，具有產(chǎn)量高、成本低、翻譯后修飾、生物活性高等優(yōu)于其他表達系統(tǒng)的特點[6]。但哺乳動物乳腺表達tPA產(chǎn)量一直較低，這可能是由于tPA是一種非乳蛋白，而乳蛋白的特異性表達機制較復(fù)雜、基因網(wǎng)絡(luò)涉及到多個基因及調(diào)控元件的相互作用等。因此，積極探索如何提高哺乳動物乳腺中表達外源基因至關(guān)重要。

將兩個基因共同整合到動物體內(nèi)會產(chǎn)生協(xié)同作用[9,18]，其中一種基因能夠促進另一種目標(biāo)基因表達水平的提高，從而解決轉(zhuǎn)基因動物中表達tPA較低的問題，獲得較高的產(chǎn)量。近年來，雙基因提高外源基因表達水平的研究已有報道，例如Dominggues等[19]將血紅蛋白四聚體的與兩個亞基克隆到同一啟動子trc的下游，實現(xiàn)了多基因的共表達。陳寧等[12]將與雙基因轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，使雙基因轉(zhuǎn)染組的目的標(biāo)蛋白表達量顯著地提高。韓操等[10]、王林楠等[11]分別對兔骨髓間充質(zhì)干細胞和神經(jīng)干細胞的研究也證明了雙基因轉(zhuǎn)染的目標(biāo)蛋白表達水平明顯高于單基因。分析原因可能是生物體內(nèi)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)所致，基因表達調(diào)控具有復(fù)雜性和多層次性，有的基因表達能夠激活提高另一種基因的轉(zhuǎn)錄和表達水平[19,20]。但是，在山羊乳腺上皮細胞中的研究較少見報道，尤其是關(guān)于/雙基因轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細胞的表達分析研究尚未見報道。

有研究證明生長激素(GH)對于基因的表達具有促進作用[21,22]，能夠與基因的HRE序列結(jié)合，激活其受體并提高蛋白的特異性表達，同時還能夠刺激乳腺上皮細胞的分化與增殖[23]。因此，本研究選擇了山羊基因作為調(diào)控序列，以本實驗室前期構(gòu)建且驗證表達的PCL25/tPA乳腺特異性表達載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建了PCL25/gGH表達載體。但由于動物乳腺生物反應(yīng)器存在諸如研制周期長、技術(shù)繁雜、動物成本大、風(fēng)險高等問題[14]，故有必要在制備轉(zhuǎn)基因動物之前進行載體表達驗證，而哺乳動物細胞和小鼠是最常用的表達載體驗證工具[6,13]。山羊乳腺上皮細胞雖然是一種極難培養(yǎng)的終末分化細胞，但由于具有誘導(dǎo)表達功能，可使用催乳素等誘導(dǎo)[6]，因此該細胞是目前應(yīng)用最廣泛的一種驗證乳腺特異性表達載體的技術(shù)手段。而且，本研究選擇的基因能夠促進乳腺上皮細胞的增殖，本研究結(jié)果成功獲得的眾多轉(zhuǎn)基因細胞株也較好地證明了這一點。

本研究通過電轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細胞的雙基因載體PCL25/tPA和PCL25/gGH均是以山羊基因為調(diào)控序列，共獲得/雙基因整合的轉(zhuǎn)基因乳腺上皮細胞34株(整合率23.9%)，tPA單基因整合細胞53株(整合率37.3%)，轉(zhuǎn)基因整合效率較高。催乳素誘導(dǎo)表達結(jié)果顯示雙基因整合能夠明顯提高轉(zhuǎn)基因細胞中外源目的基因的表達水平，最高表達水平達360 μg/mL，而且表達率也明顯高于單基因整合細胞株(50.0%/22.6%)。分析原因可能是基因能夠與山羊基因調(diào)控序列發(fā)揮協(xié)同促進作用，從而提高外源基因的表達水平。同時，由于單基因表達水平過低，部分細胞株表達tPA量極低而不易被ELISA檢測出，當(dāng)額外轉(zhuǎn)入對表達具有協(xié)同促進作用的基因時，使部分原先表達水平極低的細胞株表達tPA量顯著提高，從而被檢出來，故/雙基因整合細胞株的表達率也明顯高于單基因整合細胞株。但是，基因表達涉及到整合位點、表觀遺傳、外源基因拷貝數(shù)、相關(guān)激素水平及基因網(wǎng)絡(luò)等多方面的影響[13,23,24]，因此，本實驗室今后還會進行深入的后續(xù)研究工作，重點闡明整合位點與基因拷貝數(shù)對tPA表達水平的影響。

綜上所述，本研究成功地制備了/雙基因整合的山羊乳腺上皮細胞株，并證明了雙基因整合入山羊細胞的可行性以及在細胞水平能夠高效地表達外源目的基因，為將來制備高表達轉(zhuǎn)基因山羊及其他動物奠定了基礎(chǔ)，也為轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器和轉(zhuǎn)基因育種建立新技術(shù)提供了前提保障。

[1] Zhou J, Limsakun T, Yin O, Warren V, Zamora C, Atiee G, Kochan J, Pav J, Kobayashi F, Vashi V, Dishy V. First-in- human study to assess the safety, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of an oral formulation of DS-1040, an inhibitor of the activated form of thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor, in healthy subjects., 2019, 59(12): 1669–1677.

[2] Ebert KM, Selgrath JP, DiTullio P, Denman J, Smith TE, Memon MA, Schindler JE, Monastersky GM, Vitale JA, Gordon K. Transgenic production of a variant of human tissue-type plasminogen activator in goat milk: generation of transgenic goats and analysis of expression., 1991, 9(9): 835–838.

[3] Scott DM, Ling CY, MacQueen BC, Baer VL, Gerday E, Christensen RD. Recombinant tissue plasminogen activator to restore catheter patency: efficacy and safety analysis from a multihospital NICU system., 2017, 37(3): 291–295.

[4] Wysocki NA, Bambhroliya A, Ankrom C, Vahidy F, Astudillo C, Trevino A, Malazarte R, Cossey TC, Jagolino- Cole A, Savitz S, Wu TC, Sharrief A. Outcomes among patients with ischemic stroke treated with intravenous tPA (Tissue-Type Plasminogen Activator) via telemedicine., 2019, 50(4): 895–900.

[5] Xu HM, Shen ZL, Cheng GX, Xi T, Wu WT. Transient expression of thrombolytic agent-reteplase(rPA) in the mammary glands of milk goats., 2006, 13(3): 166–169.徐寒梅, 沈子龍, 成國祥, 奚濤, 吳梧桐. 奶山羊乳腺瞬時表達溶栓藥物瑞替普酶-reteplase(rPA)的研究. 藥物生物技術(shù), 2006, 13(3): 166–169.

[6] Song SZ. The studies on transgenic rabbits mammary gland-specific expression of recombinant human plasminogen activator (rhPA) and pharmacodynamics [Dissertation]. Yangzhou University, 2015.宋紹征. 轉(zhuǎn)基因兔乳腺特異性表達重組人纖溶酶原激活劑(rhPA)及其藥效學(xué)研究[學(xué)位論文]. 揚州大學(xué), 2015.

[7] Nishihara K, Kobayashi R, Suzuki Y, Sato K, Katoh K, Roh S. Post-prandial decrease in plasma growth hormone levels is not related to the increase in plasma insulin levels in goats., 2017, 30(12): 1696– 1701.

[8] Li MY, Min LJ, Sun GQ, Pan QJ, Shen W, Wang GL. Polymorphism analysis of the goat growth hormone gene in the 5’ regulatory sequence., 2004, 26(6): 831–835.李美玉, 閔令江, 孫國強, 潘慶杰, 沈偉, 王廣蓮. 山羊生長激素基因5′調(diào)控區(qū)的多態(tài)性分析. 遺傳, 2004, 26(6): 831–835.

[9] Siddiqui HA, Asif M, Asad S, Naqvi RZ, Ajaz S, Umer N, Rauf I, Sarwar M, Arshad M, Amin I, Saeed M, Mukhtar Z, Bashir A, Mansoor S. Development and evaluation of double gene transgenic cotton lines expressing Cry toxins for protection against chewing insect pests., 2019, 9(1): 1–7.

[10] Hao C, Wang ZD, Yan N. Effect of transfected BMP-2 and b FGF double gene lentivirus vectors on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells in rabbit., 2019, 25(1): 25–27, 31.韓操, 王正東, 顏南. 慢病毒介導(dǎo)bFGF和BMP-2雙基因轉(zhuǎn)染對兔骨髓間充質(zhì)干細胞增殖的影響. 解剖科學(xué)進展, 2019, 25(1): 25–27, 31.

[11] Wang LN, Wang L, Song YM, Liu LM, Yang X, Feng GJ, Zhou CG. Experimental study of lentivirus-mediated Nogo extracellular peptide residues 1-40 gene and neurotrophin 3 gene co-transduction in neural stem cells.,2018, 32(04): 420–427.王林楠, 汪雷, 宋躍明, 劉立岷, 楊曦, 豐干均, 周春光. 慢病毒介導(dǎo)NEP1-40及NT-3雙基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞的實驗研究. 中國修復(fù)重建外科雜志, 2018, 32(4): 420– 427.

[12] Chen N, Jiang LB, Su M, Xu W, Li CX, Wang RY, Tang JC, Bei CY. Transfected double gene pCDNA3.1-NGF- IRES-BMP2 eukaryotic plasmid and its inductive effects for osteo-genesis in rat BMSCs., 2016, 24(4): 345–351.陳寧, 蔣林彬, 粟謀, 徐威, 李朝旭, 王銳英, 唐際存, 貝朝涌. 雙基因pCDNA 3.1-NGF-IRES-BMP2真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs誘導(dǎo)成骨的研究. 中國矯形外科雜志, 2016, 24(4): 345–351.

[13] Cheng Y. Mammary gland-specific expression of hLF cDNA driven by lactoprotein and cytomegalovirus (CMV) chimeric promoters [Dissertation]. Nanjing Agricultural University, 2007.成勇. 乳蛋白與CMV復(fù)合啟動子驅(qū)動hLFcDNA乳腺特異性表達[學(xué)位論文]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

[14] Song SZ, Ge X, Cheng YB, Lu R, Zhang T, Yu BL, Ji XQ, Qi ZQ, Rong Y, Yuan YG, Cheng Y. High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity., 2016, 43(8): 775–783.

[15] Vandelli L, Marietta M, Trenti T, Varani M, Bigliardi G, Rosafio F, Dell'acqua ML, Picchetto L, Nichelli P, Zini A. Fibrinogen concentrate replacement in ischemic stroke patients after recombinant tissue plasminogen activator treatment., 2019, 28(2): 219–222.

[16] Grummisch JA, Jadavji NM, Smith PD. The pleiotropic effects of tissue plasminogen activator in the brain: implications for stroke recovery.,2016, 11(9): 1401–1402.

[17] Wright G, Carver A, Cottom D, Reeves D, Scott A, Simons P, Wilmut I, Garner I, Colman A. High level expression of active human alpha-1-antitrypsin in the milk of transgenic sheep., 1991, 9(9): 830– 834.

[18] Torres V, Barra L, Garcés F, Ordenes K, Leal-Ortiz S, Garner CC, Fernandez F, Zamorano P. A bicistronic lentiviral vector based on the 1D/2A sequence of foot-and- mouth disease virus expresses proteins stoichiometrically., 2010, 146(3): 138–142.

[19] Domingues E, Brillet T, Vasseur C, Agier V, Marden MC, Baudin-Creuza V. Construction of a new polycistronic vector for over-expression and rapid purification of human hemoglobin., 2009, 61(1): 71–77.

[20] Wang ZH, Liu QJ, Zhu YP. Research on modular organization of gene regulatory network., 2008, 30(1): 20–27.王正華, 劉齊軍, 朱云平. 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的模塊化組織研究. 遺傳, 2008, 30(1): 20–27.

[21] Zhou Y, Akers RM, Jiang H. Growth hormone can induce expression of four major milk protein genes in transfected MAC-T cells., 2008, 91(1): 100–108.

[22] Li L, He ML, Liu Y, Zhang YS. Buffering agent-induced lactose content increases via growth hormone-mediated activation of gluconeogenesis in lactating goats., 2018, 67(2): 317–329.

[23] Maningat PD, Sen P, Rijnkels M, Hadsell DL, Bray MS, Haymond MW. Short-term administration of rhGH increases markers of cellular proliferation but not milk protein gene expression in normal lactating women., 2011, 43(8): 381–391.

[24] Yang XQ, Wu ZF, Li ZC. Advances in epigenetic reprogramming of somatic cells nuclear transfer in mammals., 2019, 41(12): 1099–1109.楊旭瓊, 吳珍芳, 李紫聰. 哺乳動物體細胞核移植表觀遺傳重編程研究進展. 遺傳, 2019, 41(12): 1099–1109.

Expression analysis of/double genes in transfected goat mammary epithelial cells

Shaozheng Song1, Kangying Yu1, Ting Zhang2, Rui Lu2, Shengqiang Pan1, Mingming Zhou1, Yong Cheng2

tPA is a thrombolytic agent widely used in clinical settings. While double gene co-integration into organisms can produce synergistic effects and improved expression levels of the target gene, there are few reports detailing the co-integration of theandgenes and an increased expression level of tPA. In order to study this, we obtained monoclonal goat mammary epithelial cell lines with/double gene integration and we analyzed the tPA expression level of single and double gene integration cells.We constructeda mammary gland-specific expression vector PCL25/gGH by using the β-casein gene as the regulatory sequence. Theandgenes were co-transfected into goat mammary epithelial cells by electrotransfection. Resistant cell lines were screened by G418, and transgenic monoclonal cell lines were obtained by PCR detection. tPA expression was induced by prolactin and subsequently, the cell induction solution was assayed after 48 hours by ELISA and Western blotting. The results show that a total of 142 resistant monoclonal cells were obtained including 53monogenic integration cell lines and 34/double gene integration cell lines. The rate of double gene integration was 23.9% (34/142). A total of 29 cells were detected to be able to express tPA, of which 12 were single-gene-expressing cells and the corresponding expression rate was 22.6% (12/53). There were 17 double-gene- expressing cells with a corresponding expression rate of 50.0% (17/34). The expression level of tPA in single-gene cells was 7.5-52.0 μg/mL, while in double-gene cells was 40-360 μg/mL, which was significantly greater than that in single- gene cells. The goat mammary epithelial cell lines with/gene integration were successfully obtained by electrotransfection, and we proved that the expression level of tPA in the double gene integration cell lines with/gene integration was significantly increased. Our findings lay the foundation for the additional study of highly expressed transgenic goats and other animals with determination of scientific and clinical utility.

tPA; double genes; transgene; goat mammary epithelial cells; expression

2019-09-24;

2019-11-29

江蘇省高校自然科學(xué)基金面上項目(編號：17KJD310004，19KJB180030)和國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2014ZX08008-004)資助[Supported by the Natural Science Foundation of Colleges and Universities in Jiangsu Province (Nos. 17KJD310004, 19KJB180030) and National Major Special Projects on New Cultivation for Transgenic Organisms (No. 2014ZX08008-004)]

宋紹征，博士，講師，研究方向：轉(zhuǎn)基因與胚胎工程。E-mail: ssz0610@163.com

成勇，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：轉(zhuǎn)基因動物制藥與胚胎工程。E-mail: chengyong12@yeah.net

周鳴鳴，博士，副教授，研究方向：分子醫(yī)學(xué)與遺傳學(xué)、基因工程。E-mail: zmm19770@126.com

10.16288/j.yczz.19-299

2020/3/6 16:47:34

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200306.1125.005.html

(責(zé)任編委: 任軍)