馮秀晶，易紅梅，任星旭，任佳麗，葛建镕，王鳳格

綜 述

數(shù)字PCR技術(shù)及其在檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

馮秀晶，易紅梅，任星旭，任佳麗，葛建镕，王鳳格

北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心，玉米DNA指紋及分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和需求的多樣化，用于核酸檢測(cè)的各種PCR衍生技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。數(shù)字PCR是一種單分子水平的大規(guī)模分區(qū)擴(kuò)增定量核酸檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)以微腔室/微孔或微滴作為PCR反應(yīng)器，無(wú)需校準(zhǔn)物和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品初始濃度的絕對(duì)定量，具有高靈敏度、高特異性和高精確度的特點(diǎn)。本文詳細(xì)介紹了數(shù)字PCR的技術(shù)發(fā)展史、作用原理以及儀器平臺(tái)類型，系統(tǒng)闡述了數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)、疾病診斷、環(huán)境及食品監(jiān)管等方面的應(yīng)用概況，并對(duì)該技術(shù)的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望，以期對(duì)未來(lái)數(shù)字PCR的開發(fā)利用提供參考。

數(shù)字PCR；單分子；絕對(duì)定量

自1983年Kary Mullis等發(fā)明PCR這一革命性技術(shù)以來(lái)，這種核酸分析方法以其簡(jiǎn)便、直觀、經(jīng)濟(jì)、快捷等特性在檢測(cè)領(lǐng)域一直占據(jù)主導(dǎo)地位[1]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和需求的多樣化，基于普通PCR的各種衍生技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。PCR技術(shù)已不僅僅局限于對(duì)靶基因進(jìn)行體外無(wú)限擴(kuò)增，而是由定性轉(zhuǎn)向了更為精確的定量。1992年，Higuchi等[2]最早提出了實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real time quan-titative polymerase chain reaction, qPCR)的設(shè)想。qPCR通過(guò)在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程中熒光信號(hào)的積累，最后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。此后，qPCR被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、生物育種、食品安全檢測(cè)和法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域。但qPCR依賴于閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)和校準(zhǔn)物，受樣品中抑制劑影響較大，無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)低豐度樣品，這在一定程度上制約了其使用。數(shù)字PCR (digital polymerase chain reaction, dPCR)作為DNA 定量的新技術(shù)在一定程度上彌補(bǔ)了qPCR的不足，無(wú)需校準(zhǔn)物和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品初始濃度的絕對(duì)定量，比傳統(tǒng)qPCR具有更加出色的靈敏度、特異性和精確性。該技術(shù)正在臨床診斷、轉(zhuǎn)基因成分定量、單細(xì)胞基因表達(dá)、環(huán)境微生物檢測(cè)和下一代測(cè)序(next-generation sequencing, NGS)文庫(kù)精確定量和結(jié)果驗(yàn)證等方面逐漸發(fā)揮重要作用[3~8]。

1 dPCR技術(shù)的發(fā)展

dPCR從研發(fā)起始到廣泛應(yīng)用經(jīng)歷了較長(zhǎng)的時(shí)間跨度。1992年，Sykes等[9]報(bào)道了一種基于極限稀釋、PCR和泊松數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)來(lái)定量樣本初始目標(biāo)總數(shù)的方法。該研究在檢測(cè)復(fù)雜背景下低豐度重鏈突變基因時(shí)，將待檢樣品進(jìn)行了極限稀釋使每個(gè)反應(yīng)孔中僅含單個(gè)模板分子，PCR擴(kuò)增結(jié)束后統(tǒng)計(jì)信號(hào)，以此獲得準(zhǔn)確的起始分子數(shù)量。該研究雖未明確提出“數(shù)字PCR”的概念，但建立了dPCR的基本實(shí)驗(yàn)流程：從極限稀釋-PCR-泊松數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；確定了dPCR檢測(cè)中一個(gè)極其重要的原則——以“終點(diǎn)信號(hào)有無(wú)”作為定量方法，形成了dPCR的雛形[10]。1997年，Kalinina等[11]使用納升體積的石英玻璃毛細(xì)管進(jìn)行單克隆模板PCR 擴(kuò)增，根據(jù)熒光探針收集每管內(nèi)單分子信號(hào)，該研究發(fā)展了單分子定量技術(shù)。1999年，Vogelstein和Kinzler[12]在檢測(cè)和定量直腸癌患者糞便樣品中基因突變時(shí)，手動(dòng)將基因組DNA樣品稀釋并等分至384孔板中，待PCR擴(kuò)增結(jié)束后以野生型或突變型探針雜交，結(jié)果顯示100多個(gè)含有基因組DNA的反應(yīng)孔中，只有4個(gè)反應(yīng)孔顯示基因突變。該研究不僅成功開發(fā)了一種癌癥診斷方法，而且首次正式提出了“數(shù)字PCR”的概念，認(rèn)為若采用更多孔板可使檢測(cè)靈敏度更高，指明了dPCR的發(fā)展方向。但是在這一時(shí)期，dPCR操作復(fù)雜，耗費(fèi)人工，難以大規(guī)模開展。2003年，Dressman等[13]設(shè)計(jì)了一個(gè)稱之為“BEAMing”的實(shí)驗(yàn)方案，以一種類似于流式的磁珠乳液擴(kuò)增方法，將模板、引物、PCR試劑和磁珠的混合物分散至液滴中，大多數(shù)液滴不含或含有1個(gè)模板，PCR完成后，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)生物素–鏈霉親和素連接到磁珠上，隨后珠子被打破，探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，通過(guò)流式細(xì)胞儀讀取結(jié)果。該技術(shù)不僅替代了手工在微孔板中進(jìn)行樣品分散的操作，而且將每個(gè)油包水乳化的小液滴變成了PCR反應(yīng)器，其數(shù)量可以達(dá)到100,000。該技術(shù)建立了基于液滴的數(shù)字PCR的工作原理，將數(shù)字PCR的研究又推進(jìn)了一步[14]。雖然研究人員一直致力于對(duì)數(shù)字PCR的操作簡(jiǎn)化和檢測(cè)便捷進(jìn)行優(yōu)化，但范圍多局限在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，商業(yè)化進(jìn)程則是非常緩慢。直到2006年，美國(guó)Fluidigm公司研制并推出第一臺(tái)基于芯片的商業(yè)化數(shù)字PCR系統(tǒng)；美國(guó)Quantalife公司研制出最早的微滴式數(shù)字PCR平臺(tái)。此后，多家國(guó)內(nèi)外公司繼續(xù)研發(fā)推出各種數(shù)字PCR平臺(tái)并投入使用。

2 dPCR技術(shù)的原理及儀器分類

2.1 dPCR作用原理

dPCR的作用原理是將含有核酸分子的反應(yīng)體系進(jìn)行極限稀釋，通過(guò)控制閥門或微滴生成器分散成為體積可小至皮升級(jí)的反應(yīng)單元，每個(gè)反應(yīng)單元作為一個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)器，其中含有或不含待檢靶標(biāo)分子(DNA或RNA)，在PCR擴(kuò)增結(jié)束之后，采集每個(gè)反應(yīng)單元信號(hào)，并以終點(diǎn)信號(hào)的有無(wú)作為判斷標(biāo)準(zhǔn)(有熒光信號(hào)的液滴判讀為“1”，無(wú)熒光信號(hào)的微滴判讀為“0”)，最后根據(jù)泊松分布（Poisson distribution）原理計(jì)算待檢靶標(biāo)分子的濃度或拷貝數(shù)(圖1)。

2.2 dPCR數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)假設(shè)

在通常情況下，dPCR每個(gè)反應(yīng)單元中可能包含2個(gè)或2個(gè)以上的目標(biāo)分子，因此，在dPCR統(tǒng)計(jì)分析中引入了泊松統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的校準(zhǔn)。泊松分布是一種離散概率分布，是指在固定的時(shí)間或空間內(nèi)發(fā)生給定事件的概率，假定事件以固定的平均速率發(fā)生，并與上一次以來(lái)的事件無(wú)關(guān)。泊松概率分布公式如下：

其中𝑃(𝑘)是確定觀察到𝑘目標(biāo)分子的概率，λ是每個(gè)反應(yīng)單元內(nèi)平均目標(biāo)數(shù)，𝑘是反應(yīng)單元內(nèi)實(shí)際存在目標(biāo)分子數(shù)。dPCR結(jié)果分析是基于以下假設(shè)：即目標(biāo)序列在反應(yīng)單元內(nèi)的分布是近乎完美的泊松過(guò)程。設(shè)定為陽(yáng)性反應(yīng)單元數(shù)目，為總反應(yīng)單元數(shù)目，V為單個(gè)反應(yīng)單元體積，為模板稀釋因子，每微升樣品中DNA拷貝數(shù)計(jì)算公式見(jiàn)如下[15,16]：

置信區(qū)間(confidence interval)是指由樣本統(tǒng)計(jì)量所構(gòu)造的總體參數(shù)的估計(jì)區(qū)間。在統(tǒng)計(jì)學(xué)中，一個(gè)概率樣本的置信區(qū)間是對(duì)這個(gè)樣本的某個(gè)總體參數(shù)的區(qū)間估計(jì)。在各平臺(tái)的儀器設(shè)置中，一般選擇泊松分布95%的置信區(qū)間計(jì)算誤差線。

2.3 dPCR儀的分類

目前，dPCR的廣泛應(yīng)用歸因于樣品分散問(wèn)題這一關(guān)鍵制約因素的成功解決。納米加工及微電子技術(shù)發(fā)展使得高通量分散樣品并獲得均勻反應(yīng)單元成為可能。目前市場(chǎng)上使用的數(shù)字PCR儀根據(jù)樣品分散方式可分為兩大類：(1)基于微流控芯片數(shù)字PCR儀。此類平臺(tái)又分為封閉式(美國(guó)Fluidigm公司BioMark以及美國(guó)Formulatrix公司Constellation系統(tǒng))和開放式(美國(guó)ThermoFisher公司Quant Studio)兩種平臺(tái)。封閉式平臺(tái)是在硅片或石英玻璃上光刻多個(gè)微管或微腔室，通過(guò)不同的閥門控制溶液的流動(dòng)，實(shí)現(xiàn)樣品制備、反應(yīng)、分離和檢測(cè)[3]；開放式平臺(tái)是以超高密度親疏水微孔芯片作為反應(yīng)載體，芯片表面被處理成疏水，而微孔內(nèi)部為親水，這種親疏水結(jié)合的方式可使樣品及反應(yīng)體系輕易進(jìn)入微孔而不會(huì)停留在表面，從而形成密集的獨(dú)立微反應(yīng)室并避免了各反應(yīng)之間的交叉污染[17~19]。(2)基于油包水技術(shù)的微滴數(shù)字PCR平臺(tái)(美國(guó)Bio-Rad公司QX100、QX200和RainDrop系列，中國(guó)銳訊生物公司DropX-2000、小海龜BioDigital以及法國(guó)Stilla Technologies公司Naica System)。該平臺(tái)通過(guò)液滴發(fā)生器將乳化液滴分散成大小均一的液滴反應(yīng)單元，樣品分散過(guò)程中的破裂容易造成假陽(yáng)性，而且分散通道的堵塞問(wèn)題也是一個(gè)關(guān)注的重點(diǎn)。相對(duì)于基于芯片的數(shù)字PCR儀，微滴數(shù)字PCR儀價(jià)格更為低廉。各種儀器的詳細(xì)信息見(jiàn)表1所示。

圖1 數(shù)字PCR的作用原理

表1 dPCR儀比較

根據(jù)參考文獻(xiàn)[20,21]匯總修改。

2.3.1 基于反應(yīng)室的方法

基于反應(yīng)室的數(shù)字PCR (chamber-based digital PCR, cdPCR)工作流程是將預(yù)先混合的PCR反應(yīng)液通過(guò)微流控技術(shù)生成乳化液滴并注入預(yù)制的固態(tài)隔板(室)進(jìn)行樣品分散，然后移至專用熱循環(huán)儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，讀取熒光信號(hào)，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性腔室的數(shù)目進(jìn)行分析計(jì)算[22]。每種設(shè)備所裝載反應(yīng)腔室數(shù)目和大小不同，同一設(shè)備上各反應(yīng)腔室大小相同，可確保各腔室之間運(yùn)行環(huán)境一致，cdPCR平臺(tái)可分散反應(yīng)單元數(shù)量通常低于基于微滴的數(shù)字PCR (droplet digital PCR, ddPCR)平臺(tái)。

2.3.2 基于微滴的方法

基于微滴的ddPCR工作流程是將PCR預(yù)混液與微滴生成油導(dǎo)入微滴生成卡，然后置于微滴生成器生成油包水微滴，每個(gè)微滴中含有1個(gè)以上或不含目標(biāo)DNA，移至熱循環(huán)儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，利用微滴讀數(shù)儀讀取每個(gè)液滴內(nèi)的終點(diǎn)熒光，最后利用數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析(https:// www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6311.pdf.)。不同平臺(tái)所能生成反應(yīng)單元的數(shù)目不同，其具體流程如圖2所示。

3 dPCR技術(shù)的應(yīng)用

dPCR作為繼qPCR之后生命科學(xué)領(lǐng)域的又一創(chuàng)新，正以其獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)在轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)、人類疾病診斷、食品安全、農(nóng)業(yè)與環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。

3.1 dPCR在轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1.1 dPCR對(duì)轉(zhuǎn)基因植物拷貝數(shù)及合子性的鑒定

生物技術(shù)的迅猛發(fā)展促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因作物的誕生。在轉(zhuǎn)基因植物研究中，為確保轉(zhuǎn)基因植物的穩(wěn)定整合和遺傳，通常會(huì)選擇單拷貝的純合轉(zhuǎn)基因植株作為進(jìn)一步研究的對(duì)象，而且純合子個(gè)體的檢測(cè)和隨后的選擇是促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物從實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移到大田的關(guān)鍵。此外，在轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)入市場(chǎng)前，各個(gè)國(guó)家、組織和地區(qū)都制定了明確的政策和法規(guī)進(jìn)行監(jiān)管，轉(zhuǎn)基因作物中插入的外源基因拷貝數(shù)是生物安全評(píng)價(jià)中一項(xiàng)重要內(nèi)容[23]。因此，在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)時(shí)會(huì)根據(jù)需求不同測(cè)定其拷貝數(shù)與合子性。先前的研究一般采用Southern blot[24,25]、qPCR[26~28]和NGS[29]等方法進(jìn)行檢測(cè)。但以上檢測(cè)方法均存在一定程度的缺陷。Southern blot可確定被檢轉(zhuǎn)基因植株的拷貝數(shù)，也可根據(jù)雜交信號(hào)亮度差異區(qū)分雜合與純合植株，但模板需求量大而且對(duì)DNA質(zhì)量要求較高，耗時(shí)繁瑣而且若采用同位素標(biāo)記探針還會(huì)有輻射影響[30]。采用qPCR對(duì)于轉(zhuǎn)基因植株的合子性進(jìn)行檢測(cè)，不同的實(shí)驗(yàn)室獲得結(jié)果存在爭(zhēng)議：或主張?jiān)摲椒o(wú)法區(qū)分純合子與雜合子；或可通過(guò)精確的擴(kuò)增條件進(jìn)行有效區(qū)分雜合子[26]。若以qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株的拷貝數(shù)，對(duì)于基因組較大的轉(zhuǎn)基因植株則無(wú)法區(qū)分一個(gè)或兩個(gè)拷貝，需達(dá)到2倍以上的差異[31]。dPCR在轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)及其雜合子鑒定方面具有模板用量少、節(jié)省時(shí)間及勞動(dòng)量和結(jié)果更為精準(zhǔn)的優(yōu)勢(shì)。在玉米(L.)中，采用qPCR和ddPCR兩種方法均可成功檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因玉米雜合子，但ddPCR因其可直接絕對(duì)定量而更為便捷[32]。目前已建立了適用于水稻(L.)、柑橘(L.)、馬鈴薯(L.)、玉米(L.)、番茄(L.)和小麥(L.) 6種轉(zhuǎn)基因作物外源基因拷貝數(shù)的ddPCR檢測(cè)體系[33]。

圖2 微滴數(shù)字PCR流程示意圖

A：制備PCR反應(yīng)液；B：微滴發(fā)生器生成油包水乳化液滴；C：在PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增；D：微滴讀取儀讀取數(shù)據(jù)分析結(jié)果。

3.1.2 dPCR對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分的檢測(cè)

自1996年轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化生產(chǎn)以來(lái)，轉(zhuǎn)基因作物種植面積逐漸增多。據(jù)ISAAA(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applica-tions)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，截止到2018年，全球已有70個(gè)國(guó)家進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因作物應(yīng)用(種植或進(jìn)口用作食品/飼料)，種植面積已達(dá)1.917億ha[34]。鑒于人們對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的認(rèn)知，各國(guó)采用了標(biāo)識(shí)制度對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行監(jiān)管，并根據(jù)各自需求制定了相應(yīng)的標(biāo)識(shí)閾值，因此需要相應(yīng)的技術(shù)方法對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品組分進(jìn)行精確定量[35~37]。目前已發(fā)布的轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)(物種、元件和事件特異性)多是基于Taqman水解探針的qPCR方法[38,39]。隨著技術(shù)進(jìn)步和獲批轉(zhuǎn)基因作物數(shù)量的增加，復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物已然占據(jù)市場(chǎng)主導(dǎo)地位，而基因編輯等新育種技術(shù)所培育的品種正推向市場(chǎng)，繼續(xù)完全使用qPCR方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分檢測(cè)則面臨巨大挑戰(zhàn)：(1)每種組分的qPCR定量都需要相應(yīng)的校準(zhǔn)品和高質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)檢測(cè)和定量含有多個(gè)轉(zhuǎn)化事件的樣品時(shí)(如評(píng)估食品或飼料標(biāo)簽)，總體相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)等于所有轉(zhuǎn)化事件定量分析結(jié)果的總和，難以在含量臨近檢測(cè)限(limit of detec-tion, LOD)時(shí)進(jìn)行精準(zhǔn)定量；(3)抑制劑對(duì)校準(zhǔn)品和待檢樣品擴(kuò)增效率影響較大，易導(dǎo)致定量結(jié)果有所偏差；(4)校準(zhǔn)品制備繁瑣且價(jià)格昂貴，增大了檢測(cè)成本。dPCR可在一定程度上解決使用qPCR檢測(cè)所存在的問(wèn)題。

現(xiàn)有qPCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)可以直接轉(zhuǎn)化為dPCR，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室已開始測(cè)試并驗(yàn)證了dPCR在轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)方面的潛力。我國(guó)已制定了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品數(shù)字PCR檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)。利用cdPCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米MON810有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行DNA拷貝數(shù)定量分析，獲得了與以質(zhì)粒DNA作為校準(zhǔn)品的qPCR方法一致的檢測(cè)結(jié)果，確定了以cdPCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)限(limit of detection, LOD)和定量限(limit of quantitation, LOQ)[8,40]。多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)對(duì)ddPCR方法中的相關(guān)參數(shù)(引物濃度、反應(yīng)單元體積、退火/延伸溫度和液滴分離等)進(jìn)行了優(yōu)化評(píng)估，建立了適用于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和常規(guī)檢測(cè)樣品的ddPCR定量分析方法[41~43]。Morisset等[44]利用ddPCR對(duì)常規(guī)的食品和飼料樣品中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行了定量適用性分析，與已驗(yàn)證的qPCR和cdPCR相比更為精確和經(jīng)濟(jì)有效。

目前市場(chǎng)上推廣的dPCR儀多數(shù)配有兩種熒光通道。從經(jīng)濟(jì)效益的角度考慮，多重dPCR具有更好的市場(chǎng)前景。與雙重qPCR類似，目前已報(bào)道的幾種方法可同時(shí)定量一個(gè)靶標(biāo)基因和一個(gè)內(nèi)參基因[44~46]。利用雙通道(例如FAM/VIC)分析3個(gè)靶標(biāo)的檢測(cè)體系也已建立[47~49]。此外，通過(guò)同一通道內(nèi)探針濃度差異(如100 nmol/L和300 nmol/L)進(jìn)行多重檢測(cè)也是可選方案。多重dPCR理論上為在一個(gè)熒光通道中同時(shí)測(cè)量某一物種的多個(gè)歐盟授權(quán)事件和在另一個(gè)熒光通道中測(cè)量物種內(nèi)參基因提供支持。Dobnik等[50]利用ddPCR建立了針對(duì)歐盟授權(quán)的12種轉(zhuǎn)基因玉米品系轉(zhuǎn)基因成分多重定量分析方法。Dobnik等[51]應(yīng)用多重ddPCR對(duì)歐盟授權(quán)轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行了檢測(cè)并獲得了實(shí)驗(yàn)室間聯(lián)合驗(yàn)證。以上方案均是針對(duì)同一物種多個(gè)轉(zhuǎn)化事件，并未將具有復(fù)合性狀轉(zhuǎn)化事件考慮在內(nèi)。

3.2 dPCR在人類疾病診斷中的應(yīng)用

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和人類全基因測(cè)序的完成，研究發(fā)現(xiàn)某些腫瘤是由基因片段缺失、插入、突變或表觀遺傳修飾造成，而這種變異僅發(fā)在腫瘤細(xì)胞上，因此可將這種變異作為鑒定腫瘤發(fā)生的標(biāo)記物。當(dāng)人有一個(gè)或多個(gè)特定基因組區(qū)域出現(xiàn)缺失/復(fù)制時(shí)，就會(huì)發(fā)生拷貝數(shù)的變異(copy num-ber variations, CNVs)，這種CNVs可以自然發(fā)生，但在人類中可用作疾病狀態(tài)的指示。因此，dPCR可應(yīng)用于腫瘤早期診斷、產(chǎn)前篩查及感染性疾病的判定[52,53]。在對(duì)唐氏綜合征(downs syndrome, DS)和乳腺癌(breast cancer)等由非整倍體改變而致病的疾病診斷中，使用dPCR方法可更為精確地檢測(cè)到微小的倍數(shù)變化[54]。鐮狀細(xì)胞貧血(sickle cell anemia)是一種由基因突變引起的常染色體顯性遺傳病，可導(dǎo)致高達(dá)5%的胎兒死亡率及4.62%的孕婦死亡率，精準(zhǔn)有效的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷是預(yù)防鐮狀細(xì)胞貧血患兒出生的有效方法。采用dPCR方法對(duì)孕婦血漿中胎兒游離DNA (cff-DNA)進(jìn)行無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)，可確定87%的男性胎兒(=45)和75%的女性胎兒(=20)中基因的突變狀態(tài)；當(dāng)cff-DNA濃度大于7%時(shí)，可以100%的檢測(cè)出基因突變[55]。此外，dPCR已被成功應(yīng)用于對(duì)病毒載量的測(cè)定，從而輔助對(duì)疾病進(jìn)行診斷和檢測(cè)療效[56,57]。

3.3 dPCR在微生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

微生物學(xué)的檢測(cè)對(duì)象包括細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲等。一些食源性細(xì)菌如蠟樣芽孢桿菌()、金黃色葡萄球菌()、產(chǎn)氣莢膜梭菌()等和真菌如曲霉()、鐮刀菌()、青霉(spp.)等在繁殖后會(huì)產(chǎn)生毒素，即使經(jīng)過(guò)諸如加熱、輻射或高壓等滅殺處理后仍持續(xù)存在(如鐮刀菌產(chǎn)生的曲霉烯真菌毒素、金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素和蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生的嘔吐毒素)[58~60]。人們一般使用微生物計(jì)數(shù)的方法來(lái)粗略評(píng)估。由于并非所有菌株都產(chǎn)生毒素，所以微生物數(shù)量與毒素的產(chǎn)生并不嚴(yán)格相關(guān)，此外毒素的產(chǎn)生還會(huì)因菌株和環(huán)境條件而存在差異。一些食源性病原體(細(xì)菌和真菌)產(chǎn)生的毒素DNA在經(jīng)過(guò)如上滅殺后仍然存在。因此，基于DNA的dPCR檢測(cè)和定量方法可用來(lái)評(píng)估潛在的毒素。

甲型肝炎病毒(hepatitis A virus, HAV)和諾如病毒(norovirus, NoV)是食源性人類病毒疾病的重要病原體，二者均為RNA病毒，現(xiàn)有常規(guī)方法還無(wú)法培養(yǎng)此類病毒，檢測(cè)方法主要依賴于RT-PCR和qPCR。理論上，dPCR可對(duì)任何病毒進(jìn)行定量，病毒載量的測(cè)定也是評(píng)估與某一食品相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)并在技術(shù)或流行病學(xué)層面驗(yàn)證預(yù)防措施有效性的先決條件。Coudray-Meunier等[61]采用dPCR和qPCR兩種方法對(duì)萵苣(L.)和水樣中的甲型肝炎病毒和諾如病毒進(jìn)行了定量。此外，有研究報(bào)道dPCR還可用于檢測(cè)和鑒定人體血液中的寄生蟲[62]。

3.4 dPCR在農(nóng)業(yè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

農(nóng)業(yè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)兩個(gè)領(lǐng)域的共同點(diǎn)是都包括廣泛的目標(biāo)生物體和復(fù)雜基質(zhì)，其中抑制物的存在對(duì)監(jiān)測(cè)則是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)[63,64]。隨著監(jiān)管機(jī)構(gòu)將風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)由定性檢測(cè)改為定量檢測(cè)，對(duì)動(dòng)植物病原體的定量變得愈發(fā)重要。早期多采用qPCR方法對(duì)糞便污染指示細(xì)菌、植物、動(dòng)物、人類病原體和入侵物種進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)水質(zhì)監(jiān)測(cè)和微生物來(lái)源的識(shí)別[63,65~67]。由于植物材料、土壤和廢水均是具有高抑制劑的基質(zhì)，所以通過(guò)qPCR進(jìn)行檢測(cè)和定量植物病原體的可能性極低，而且難以進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，從而極易導(dǎo)致檢測(cè)分析結(jié)果產(chǎn)生偏差。dPCR可解決以上存在問(wèn)題，實(shí)踐證明了其在糞便來(lái)源鑒定、檢測(cè)水樣致病性和物種入侵方面的適用性[44,65,68,69]。

3.5 dPCR在基因編輯領(lǐng)域的應(yīng)用

基因編輯是近年來(lái)一個(gè)重大的技術(shù)突破，該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因功能研究、人類疾病治療、物種改良等多個(gè)方面。定性及精確定量評(píng)估基因編輯實(shí)驗(yàn)是否成功仍是一大難點(diǎn)。在已知編輯背景信息的情況下，基因編輯頻率數(shù)字PCR (gene-editing frequency digital PCR, GEF-dPCR)利用兩個(gè)不同標(biāo)記的探針，同時(shí)對(duì)給定樣本中編輯的和野生型等位基因進(jìn)行定量，該方法可與定點(diǎn)測(cè)序結(jié)果相互驗(yàn)證[70]。dPCR最早是應(yīng)用在對(duì)人類細(xì)胞系基因組編輯效率進(jìn)行檢測(cè)[71,72]；在植物上，首先通過(guò)dPCR對(duì)CRISPR轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行高通量篩選，然后根據(jù)篩選結(jié)果，用限制性內(nèi)切酶消化/PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)檢測(cè)數(shù)值相對(duì)較高的植株進(jìn)一步分析[73,74]。由于基因編輯作物已經(jīng)推向市場(chǎng)，歐盟將基因編輯作物監(jiān)管等同于先前轉(zhuǎn)基因作物[75~77]，對(duì)其檢測(cè)可借鑒dPCR對(duì)編輯效率檢測(cè)的經(jīng)驗(yàn)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因編輯轉(zhuǎn)基因作物含量的定量檢測(cè)。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

相對(duì)于此前的核酸定量方法，dPCR達(dá)到了前所未有的靈敏度、特異性和精確性，尤其在復(fù)雜基質(zhì)及痕量樣品檢測(cè)方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，其為分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、微生物和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域的研究提供了全新的技術(shù)手段和思路。采用dPCR對(duì)早期世代轉(zhuǎn)基因植株外源基因拷貝數(shù)及合子性進(jìn)行鑒定，為轉(zhuǎn)基因優(yōu)異轉(zhuǎn)化體的創(chuàng)制帶來(lái)了極大便利，縮短了篩選進(jìn)程，提高了篩選效率。此外，dPCR技術(shù)為多個(gè)專業(yè)領(lǐng)域檢測(cè)限和閾值設(shè)定提供了新的度量標(biāo)尺。對(duì)低含量轉(zhuǎn)基因樣品的精準(zhǔn)定量檢測(cè)可為我國(guó)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的制定及相關(guān)法規(guī)的出臺(tái)提供理論與技術(shù)支持。

dPCR技術(shù)還可與NGS、質(zhì)譜等多種技術(shù)相結(jié)合。傳統(tǒng)PCR方法雖可完成對(duì)靶標(biāo)序列的富集，但其難以達(dá)到與現(xiàn)有測(cè)序儀器處理量相匹配的水平，ddPCR因其高度的特異性和敏感性，可實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜目標(biāo)序列的大規(guī)模平行單重?cái)U(kuò)增，通過(guò)與NGS技術(shù)結(jié)合，即可對(duì)人類基因組的特定位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)測(cè)序，最大限度的提高NGS基于群體的遺傳變異研究的效率，可幫助研究人員探索復(fù)雜的遺傳景觀，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證新的疾病關(guān)聯(lián)，預(yù)期可開啟一個(gè)新的分子診斷時(shí)代。因此，通過(guò)dPCR技術(shù)的不斷發(fā)展完善，其適用的范圍將逐漸擴(kuò)大，與其他檢測(cè)技術(shù)的結(jié)合將更為緊密，期望其在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用方面發(fā)揮更大的作用。

雖然dPCR技術(shù)具有強(qiáng)大的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，但該技術(shù)的廣泛推廣仍存在一定的限制因素：(1)分散技術(shù)，基于液滴和腔室的dPCR系統(tǒng)都會(huì)受到生成與被接收進(jìn)入到分析統(tǒng)計(jì)中反應(yīng)單元數(shù)目的影響。分散生成的數(shù)目越多，檢測(cè)的靈敏度越高，但大多數(shù)分散技術(shù)都有一定的“死區(qū)”，加載到腔室/液滴發(fā)生器中的總樣品會(huì)有少部分殘留，從而形成“死區(qū)”，這部分體積的加大將會(huì)影響對(duì)定量的判斷，增加相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，特別對(duì)極低豐度目標(biāo)影響更大；(2)微滴的準(zhǔn)確區(qū)分，陽(yáng)性/陰性信號(hào)簇正確清晰的聚集讀取對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要。需不斷優(yōu)化反應(yīng)體系，調(diào)整目標(biāo)濃度，以期獲得標(biāo)準(zhǔn)偏差允許范圍內(nèi)的正確結(jié)果；(3)成本，目前市場(chǎng)上dPCR儀器、所需試劑耗材的成本均高于qPCR，有些都為儀器試劑配套使用，這在一定程度上提高了不可控的成本支出，但時(shí)間成本的節(jié)省可有所彌補(bǔ)；(4)技術(shù)更新，dPCR的整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，從制樣–分樣–PCR擴(kuò)增–數(shù)據(jù)分析的每一步都需要技術(shù)的精進(jìn)與使用人員的不斷學(xué)習(xí)。

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Digital PCR and its application in biological detection

Xiujing Feng, Hongmei Yi, Xingxu Ren, Jiali Ren, Jianrong Ge, Fengge Wang

Various derivative technologies based on PCR for nucleic acid detection have emerged with the continuous development and the diverse needs of molecular biology technology. Digital PCR (dPCR) is a nucleic acid detection method for large scale amplification based on a single molecular template, which runs an individual PCR reaction using chambers/wells or droplets. dPCR can be used for absolute quantification for the initial concentration of samples without calibrator and drawing standard curve, showing the characteristics of high sensitivity, specificity, and accuracy. In this review, we introduce the history of technology development, principle, and instrument platform types of digital PCR in detail. Then, we summarize the application of this technology in GMO quantification, disease diagnosis, environment and food supervision. Finally, we describe the application prospect of dPCR, providing a reference for the development and utilization of this technology in the future.

digital PCR; single molecule; absolute quantification

2019-11-18;

2020-03-12

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2017YFD0102001)和轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(編號(hào)：2017ZX08013001)資助[Supported by the National Key Research and Development Program of China (No. 2017YFD0102001), and the National Genetically Modified Organisms Key Breeding Projects of China (No. 2017ZX08013001)]

馮秀晶，博士，研究方向：轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)。E-mail: fengxj187@126.com

易紅梅，博士，副研究員，研究方向：玉米分子鑒定。E-mail: yhmmaize@163.com

馮秀晶和易紅梅為并列第一作者。

王鳳格，博士，研究員，研究方向：玉米分子鑒定。E-mail: gege0106@163.com

10.16288/j.yczz.19-351

2020/4/1 15:26:29

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200401.0935.002.html

(責(zé)任編委: 趙方慶)